Coprocultura Provas Bioquimicas Para Identificação

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Coprocultura: 
Provas Bioquímicas
para Identificação
Kesia Xisto
Objetivos:
1. Determinar o que é gastroenterite fazendo a distinção 
entre diarreia e disenteria. 
2. Compreender a coleta, transporte e armazenamento. 
3. Entender as principais provas para a identificação das 
enterobactérias de importância clínica.
Coprocultura
➢É o exame bacteriológico das fezes muito utilizado nos 
casos de suspeita de gastroenterite.
Gastroenterite: inflamação do trato gastrointestinal que se 
manifesta através de diarreia ou disenteria, vômitos, dores 
e cólicas abdominais.
Diarreia: aumento do nº de evacuações com a presença
de fezes amolecidas, de consistência pastosa ou até
mesmo líquidas.
Disenteria: é a diarreia com a presença de sangue e
muco.
Coleta, transporte e armazenamento
Período de coleta : Devem ser coletadas no início da fase aguda da
doença, quando os patógenos estão usualmente presentes em maior número
e, preferencialmente, antes da antibioticoterapia.
➢Coletar as fezes e colocar em um frasco contendo o meio para transporte
(Cary-Blair ou salina glicerinada tamponada), fornecido pelo laboratório ,em
quantidade equivalente a uma colher de sobremesa. Preferir sempre as
porções mucosas e sanguinolentas, se a amostra for liquida coletar
aproximadamente 2-3mL.
➢ Fechar bem o frasco e agitar o material.
➢ Se a amostra não for entregue no laboratório em uma hora, conservar em
geladeira a 4ºC, no máximo por um período de 12horas. Marcar o horário da
coleta.
Na falta de meio de transporte utilizar frasco
limpo e seco (fornecido pelo laboratório),
coletar no mínimo 2g de fezes e enviar ao
laboratório (até 3 h após a coleta).
ARMAZENAMENTO NO LABORATÓRIO
• Fezes in natura: encaminhar imediatamente ao laboratório
em temperatura de 2°C a 8°C (com gelo reciclável);
• Fezes em swab: caso não seja possível encaminhar amostras
de fezes in natura no mesmo dia, introduzir o swab nas fezes
colhidas em frasco estéril e acondicionar o swab no meio de
transporte Cary-Blair (viável por até 7 dias em refrigeração).
Para pesquisa de Vibrio cholerae
SWAB FECAL EM CARY-BLAIR 
• Coletar 1 a 2g de fezes em frasco limpo, seco, de boca larga, fornecido pelo laboratório.
• Mergulhar o swab no frasco contendo as fezes. 
• Introduzir o meio de transporte Cary-Blair e transportar em temperatura ambiente entre 24 e 72 
horas após a coleta.
SWAB RETAL EM CARY-BLAIR 
• Introduzir o swab no ânus e fazer movimentos rotativos suaves por alguns segundos;
• Introduzir o meio de transporte Cary-Blair e transportar em temperatura ambiente em até 24h 
após a coleta.
MEIO DE TRANSPORTE
• Cary Blair
Tem como princípio a carência de uma fonte de nitrogênio que
impede a multiplicação de microrganismos. A composição
nutritiva garante a sobrevivência dos microrganismos presentes
na amostra.
COMPOSIÇÃO DO MEIO CARY-BLAIR
Hidrogenofosfato Dissódico1,100g
Tioglicolato de Sódio 1,500g
Cloreto de Sódio 5,000g
Cloreto de Cálcio 0,090g
Ágar 5,600g
Meios de cultura
❖Meios de isolamento 
▪Ágar SS;
▪HE;
▪EMB
❖Meios de identificação
▪TSI
▪Ureia
▪Citrato
▪SIM
▪Indol
▪Fenilalanina
▪Lisina
▪ Ornitina 
❖Meios de enriquecimento
▪ Tetrationato
Principais provas para a identificação das enterobactérias 
de importância clínica
1. Fermentação da glicose
2. Fermentação da lactose e sacarose
3. Motilidade
4. Utilização de citrato
5. Descarboxilação da lisina e ornitina
6. Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S)
7. Produção de gás (CO2)
8. Oxidase
9. Produção de indol
10. Produção de urease
11. Produção de fenilalanina desaminase
▪ Ágar Salmonella Shigella-SS
O Ágar Salmonella Shigella (SS) é um meio de cultura altamente
seletivo para o isolamento de Salmonella spp. e algumas
espécies de Shigella a partir de amostras clínicas e de
alimentos. Os microrganismos Gram positivos e os coliformes
são inibidos por componentes seletivos e a diferenciação dos
microrganismos é obtida através da adição da lactose no meio.
As bactérias fermentadoras formam colônias vermelhas ou rosa
e as não fermentadoras formam colônias incolores.
▪ Ágar Salmonella Shigella-SS
• A elevada concentração de sais biliares e citrato de sódio (8,5g) inibem
todas as Bactérias Gram positivas e muitas Gram negativas;
• Carboidrato: lactose
• Indicador para ácido: vermelho neutro
• Indicador de H2S: citrato férrico
Salmonella spp. Shigella spp.
Bactéria fermentadora de lactose
(vermelha a rosa)
▪ Meio Ágar Entérico Hektoen-HE
O Hektoen Enteric Agar é um meio moderadamente
seletivo para diferenciação de Gram negativos entéricos
utilizado para o isolamento e cultura desses
microrganismos, especialmente para o isolamento de
Shigella e Salmonella provenientes de amostras fecais.
▪ Meio Ágar entérico Hektoen-HE
• A elevada concentração de sais (9g) inibem todas as bactérias Gram 
positivas e muitas Gram negativas;
• Carboidrato: lactose, sacarose
• Indicador para ácido: fucsina ácida e azul de bromotimol
• Indicador de H2S: citrato férrico
Shigella spp. Salmonella spp. Bactéria fermentadora de lactose
(alaranjado a salmão)
Ágar EMB
Ágar E M B (formulação de Holt-Harrise Teague) é um meio para
diferenciação ligeiramente seletivo utilizado para o isolamento e
diferenciação de bacilos entéricos Gram negativos
(Enterobacteriaceae e outros bastonetes Gram-negativos)
provenientes de amostras clínicas).
▪ Ágar EMB
• Apresença de eosina e azul de metileno inibem as bactérias Gram positivas;
• Carboidrato: lactose sacarose
• Indicadores e inibidores: eosina e azul de metileno
Klebsiella spp.
Fermentador de lactose
Escherichia coli
Fermentador de lactose
Salmonella spp.
Não fermentador de lactose
Tetrationato
• É um meio de enriquecimento para Salmonella.
• Contém sais de bile que inibem os microrganismos Gram positivos e a adição da
solução de iodo (antes da amostra) inibe a microbiota intestinal normal.
• Tetrationato é formado no meio pela adição da solução de iodo e iodeto de
potássio. Organismos que contém a tetrationato redutase proliferarão no meio.
•TEMPO DE INCUBAÇÃO 18 - 24 horas. Tempo diferente do preconizado, (inferior
ao período de 18 horas) não se garante a recuperação dos microrganismos alvo e
a não seletividade referente à possível flora presente.
Meio TSI
• Detecta as bactérias fermentadoras de carboidratos e produtoras de H2S;
• Carboidratos: glicose (0,1%), lactose e sacarose (1%), distribuídos 
uniformemente, tanto no fundo quanto na superfície do meio;
• Indicadores para ácido: vermelho de fenol pH neutro-vermelho
pH ácido-amarelo
Não fermentador de lactose
No inicio ocorre uma acidificação, tanto na superfície como no fundo do tubo. Em
seguida o suplemento de glicose se esgota e a bactéria começa a efetuar a
degradação oxidativa dos AA na superfície inclinada do tubo, resultando na liberação
de aminas ficando a parte inclinada vermelha, no entanto o fundo do tubo permanece
amarelo pois a degradação de AA não é suficiente para neutralizar o ácido formado.
Fermentador de lactose
No inicio ocorre uma acidificação, tanto na superfície como no fundo
do tubo e mesmo com o esgotamento da glicose a fermentação
prossegue porque a lactose vai ser utilizada. Ficando tanto a superfície
como o fundo do tubo amarelos.
▪ Ureia
• Detecta os microrganismos produtores da enzima urease, que hidrolisa 
a ureia liberando amônia e CO2.
Ureia
Podem ser utilizados dois meios para a detecção de urease:
Caldo ureia de Stuart Ágar Ureia de Christensen
Tamponado com sais de
fosfato a um pH 6,8, sendo
indicado para identificação de
microrganismos produtores de
grandes quantidades de
amônia para superar o sistema
e elevar o pH do meio para
produzir uma viragem do
indicador (>8.0), sendo seletivo
para espécies de Proteus.
Possui um sistema tampão 
muito mais fraco, permitindo 
detectar produções menores 
de amônia, sendo, portanto, 
apropriadopara a análise de 
bactérias que apresentam 
formação reduzida de urease 
ativa.
▪Citrato
• Determina a capacidade de um microrganismo utilizar citrato de sódio
como única fonte de carbono para o seu metabolismo e crescimento.
Esta capacidade depende da presença de
citrato permease que facilita o transporte
do citrato para o microrganismo. Uma vez
dentro da célula o citrato é degradado pela
enzima citrase, produzindo ácido
oxalacético e acetato.
A formação de bicarbonato de sódio (NaHCO3) e amoníaco (NH3), resultante da 
utilização de citrato de sódio e de sais de amónio, leva a um aumento do pH do 
meio de cultura e, consequentemente, à alteração da cor do mesmo de verde 
para azul tendo como indicador o azul de bromotimol.
▪Citrato
▪ SIM (Sulfeto, indol e motilidade)
• É um meio recomendado para a determinação da produção de H2S, 
formação de indol e motilidade;
• A baixa concentração do ágar permite a dispersão dos microrganismos 
pelo meio (motilidade);
• O indol é um dos produtos da degradação metabólica do triptofano.
Observação: o indol é importante para
separar Escherichia coli (sempre
positivo) de membros do grupo
Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia
(a maioria negativo).
Se a bactéria produzir a enzima tiossulfato redutase ela
ira degradar o tiossulfato de sódio presente no meio
produzindo H2S, este reage com o sulfato ferroso
formando um precipitado preto de sulfeto ferroso.
SIM (Sulfeto, indol e motilidade)
▪Fenilalanina
A fenilalanina é um aminoácido que, por desaminação, forma um
cetoácido, o ácido fenilpirúvico. O microrganismo deve possuir a
enzima desaminase, necessária para essa conversão. O teste da
fenilalanina é baseado na detecção de ácido fenilpirúvico, o qual é
liberado no meio, após o crescimento do microrganismo teste. Sua
presença é visualizada pela adição de uma solução de cloreto férrico
a10%, quando aparece uma cor verde.
▪ Fenilalanina
•A determinação da enzima fenilalaninadesaminase é útil para a 
diferenciação de espécies de Proteus, Morganella e Providencia de 
outros bacilos Gram-negativos.
▪ Descarboxilases
As descarboxilases representam um grupo de enzimas substrato
específicas, capazes de atuar sobre a porção carboxila dos
aminoácidos, formando aminas de reação alcalina. Lisina, arginina e
ornitina são os três aminoácidos habitualmente avaliados na
identificação das enterobactérias cuja descarboxilação resulta na
liberação das seguintes aminas específicas:
Lisina cadaverina
Ornitina putrescina
Arginina citrulina (dehidrolase) 
OBSERVAÇÃO:
• Na conversão de arginina para citrulina intervém uma dehidrolase,
ao invés de uma descarboxilase, na primeira etapa, o NH2 é retirado
da arginina. Em sequência, a citrulina é transformada em ornitina
que, em seguida, sofre descarboxilação para formar putrescina.
• Durante os períodos iniciais da incubação, o meio torna-se amarelo
devido à fermentação da glicose presente. Se o aminoácido for
descarboxilado, formam-se aminas alcalinas e o meio volta à cor
púrpura original.
▪ Lisina
• Muitas bactérias possuem enzimas capazes de descarboxilar AA 
específicos no meio de cultura;
• A enzima descarboxilase remove uma moléculade CO2 de um AA 
para formar aminas de reação alcalina.
Características comuns das Enterobactérias
Bacilos Gram negativos
Não esporulados
Catalase positivos (exceto a Shigella dysenteriae)
Oxidase negativos (importante na sua detecção)
Fermentam a glicose com ou sem produção de gás
Reduzem os nitratos a nitrito
Podem:
• Ser móveis ou imóveis (a maioria são móveis com exceção de 
Klebsiella, Shigella e Yersinia (imóveis a 37°C); as móveis são por 
flagelos peritríquios.
• Ser a maioria anaeróbios facultativos.
• Algumas estirpes podem fermentar a lactose (p.ex. E. coli, Klebsiella, 
Enterobacter, Citrobacter e Serratia).
• Ter cápsula (Escherichia, a maioria das Klebsiella, e algumas 
Enterobacter).
• Crescem bem nos meios comuns e meios seletivos para BGN
( 18 a 24h ≥1 mm de diâmetro).
Importância clínica
• As enterobactérias representam 80% ou mais de todos os Gram 
negativos de importância clínica isolados na rotina microbiológica.
• São responsáveis por cerca de 70% das infecções urinárias e 50% das 
septicemias.
• São considerados enteropatógenos clássicos os diferentes sorotipos de 
Salmonella, Shigella spp, categorias diarreiogênicas de E. coli e 
Yersinia enterocolitica.
• São classificadas atualmente em 42 gêneros e centenas de espécies.
Enterobacteriaceae não envolvida na gastroenterite
Enterobacter
Fermentam lactose. Raramente causam doenças primárias em seres humanos, mas
com frequência colonizam pacientes hospitalizados.
Klebsiella
Fermentam lactose (K. pneumoniaee K. oxytoca).
Causam uma pneumonia lombar necrotizante em indivíduos comprometidos pelo
alcoolismo, diabetes ou doença pulmonar obstrutiva crônica.
Klebsiella granulomatis Donovanose DST
Afeta a pele e mucosas das regiões da genitália, da virilha e do ânus. Difícil isolamento
em meios de cultura.
Serratia
Pode causa infecções no trato respiratório inferior e no trato urinário, especialmente em
pacientes hospitalizados, como também infecção de ferida cirúrgica.
Enterobacteriaceae não envolvida na gastroenterite
Proteus, Morganella e Providencia 
• Proteus - as espécies de Proteus provocam infecções nos seres humanos 
apenas quando deixam o tratointestinal. São encontrados em infecções das vias 
urinarias e causam bacteriemia, pneumonia e lesões em pacientes debilitados.
• Proteus vulgaris e Morganela morganii - são importantes patógenos 
hospitalares.
• Providencia - as espécies de Providencia (P.rettgeri, P.alcalifaciens e P.stuartii) 
estão presentes na microbiota intestinal normal. Todas causam infecções das vias 
urinarias e ocasionalmente outras infecções, e muitas vezes são resistentes ao 
tratamento antimicrobiano.
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