Relatório 2 BioSyn

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Universidade de Brasília – Instituto de Ciências Biológicas Disciplina: Biologia Sintética
Professora Responsável: Cíntia Marques Coelho 
Relatório 2 
· Título do artigo: Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome
· O título me sugere que os autores irão sintetizar um cromossomo eucariótico que foi desenhado, e que esse será funcional. 
· Fator de Impacto/Revista: 37.205 (2016) / Science
· Autores principais: 
· Srinivasan Chandrasegaran: Possui PhD pela George Town University e atualmente é professor de Engenharia Biomédica pela Johns Hopkins Bloombery School of Public Health. Foi um dos pioneiros na técnica de edição genômica. É notavelmente reconhecido por seu trabalho com nucleasse do tipo Zinc Finger capazes de clivar o DNA dupla fita. 
· Jef D. Boeke: Possui graduação em Bioquímica pela Bowdoin College e PhD em Biologia Molecular Rockefeller University onde trabalhou com a genética de fagos filamentosos. É reconhecido pelos seus trabalhos pioneiros na biologia molecular dos mecanismos de transposição do DNA. Foi Boeke que cunhou o termo retrotransposon para se referir aos elementos transponíveis que se utilizavam da retrotrancriptase reversa. É membro da Academia Nacional de Ciências. 
· Joel S. Bader: Possui graduação em Bioquímica pela Lehigh University e PhD em Química Teórica pela University of California. Atualmente é professor associado de Ciências da Computação e Engenharia Biomédica na Johns Hopkins Bloombery School of Public Health e atua nas áreas de Biologia Computacional, Biologia de Sistemas e Biologia Sintética. 
· Introdução: 
· Justificativa para o trabalho: Entender quais genes não-essenciais são simultaneamente dispensáveis 
· Revisão da literatura: A Saccharomyces cerevisiae possui 16 cromossomos, que ao todo possuem aproximadamente 6000 genes codificadores, desses aproximadamente 5000 foram reportados como não-essenciais em um caráter individual. Muitos estudos mapearam interações letais em genes knockout, porém os métodos utilizados nunca escalonavam bem para uma combinação de 3 ou mais genes deletados. Além disso síntese de genomas bacterianos e virais foi reportado recentemente e um consórcio de cientistas está trabalhando com o intuito de sintetizar o primeiro genoma eucariótico. 
· Objetivo do trabalho: Criar um cromossomo sintético, funcional, de levedura com todos os genes não-essenciais flanqueados por sítios loxPsym para induzir a redução genômica.
· Figura 1 – Essa figura não possui uma pergunta científica, pois ela apenas representa uma parte significativa do mapa da estratégia de design dos autores. O mapa completo da estratégia de design pode ser visualizado na figura S1 do material suplementar. Todo o cromossomo 3 da levedura foi desenhado de tal forma que os códons de terminação (TAG) foram substituídos por códons TAA. Além disso os sítios loxPsym foram adicionados de tal forma que flanqueassem os genes não-essenciais com a finalidade de permitir estudos posteriores do uso da técnica de Scrambleing, que consiste em uma indução da recombinação e eliminação dos genes não-essenciais do genoma. Outras modificações no design foram as tags específicas do DNA sintéticas e as deleções de regiões subteloméricas, transposons, introns e RNAs de transferência.
· Figura 2 – Essa figura também não possui uma pergunta científica, pois ela apenas representa a estratégia de montagem do cromossomo da levedura. Esse processo foi divido pelos autores em 3 passos sendo eles: O passo 1) que consistiu na montagem dos oligonucleotídeos, que possuíam regiões de sobreposição, em blocos de construção de 750bp, essa montagem ocorreu através de PCR sem a utilização de primers, tendo em vista que os próprios oligonucleotídeos com suas sobreposições serviram de iniciadores para a montagem completa. O blocos de 750bp foram sequenciados para a verificação de erros e posteriormente esses blocos foram clonados em um vetor e transformados em E.coli, em seguida esses blocos foram extraídos e seguiram para o próximo passo. No passo 2), três diferentes metodologias foram utilizadas para a montagem dos blocos, de tal forma que todos os blocos correspondentes ao lado esquerdo do cromossomo foram montados através de recombinação in vitro (Montagem de Gibson) ou através do método USER (Figura suplementar S4), que consiste na utilização de enzimas de restrição que reconhecem um sítio e cortam em uma região a frente deste sítio excisando assim o próprio sítio de reconhecimento da enzima de restrição e permitindo aos pesquisadores saber exatamente o tamanho e a sequência que está sendo excisada, essa enzima de restrição foi utilizada nos blocos de 750bp como também no vetor, posteriormente foi realizado um PCR com a finalidade de montar os minichunks de 2-4kb que seriam clonados em E.coli. Já os fragmentos correspondentes do lado direito do cromossomo foram montados através de recombinação in vitro ou através de recombinação in vivo em levedura. No passo 3) ocorreu a substituição do cromossomo 3 da levedura pelos minichunks específicos, essa substituição ocorreu a pequenos passos de tal forma que eram introduzidos minichunks que por homologia se recombinavam com o cromossomo e forneciam uma marca de seletividade ao genoma, dessa forma as colônias no qual a recombinação ocorreu poderiam ser selecionados em meio seletivo, após isso uma nova rodada de substituição ocorria e o primeiro minichunk era correspondente ao último da rodada anterior, com a finalidade de que quando ocorresse uma recombinação a antiga marca de seleção (LEU2) fosse removida e uma nova marca de seleção (URA3) era adicionada. Essa técnica foi repetida em vários passos até a completa substituição do cromossomo 3. 
 
· Figura 3 – A pergunta científica da figura 3A é: Será que o cromossomo sintético realmente está nas colônias synIII? Para responder à pergunta foi realizado um PCRTag dos gDNA da levedura wild-type (que serviu como controle negativo) e da levedura synIII. Como resultado pode-se observar que no PCRTag do WT foram encontrados todos os tags esperados da sequência selvagem, mas nenhum tag do wild-type foi encontrado no synIII (que aqui foi o controle negativo do WT), já no PCRTag do synIII podemos ver que todos os tags do cromossomo sintético foram encontrados, e nenhum tag sintético foi encontrado no controle negativo (o WT), para uma perspectiva maior podemos analisar a figura S5 do material suplementar, traz o mesmo resultado para um número maior de tags do DNA sintético, e a figura S6, onde foi utilizada as tags do DNA natural. A pergunta científica da figura 3B é: Será que o cromossomo 3 presente no synIII possui o tamanho esperado? Os pesquisadores realizaram uma análise cariotípica que consiste em uma eletroforese FIGE para a levedura WT (controle negativo), para o intermediário de montagem synIIIL e para o synIII final. Como resultado pode-se observar que o tamanho do cromossomo 3 do synIII foi menor que o do cromossomo 3 do synIIIL que por sua vez foi menor que o cromossomo 3 do WT, corroborando assim com as expectativas dos autores. De forma mais completa podemos observar a figura S8 que mostra o cariótipo completo realizado para o WT, a cepa inicial, todos os intermediários de montagem e a cepa final contendo o synIII. As setinhas representam rearranjos inesperados na cepa inicial e um rearranjo inesperado que ocorreu durante a substituição do cromossomo 3, porém esses rearranjos foram consertados pelos pesquisadores através do cruzamento entre um dos intermediários de montagem com a cepa WT, que produziu um organismo sem problemas no rearranjo, a partir daí a substituição do cromossomo 3 prosseguiu. A pergunta científica da figura 3C é: Houve variação no fenótipo da synIII? Para responder à pergunta os cientistas plaquearam, as células do synIII, do intermediário synIIIL e do WT (que serviu como controle negativo), em diferentes temperaturas, pHs, e meios e observaram que não houveram diferenças fenotípicas das colônias em nenhuma das células testadas e em nenhuma das variáveis testadas,na figura S11 podemos ver de forma completa o crescimento das culturas em diferentes meios, pHs e temperaturas constatando de fato que não houve variação fenotípica. Além disso os pesquisadores realizaram testes de crescimento com as células WT e com as células contendo o synIII em diferentes meios (YPD e SC-URA) e observaram que não houve diferença significativa nas curvas de crescimento entre as células, esse resultado pode ser verificado na figura S10.
· Figura 4 – A pergunta científica da figura 4A é: Será que o cromossomo synIII se mantém íntegro antes do Scrambleing? Com a finalidade de responder à pergunta foram feitas diversas diluições em séries, das células contendo o cromossomo 3 sintético, foram feitas até que depois de 125 gerações essas células foram plaqueadas e então uma colônia foi selecionada em crescida em meio líquido para posteriormente ter seu DNA analisado por meio de PCRTag. O resultado, de acordo com os autores, é que o cromossomo 3 apresentou-se íntegro, não tendo perda de nenhum gene não-essencial ao longo de todas as gerações mitóticas, contudo não há figuras no artigo tão pouco no material suplementar revelando a PCRTag desse experimento. As perguntas da figura 4B são: Será que o cromossomo synIII é estável e qual é a taxa de perda do cromossomo? Para avaliar os pesquisadores fizeram ensaios de “a-like faker” aonde as células contendo o cromossomo synIII (que possui o locus MATα), e células WT (que serviram como controle negativo) eram expostas a outras cepas contendo o locus MATα. O cruzamento entre cepas com locus MATα não ocorre, logo caso ocorresse cruzamentos nesse ensaio, a explicação seria que as células com o synIII estariam perdendo esse cromossomo, demonstrando sua instabilidade. Como resultado os pesquisadores observaram que a taxa de perda do cromossomo III nas células synIII não diferiu significativamente da taxa de perda do cromossomo III nas células WT, dessa forma eles concluíram que o cromossomo synIII era estável. Como na figura anterior, nenhuma figura foi apresentada demonstrando o resultado do experimento em si, apenas uma tabela (4B) com os valores da taxa de perda do cromossomo. Por fim, a pergunta da figura 4C foi: Será que a técnica de Scrambleing foi eficaz? Para testar a ideia os pesquisadores primeiramente utilizaram células haploides contendo o cromossomo synIII e células haploides WT, porém o observado foi que as células haploides contendo o synIII que sofriam Scrambleing não eram viáveis devido a grande redução de genes essenciais do genoma, esse resultado pode ser visualizado na figura S16A, onde as células synIII que foram induzidas no processo de Scrambleing formavam menos colônias, no plaqueamento, em comparação com as células WT. Na figura S16B pode-se observar que a OD das células synIII induzidas foi significativamente inferior à do WT e das células synIII não induzidas. Dessa forma os pesquisadores resolveram utilizar cepas diploides contendo o cromossomo synIII e um cromossomo 3 WT (synIII/III) e usaram como controle negativo as células diploides WT contendo ambos os locus MATa/MATα (III/III). Um plasmídeo contendo Cre-EBD foi introduzido nessas células e elas posteriormente foram induzidas com estradiol para que a recombinação ocorresse. Como o locus de MATα, no symIII, era flanqueado por sítios loxPsym, os pesquisadores esperavam que se o Scrambleing fosse eficaz, o sítio MATα seria removido do genoma, sobrando assim apenas o sítio MATa do cromossomo WT, dessa forma a célula contendo o synIII que não era capaz de realizar cruzamentos até então, passaria a realizar cruzamentos com o fenótipo de “a-matter”. Como resultado os pesquisadores observaram que 45% das células contendo o synIII e induzidas com o estradiol passaram a se comportar como “a-matter” enquanto que no WT nenhuma apresentou esse comportamento, indicando assim que o processo de recombinação do Scrambleing foi eficaz em 45% dessas células. Após isso os pesquisadores realizaram PCRTag, utilizando os tags do cromossomo sintético, nas células que apresentaram o “a-matter” e o resultado pode ser visto na figura S18B, aonde os quadrados vermelhos representam a ausência das tags, indicando assim quais os genes que foram deletados no processo de Scrambleing. 
· Conclusão: Os autores concluem que a síntese do cromossomo synIII representa um grande passo para os objetivos futuros de sintetizar o genoma completo de um organismo eucariótico e que esse objetivo irá permitir o estudo de muitas questões evolutivas e mecanismos de estrutura e função dos genomas. Além disso os pesquisadores concluem que as modificações realizadas no cromossomo 3 não interferiram na taxa de crescimento, transcrição e adaptação das células. Eu concordo com os autores no ponto de que os processos citados não foram afetados, porém discordo a respeito das afirmações ditas de que o cromossomo foi estável e íntegro, tendo em vista que poucas evidências e figuras foram apresentadas nesse contexto. Por fim, eu concordo com o título do artigo tendo em vista que ele sugere, de maneira clara e enxuta, exatamente o que foi realizado no artigo.