Relatório 5 BioSyn

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Universidade de Brasília – Instituto de Ciências Biológicas Disciplina: Biologia Sintética
Professora Responsável: Cíntia Marques Coelho 
Relatório 5 
Título do artigo: A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet
· O título me sugere que os autores irão criar um organismo semi-sintético com mais do que 4 nucleotídeos no genoma
· Fator de Impacto/Revista: 41.577 (2018) / Nature
· Autores principais: 
· Floyd E. Romesberg: É professor do Departamento de Química na Scripps Research, possui graduação em Química pela The Ohio State University e PhD em Química pela Cornell University. Atualmente desenvolve trabalhos na área de Química Biológica e Biofísica, onde tem atuado principalmente com o tema de dinâmica de proteínas e expansão do código genético. É bastante reconhecido por seu trabalho de expansão do alfabeto genético para 6 letras. 
· Ivan R. Corrêa Jr.: Possui graduação em Química pela Universidade Estadual de Campinas com PhD em Química Orgânica pela mesma universidade. Atualmente é pesquisador na New England Biolabs, onde atua principalmente nas áreas de Síntese Orgânica e Química Biológica. 
· Introdução: 
· Justificativa para o trabalho: Compreender o processo evolutivo que levou a utilização de um alfabeto genético de 4 letras, e melhorar esse processo com a expansão desse alfabeto.
· Revisão da literatura: Desde a origem da vida toda informação é codificada em um alfabeto genético constituído de dois pares de bases. Porém in vitro esse alfabeto já foi expandido para incluir muitos pares de bases não naturais. Anterior, já foi desenvolvido pelos próprios autores um par de bases não naturais que é eficientemente replicado por PCR e transcrito in vitro e possui um mecanismo único de replicação já caracterizado. A expansão do alfabeto genético in vivo ainda é difícil e apresenta alguns obstáculos, como: Os nucleotídeos não naturais devem estar disponíveis no interior da célula, as polimerases endógenas devem ser capazes de reconhecer e utilizar esses nucleotídeos não naturais e por fim esses precisam ser estáveis frente as vias metabólicas da célula a fim de manter a integridade genômica. 
· Objetivo do trabalho: Expandir o alfabeto genético em uma célula de tal forma que esse se mantenha estável e capaz de se replicar
· Figura 1 – Antes de ser realizado os experimentos da figura 1, os pesquisadores realizaram uma série de experimentos prévios, cujo os resultados foram adicionados no material suplementar do artigo. Na figura S1 os pesquisadores testaram alguns transportadores de nucleosídeos trifosfatados e utilizaram o ATP marcado com fósforo radioativo como um análogo a um nucleosídeo não natural, dessa forma eles observaram que a proteína PtNTT2 foi a que apresentou melhor capacidade de obter esses nucleosídeos não naturais do meio. Na figura S2 os pesquisadores testaram a estabilidade, no meio, de ambos os nucleosídeos trifosfatados não naturais que eles pretendem utilizar no artigo e observaram que esses não eram estáveis quando na presença de célula bacterianas, de tal forma que eles eram degradados para formas contendo menos fosfatos. Afim de contornar esse problema os pesquisadores utilizaram o composto KPi e observou o efeito desse na estabilidade dos nucleosídeos trifosfatados no meio, e chegaram à conclusão de o KPi reduziu a degradação desses compostos não naturais no meio, esse resultado é apresentado na figura S3. Em S4 os pesquisadores avaliaram se a expressão da PtNTT2 através da indução com IPTG tornaria a célula bacteriana capaz de obter o ATP com a marca radioativa, além disso observaram também se a indução dessa proteína com o IPTG afetaria o crescimento celular, dessa forma os resultados foram que a indução com IPTG foi eficaz em captar o ATP radioativo do meio, porém reduziu o crescimento celular. Por fim, os pesquisadores testaram a estabilidade do ATP radioativo no meio extracelular, quando havia a presença do KPi, e no meio intracelular, quando era expressado o transportador e induzido por IPTG, os resultados podem ser vistos na figura S5 onde pode-se observar que a degradação do ATP radioativo acontecei tanto no ambiente extracelular quanto no ambiente intracelular, a quantidade de ATP radioativo a entrar na célula compensava a quantidade que era degradada no ambiente intracelular. A figura 1A não possui pergunta científica, onde a imagem de cima ilustra a estrutura química dos nucleotídeos não naturais (UBPs) utilizados pelos autores no presente trabalho, e na de baixo uma ilustração da estrutura química dos nucleotídeos naturais G-C. Em minha opinião os autores poderiam ter melhor detalhado como ocorre a interação entre ambos os nucleotídeos não naturais, tendo em vista que as ligações de hidrogênio são mostrada para as bases G-C, porém nenhum esquema é demonstrado para as bases não naturais. As perguntas da figura 1B é: A célula é capaz de obter os nucleosídeos trifosfatados não naturais (d5SICS e dNaM) do meio? Esses permanecem estáveis na célula? Para responder à pergunta, os autores transformaram células bacterianas de E. coli com um plasmídeo contendo PtNTT2, que é uma proteína transportadora de nucleosídeos trifosfatados que em testes prévios se mostrou eficaz em transportar um nucleosídeo trifosfatado, análogo aos não naturais, para dentro da célula. Após a transformação essas células foram crescidas em meio contendo os nucleosídeos trifosfatados não naturais (d5SICSTP ou dNaMTP) e também KPi, que anteriormente foi visto como importante para aumentar a estabilidade dos nucleosídeos trifosfatados extracelulares. As células eram também induzidas a expressar o plasmídeo contendo a proteína de transporte. Uma alíquota do meio foi retirada para análise em HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Precisão) e também as células que posteriormente foram lisadas e tratadas com o objetivo de submeter o citoplasma celular a mesma técnica. Os resultados do HPLC podem ser visualizados na figura 1B onde podemos observar pelo gráfico que no meio de cultivo predominava as formas trifosfatadas dos nucleosídeos não naturais, além também da forma trifosfatada da adenosina (ATP) que aqui foi usado como controle, apesar disso podemos ver que existem barras correspondente as formas difosfatadas e monofosfatadas dos nucleosídeos não naturais indicando uma degradação desses em decorrência da ação de fosfatases celulares. Já no citoplasma celular as formas predominantes eram as difosfatadas e monofosfatadas de ambos os nucleosídeos não naturais e da adenosina, demonstrando a baixa estabilidade desses no meio intracelular, porém podemos observar que existe uma quantidade significativa e similar de ATP e de nucleosídeo trifosfatados não naturais. Dessa forma conclui-se que a célula é capaz de obter os nucleosídeos não naturais do meio com a proteína de transporte, porém esses não são estáveis no interior da célula, no entanto conseguem se acumular em uma quantidade suficiente para que ocorra uma possível replicação.
· Figura 2 – A figura 2A não possui pergunta científica e apenas representa de forma esquemática os plasmídeos utilizados nos experimentos. O plasmídeo da esquerda foi utilizado no experimento da figura 1 e será utilizado nos experimentos posteriores para expressar a proteína de transporte, além disso ele possui gene de resistência para Streptomicina. Já o plasmídeo da direita é o que contém o par de bases de nucleotídeos não naturais, sendo eles representados por X e Y, além disso contém também um gene de resistência a Ampicilina. A figura 2B também não possui pergunta científica e apenas representa de forma esquemática a estratégia utilizada para a construção do plasmídeo pINF (o plasmídeo da direita na figura 2A). Essa estratégia consiste em sintetizar uma fita de DNA em fase sólida, esse fragmento contêm um nucleotídeo não natural (X:dNaM) e regiões de homologia a um plasmídeo pUC19, posteriormente a fita complementar é gerada através de PCR, contendo os nucleotídeos não naturais, dXTP e dY’TP:dTPT3 (análogo ao nucleotídeo dYTP:d5SICS). É realizadauma PCR, com primers para a região de homologia do plasmídeo com o objetivo de gerar um intermediário linear que será então adicionado juntamente com o fragmento dupla fita sintetizado e então uma PCR, novamente contendo os nucleotídeos não naturais, será realizada para a circularização desse plasmídeo, tendo em vista que as pontas do fragmento servirão como primers para a replicação. Por fim o plasmídeo linearizado é transformado em bactéria e essas são crescidas em meio contendo os nucleotídeos não naturais (X e Y), caso haja a replicação do plasmídeo nas células o nucleotídeo Y’ será substituído por seu análogo disponível no meio, o Y. A pergunta científica para a figura 2C é: A presença dos nucleosídeos trifosfatados no meio e o pINF alteram a taxa de crescimento celular? Para testar a seguinte pergunta os pesquisadores cresceram as células contendo o plasmídeo pACS em meio com e sem os nucleosídeos não naturais, além também de usarem ou não a transfecção do plasmídeo pINF. A avaliação do crescimento foi realizada através da quantificação da OD da cultura celular, sendo que quanto maior a OD, mais células há no meio então maior foi o crescimento celular. Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura 2C, porém a figura está péssima e apresenta apenas os pontos, sem que haja curvas traçadas, que poderia representar de forma muito mais adequada o crescimento celular. Além disso, o eixo que representa o tempo começa em 11h, e acredito que os pesquisadores poderiam ter representado os dados desde a hora um. Por fim, tive dificuldade em compreender a figura, tendo em vista que a legenda do gráfico parece estar errada e informando algo contraditório com o que é dito pelos autores ao longo do artigo. Dessa forma é possível destacar que nada pode ser concluído com base nessa figura. A pergunta científica da figura 2D é: Será que a célula é capaz de replicar o plasmídeo contendo o UBP? Para isso os autores transfectaram as células de E. coli pACS (plasmídeo que contêm a proteína transportadora) com plasmídeos pINF e com plasmídeo pUC19, que serviria como controle negativo. Essas células foram crescidas em diferentes circunstâncias, sendo elas: indução ou não com IPTG e presença ou não dos nucleotídeos não naturais no meio. Após algum tempo, os pesquisadores recuperaram os plasmídeos dessas células, digeriram e defosforilaram, após isso submeteram esses plasmídeos a uma análise de LC-MS/MS (Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometrias de Massas em Tandem). Os resultados podem ser observados na figura 2D, onde é possível observar que as linhas no gráfico correspondente a cada tratamento estão todas sobrepostas para os nucleosídeos A, T, C e G como esperado, além disso os picos desse são maiores indicando maior quantidade. Porém para o tratamento induzido com IPTG e crescido no meio com nucleosídeos trifosfatados não naturais há um pequeno pico correspondente ao d5SICS, esse pico não aparece em nenhum outro tratamento. Isso indica que essas células foram capazes de replicar o plasmídeo pINF, pois conseguiram substituir o análogo Y’ do plasmídeo transfectado, pelo Y, que estava disponível no meio e que agora é detectado pela espectrometria de massa. Em minha opinião, os autores também poderiam ter demonstrado na figura um pico correspondente com o nucleosído dNaM. A pergunta científica do experimento 2E e 2F é: O UBP é capaz de ser retido no plasmídeo? O experimento 2D demonstrou que o pINF é replicável nas células de tal forma que o nucleosídeo não natural pode ser detectado, isso é um indicativo de que esse UBP pode ser retido no plasmídeo, porém para testar e confirmar esse pensamentos os autores extraíram novamente o plasmídeo das células crescidas nas mesmas condições do experimento passado e realizaram uma PCR, para a região específica onde deveria haver a UBP, contendo dessa vez, disponível para a reação de PCR, o d5SICS e dNaM biotinilado. Caso o UBP tenha sido replicado e retido no plasmídeo pINF, esse será capaz de receber o nucleosídeo biotinilado na reação de PCR, porém caso a UBP tenha sido removida do plasmídeo por alguma mecanismo de correção da célula, então a reação de PCR não será capaz de adicionar os nucleosídeos trifosfatados não naturais no fragmento replicado, e esse será um fragmento contendo apenas as 4 letras comuns. Os produtos da reação de PCR foram submetidos a um streptavidin gel shift assay, que consiste em utilizar a streptavidina, que reage com a biotina, formando um complexo e produzindo um desvio observável no gel de eletroforese. Os resultados podem ser visualizados na figura 2E, onde é possível visualizar que o único poço que apresentou desvio foi o tratamento onde ocorreu a indução por IPTG e crescimento em meio contendo os nucleosídeos trifosfatados não naturais. Os tratamentos com pUC19 serviram como controle negativo, da mesma forma, o poço que não continha streptavidina (SA), também foi controle negativo. Ao meu ver, acredito que tenha faltado aos autores demonstrar a estabilidade do fragmento de DNA plasmidial quando era incorporada a base contendo a marcação com a biotina, mesmo que esse composto seja pequeno e já relatado não gerar instabilidade em ácidos nucleicos ou proteínas. No experimento 2F, os autores novamente extraíram o plasmídeo pINF das bactérias que foram submetidas as diferentes condições, já apresentadas nos experimentos passados. Esses plasmídeos foram submetidos a uma PCR, para a região específica onde deveria haver a UBP, seguindo os mesmos princípios de retenção ou não do experimento passado, porém agora essa PCR continha o d5SICS e o dNaM. Os produtos da PCR foram sequenciados pelo método de Sanger e o resultado pode ser visto na figura 2F, onde podemos observar que o tratamento que foi induzido com IPTG e que cresceu no meio contendo os nucleosídeos trifosfatados apresentou uma parada repentina no sequenciamento, correspondente a região da UBP, por outro lado todos os outros tratamentos não apresentaram a mesma parada repentina. A conclusão de ambos os experimentos 2E e 2F corroboram com a conclusão do experimento 2D e demonstra que quando há a indução da proteína transportadora em bactérias crescendo no meio com nucleosídeos trifosfatados não naturais, essas são capazes de replicar o plasmídeo e reter o UBP nas cópias, por pelo menos 15 horas, que foi o tempo testado pelos autores. 
· Figura 3 – As perguntas científicas da figura 3 é: Por quanto tempo a retenção da UBP no DNA plasmidial dura? A UBP não é removida pelos mecanismos de reparo da célula? Para testar essas perguntas, os autores realizaram novamente os mesmos experimentos das figuras passadas utilizando as células transfectadas e induzidas que cresciam em meio contendo ambos os nucleosídeos trifosfatados não naturais. Porém dessa vez os autores monitoraram a curva de crescimento, a retenção da UBP no DNA plasmidial e a degradação do nucleosídeos não naturais ao longo de um período de 6 dias, dessa forma seria possível avaliar a fase estacionária de crescimento das bactérias. Os resultados podem ser visualizados na figura 3, onde é possível observar as diferentes curvas representando cada experimento. É importante notar que a degradação total de ambos os nucleosídeos trifosfatados não naturais no meio ocorre nas primeiras 50h, já a retenção da UBP no DNA plasmidial se mantém durante as primeiras horas, correspondente na curva de crescimento a fase log, porém a medida que ocorre a redução dos nucleosídeos trifosfatados no meio, essa retenção começa a diminuir drasticamente, essa diminuição corresponde a fase estacionária na curva de crescimento. Com esses dados é possível concluir que a UBP se mantém no DNA apenas durante a fase log quando os nucleosídeos trifosfatados estão disponíveis para que sejam incorporados durante a replicação, portanto a UBP não é removida por mecanismos de reparo de DNA, porém há medida que esses começam a faltar, a célula por meio de mismatching substituí-os por nucleotídeos naturais. 
· Conclusão: Os autores concluem que a proteína de transportePtNTT2 é eficaz em transportar os nucleosídeos não naturais para dentro da célula, que a célula é capaz de replicar essa UBP e que essa é retida no DNA plasmidial enquanto houver disponibilidade de nucleosídeos não naturais no meio, tendo em vista que apenas erros de pareamento é capaz de remover essa UBP do DNA, já que ela é estável frente aos mecanismos de reparo da célula. Tendo isso em vista, os experimentos realizados e todos os dados obtidos, eu concordo com essas conclusões dos autores, porém reitero que a figura 2C do artigo é de péssima qualidade e difícil de ser compreendida, dessa forma a única conclusão dada pelos autores na qual eu discordo é a de que a UBP e a presença dos nucleosídeos não naturais no meio não interfere significativamente no crescimento celular. Ainda assim acredito que uma grande falta no artigo é a explicação de como ocorre o pareamento entre ambos os nucleotídeos não naturais, tendo em vista que isso é mal explicado pelos autores e põe em xeque todos os experimentos realizados pelos mesmos. Por fim, eu discordo do título do artigo, pois acredito que ele transmita a ideia de que os pesquisadores irão criar um organismo semi-sintético com um genoma contendo vários nucleotídeos não naturais, porém o que de fato ocorre é que apenas um DNA plasmidial contendo apenas 1 par de bases não naturais é inserido em uma célula bacteriana. Em minha opinião esse evento não configura como expansão do alfabeto genético.