Relatório 1 BioSyn

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Universidade de Brasília – Instituto de Ciências Biológicas Disciplina: Biologia Sintética
Professora Responsável: Cíntia Marques Coelho 
Relatório 1 
· Título do artigo: Design and synthesis of a minimal bacterial genome
· O título me sugere que os autores irão fazer o design e sintetizar um genoma bacteriano reduzido 
· Fator de Impacto/Revista: 37.205 (2016) / Science
· Autor principal: J. Craig Venter
· Participou da guerra do Vietnã, onde trabalhou na ala médica e tomou gosto por Medicina. Ao retornar da guerra começou uma graduação em Medicina, mas logo mudou para o curso de Bioquímica, e fez seu PhD em Fisiologia e Farmacologia. Participou do Projeto Genoma Humano aonde desenvolveu a técnica de sequenciamento de “shot gun”. Mais recentemente Venter tem trabalhado com genomas sintéticos. 
· Introdução: 
· Justificativa para o trabalho: Entender a função biológica e molecular por trás de cada gene que é essencial para a vida.
· Revisão da literatura: Uma comparação entre os dois primeiros genomas sequenciados de Haemophilus influenzae e Mycoplasma genitalium revelou um total de 216 genes em comuns, que foram categorizados como os genes mínimos para a vida. Utilizando a técnica de mutagênese global por transposons os autores categorizaram um total de 375 genes essenciais na M. genitalium. Também já foram realizados estudos de redução dos genomas de Escherichia coli e Bacillus subtilis através de deleções sequencias. Para a abordagem do trabalho, os autores desenvolveram previamente técnicas necessárias para o estudo de um genoma mínimo, essas técnicas consistem na síntese química, montagem, clonagem e transplante de genomas sintéticos criando assim células sintéticas.
· Objetivo do trabalho: Criar um genoma mínimo bacteriano eliminando os genes não-essenciais para crescimento em condições de laboratório. 
· Figura 1 – Essa figura não possui uma pergunta científica pois apenas demonstra uma estratégia utilizada para o desenvolvimento do trabalho. Aqui os pesquisadores utilizaram o genoma syn1.0 como base para realizar o design dos fragmentos do genoma mínimo, esse design foi realizado in silico, e consistiu na análise do genoma para definir quais genes seriam retirados e quais deveriam permanecer. Após o design, os oligonucleotídeos eram sintetizados, montados e clonados para posteriormente serem extraídos e transplantados em outro organismo receptor. A viabilidade do organismo receptor era então testada para comprovar a eficácia do método. Em caso de falhas, os pesquisadores retornavam novamente ao design do genoma mínimo. Esse ciclo de design, construção e testes foi nomeado de DBT.
· Figura 2 – Essa figura também não possui uma pergunta científica, pois apenas demonstra a estratégia utilizada para as montagens dos cassettes. Os oligonucleotídeos foram desenhados de tal forma que possuíssem sobreposições uns aos outros, esses oligonucleotídeos foram então misturados e submetidos a PCR na presença de primers específicos e a montagem dos fragmentos de 1,4kbp foi realizada através desse PCR, os resultados dessa montagem pode ser observado na figura S12 A do material suplementar onde podemos observar uma eletroforese com as 24 bandas correspondentes ao peso esperado. Os produtos da PCR foram então incubados na presença de endonuclease e exonuclease, que reconhecem erros de pareamento e degradam essa região do DNA, esse processo foi realizado para a verificação de erros na montagem, posteriormente os produtos foram submetidos novamente a outra PCR com a finalidade de refazer as regiões degradas pela correção de erros e de amplificar esses fragmentos, os resultados dessa segunda PCR pode ser observado na figura S12 B do material suplementar onde observamos, na eletroforese, as 24 bandas com o peso esperado. Para o próximo passo os fragmentos de 1,4kbp foram montados através de recombinação in vitro para formar os fragmentos de 7kbp que foram clonados em E. coli e posteriormente extraídos e sequenciados para a verificação de erros e também se a montagem foi bem-sucedida. Por fim os fragmentos de 7kbp foram clonados em levedura para a recombinação in vivo com a finalidade de montar os fragmentos de 1/8 do genoma. Antes de serem montados em genomas completos, os fragmentos de 1/8 do genoma foram montados em genomas híbridos de 7/8 com moléculas do Syn1.0 para testar a viabilidade de cada fragmento. Para facilitar a técnica, foram inseridos sítios Not1 [Figura S9 do suplementar A e B], por meio da técnica TREC (explicada na descrição da figura 3), no genoma Syn1.0. Como resultado da inserção dos sítios Not1 podemos observar na figura S9 C) uma eletroforese após a digestão do genoma com a enzima de restrição pra Not1, ali observamos uma banda correspondente a 7/8 do genoma e outra correspondente a 1/8, na figura de baixo podemos observar todos os fragmentos 1/8, após serem recuperados da digestão com Not1, com suas bandas de pesos esperados. Posteriormente foi aplicada a técnica RMCE, onde um cassette com extremidades iguais as extremidades da região alvo do genoma iria promover a recombinação homóloga entre essas regiões de tal forma a excisar a região alvo, posteriormente um plasmídeo doador contendo o fragmento 1/8 iria através do mesmo processo remover o core inserido pelo cassette e introduzir a região do fragmento 1/8, criando assim um genoma 7/8 syn1.0 e 1/8 das moléculas provenientes do design, em caso de viabilidade o fragmento 1/8 seria excisado dos 7/8 por meio das enzimas de restrição no sítio Not1. Esses fragmentos podem então serem amplificados através de RCA (Amplificação por círculo rolante), os resultados da amplificação por RCA podem ser vistos na figura S14 aonde dois kits foram utilizados para a técnica (A e B) ambos apresentando o resultado das bandas com o peso esperado. Após isso os fragmentos são clonados em levedura para a montagem do genoma completo, esse resultado pode ser visualizado na figura S15, aonde o DNA extraído da levedura foi submetido a um plug de agarose, digerido com enzima AscI para a linearização e posteriormente analisado em FIGE, a mesma técnica foi feita em levedura que não continha o genoma sintético como controle negativo, pode-se visualizar que na linha 2 correspondente a levedura com o genoma reduzido apresentou uma banda na região do peso esperado, enquanto que no controle não havia essa banda. 
· Figura 3 – A pergunta científica da figura 3 é: Quais genes são essenciais e quais não são, para as funções celulares na bactéria? Para responder essa pergunta os pesquisadores utilizaram-se das células contendo o genoma Syn1.0 e já com deleções nas regiões de enzimas de restrição [provenientes de um trabalho anterior do grupo], e transformaram as células com o transposon Tn5 e com transposases para que esse transposon pudesse ser ativo, porém para evitar possíveis pulos de transposons já presentes no genoma os pesquisadores precisaram deletar essas regiões. Essas deleções foram realizadas pelo método TREC [descrito na figura suplementar S8] que consiste em utilizar um cassete core, contendo extremidades para a região alvo no genoma, aqui no caso as regiões de IS, e genes para produção de galactose e endonuclease. O cassette irá através de recombinação homóloga das extremidades se inserir no genoma e retirar a região alvo, posteriormente a expressão de galactose irá promover a expressão da endonuclease que irá clivar e uma extremidade do cassette promovendo uma quebra da dupla fita que será corrigida por recombinação homóloga das duas sequências das extremidades, já que essas são idênticas, dessa forma a região proveniente do cassette core irá ser retirada do genoma. Após essas deleções, as células contendo o genoma Syn1.0 ΔRE ΔIS foram transformadas com os transposon Tn5, contendo o gene de resistência para puromicina, e com transposases. As células foram então selecionadas em meio com puromicina e tiveram o DNA extraído e analisado através de PCR invertido, que é uma técnica que consiste em induzir a circularização do DNA e utilizar primers para a regiãoconhecida do transposon, dessa forma o produto irá conter a região desconhecida no qual o transposon se inseriu. Para eliminar as células com problema de crescimento, a cultura P0 sofreu quatro passagens até a cultura P4 [figura S2 do complementar]. Para validar ainda mais os resultados os pesquisadores promoveram deleções individuais, por meio de TREC, dos genes ditos como não-essenciais e avaliaram a viabilidade das células de tal forma a constatar se o gene era de fato não-essencial. Os resultados de todos esses procedimentos podem ser analisados em A) onde podemos observar um exemplo da informação providenciada pela mutagênese com transposon Tn5 em 3 genes. O gene menos atingido por transposon foi considerado um gene essencial para a células, os genes muito atingidos na P0 e P4 foram considerados não-essenciais, e os genes muito atingidos na P0, mas não na P4, foram considerados quase-essenciais e relacionados ao crescimento celular. Em B) podemos observar o número de genes do genoma Syn1.0 em cada classe de essencial, não-essencial ou quase-essencial. 
· Figura 4 – Essa figura não possui uma pergunta científica, ela apenas demonstra um mapa do genoma sintético Syn1.0 mostrando quais genes foram mantidos ou deletados em cada passo do método do Syn1.0 até o final do Syn3.0. As grandes setas marrons representam as 8 regiões do genoma flanqueadas por sítios Not1, as setas amarelas representam os genes que foram deletados em todas as abordagens do artigo, da mesma forma as setas azuis representam todos os genes que foram mantidos em todas as abordagens do artigo. Para a criação do Syn2.0 um novo design RGD1.0 foi realizado com base nos dados gerados pela mutagênese com Tn5 no Syn1.0, os fragmentos foram montados e clonados conforme metodologia descrita e testados em genomas de 7/8 com fragmentos do syn1.0, porém foram constatados algumas mutações e um erro no design do fragmento 6, que foi posteriormente consertado. Os fragmentos do RGD1.0 foram então montados no genoma completo, porém não ocorreram células viáveis. Os pesquisadores misturaram então os 8 fragmentos do RGD1.0 com os 8 fragmentos do syn1.0 e geraram diversas combinações de genomas diferentes, umas dessas combinações (RGD2678) produziu células viáveis. Com a finalidade de testarem redundância no genoma, os pesquisadores submeteram o RGD2678 a testes com mutagênese por Tn5 e deleções de genes individuais seguidos por testes de viabilidades e constaram 26 genes que precisaram ser novamente adicionados ao genoma (setas verdades), os fragmentos RGD2.0 1, 3, 4 e 5 foram redesenhados e montados com os fragmentos RGD1.0 2, 6, 7 e 8 porém não produziram células viáveis. Os fragmentos RGD2.0 foram então testados individualmente e no fim foi obtido um genoma completo, contendo os fragmentos RGD2.0 1, 3 e 4, RGD1.0 2, 6, 7 e 8 e Syn1.0 5, que produziu células viáveis, esse genoma foi o Syn2.0. O Syn2.0 foi submetido a testes com mutagênese de Tn5, e passagem de células até a geração P4, e novos genes não-essenciais foram constatados, dessa forma o design RGD3.0 não incluiu esses genes (setas rosas), os fragmentos RGD3.0 foram sintetizados, montados e produziu o genoma completo que foi chamado de Syn3.0. 
· Figura 5 – A pergunta científica da figura foi: Dos genes mantidos no genoma Syn3.0, quantos desses são encontrados homologamente em outros organismos e quais as suas funções? Para responder à pergunta os pesquisadores utilizaram softwares baseados em aprendizagem de máquina e alinhamentos de sequências com a finalidade de encontrar homólogos, dos genes codificadores de proteínas presentes no genoma do Syn3.0, em outros organismos. Esses genes foram classificados em 5 classes baseados em um score feito pelo software e também na funcionalidade do gene, caso conhecida. Como resultado pode-se observar que todas as 5 classes apresentaram homólogos em todas as espécies analisadas, porém algumas classes apresentam mais homólogos do que outras, indicando que esses genes possuem funções universais. As classes com função desconhecida (generic and unknown) foram as que menos apresentam homólogos e podem ser indicativos de uma rápida divergência no genoma dos organismos micoplasmas, ou de péssimos alinhamentos e sequências para esses genes. 
· Tabela 1 – Não existe uma pergunta científica para essa tabela. Ela trás uma informação classificando os genes do genoma Syn1.0 em classes baseadas em suas funções. Além disso ele informa quantos genes dentro das classes funcionais foram mantidos no genoma Syn3.0 e quantos foram retirados. Podemos observar que genes relacionados com funções como Glicólise, replicação, transcrição, tradução foram mantidos enquanto que a grande maioria dos genes com funções desconhecidas foram removidos do genoma. 
· Figura 6 – Essa figura também não possui uma pergunta científica e trás uma informação similar à apresentada na tabela 1. Aqui todos os genes que foram mantidos no genoma Syn3.0, apresentados na tabela 1, são agrupados em 5 grandes grupos baseados na função geral que desempenham.
· Figura 7 – A pergunta científica correspondente é: A morfologia e o crescimento das células Syn3.0 são correspondentes com as das células Syn1.0? Para isso os pesquisadores plaquearam culturas das células Syn1.0 e Syn3.0 e observaram a morfologia das colônias formadas e puderam observar em A) que a colônia das células Syn3.0 apresentou um tamanho reduzido comparado com a colônia das células Syn1.0 o que indica uma menor taxa de crescimento. Para quantificar a taxa de crescimento, foi realizado um RFU (relative fluorescent units), que consiste em incubar o lisado celular com um reagente fluorescente e quantificar ao longo do tempo o acúmulo de DNA dupla fita através da quantidade de fluorescência emitida. Em B) podemos observar que a reta correspondente ao RFU da Syn1.0 apresentou maior acúmulo de DNA, em menos tempo, em comparação com a Syn3.0 indicando que o crescimento de Syn3.0 de fato era menos acelerado. Para avaliar a morfologia das células foi utilizado técnicas de microscopia de luz e microscopia de varredura. Em C) podemos observar a esquerda que a morfologia das células Syn1.0 eram pontuais enquanto em a direita as células Syn3.0 apresentaram estruturas filamentos e vesículas que não eram esperadas. Em D) na figura da esquerda podemos ver que a morfologia da Syn1.0 foi bastante similar com a figura do meio correspondente a morfologia da Syn3.0, porém na figura da direita podemos ver que o agregado de células Syn3.0 apresentou morfologias variadas. 
· Figura 8 – A pergunta científica da figura é: Será que a ordem dos genes influencia na viabilidade celular? Para responder tal pergunta os pesquisadores agruparam, durante o design dos cassettes para um novo genoma Syn3.0, os genes classificados em uma mesma função de forma contínua. Esse design foi realizado no segmento 2 e um mapa desse segmento pode ser visualizado na figura. A esquerda temos o mapa do segmento 2 do Syn1.0 e os genes coloridos foram mantidos no segmento 2 do Syn3.0 (que está a direita), a cor aqui está classificando a função do gene, as regiões em cinza no Syn1.0 foram as regiões deletadas, as linhas pretas são as regiões intergênicas que foram mantidas no genoma Syn3.0. Essa nova célula Syn3.0 foi viável e apresentou um crescimento similar a das células Syn1.0 de tal forma que a ordem dos genes não foi um grande influenciador na viabilidade e crescimento celular. 
· Figura 9 - A pergunta científica da figura é: Alterações em genes essenciais podem prover viabilidade para a vida demonstrando uma plasticidade genômica? Para testar essa hipótese os pesquisadores realizaram o design dos cassettes de uma nova célula Syn3.0 e incluíram algumas modificações em alguns genes essenciais, como o gene que codifica para o rRNA 16s e alguns genes tiveram seus códons codificadores de aminoácidos alterados. Em A) podemos ver a estrutura secundária do rRNA do Syn3.0 aonde as modificações feitas são evidenciadas, em B) podemos ver uma tabela mostrando as modificações realizadasnos códons de alguns genes. Como resultado as modificações apresentadas na figura resultaram em células viáveis, porém outras combinações de modificações no gene do rRNA que foram testadas resultou em células não viáveis. 
· Tabela 2 - Essa tabela não possui uma pergunta científica, sendo sua função a de resumir todas as estratégias e montagens que foram realizadas pelos pesquisadores até chegar de fato a montagem bem-sucedida do Syn3.0. 
· Conclusão: O genoma foi desenhado e sintetizado de forma reduzida produzindo uma célula sintética viável, porém com o crescimento e tamanho extremamente reduzido e alguns aspectos do fenótipo não esperados. Algumas modificações e reorganização do genoma foram feitos durante o design e não foram suficientes para tornar a célula inviável, permitindo assim constatar alguns genes essenciais para célula e seu papel, ainda assim muitos genes remanescentes no genoma Syn3.0 ainda possuem papel desconhecido e entender a função desses genes é de suma-importância para compreender a genética essencial para a vida. Tendo tudo isso em vista, eu concordo com o título do trabalho já que ele descreve bem tudo o que foi feito durante a pesquisa.