Engenharia Genética

Prévia do material em texto

2023.1
Biotecnologia 
Aplicada a Saúde
GN347
Prof. Dr. Antonio Carlos de Freitas
Dra. Anna Jéssica Duarte
MsC. Larissa Macêdo
Dr. Pedro Luiz de França Neto
Tecnologia do DNA Recombinante
Engenharia Genética
Estudo dos genes de 
um organismo 
(genômica)
Estudos sobre 
regulação gênica
Estudo do produto 
final do gene: 
proteínas
Terapia Gênica
Produção de produtos 
biotecnológicos 
(medicamentos, 
enzimas)
Diagnóstico
Tecnologia forense
Desenvolvimento de 
vacinas
Obtenção de 
Transgênicos (vegetais 
ou animais)
Aplicações
• Insulina e Fator de crescimento semelhante a insulina
• Hormônio do crescimento
• Hormônio folículo estimulante
• Fator VIII
• Eritropoetina
• Fator estimulante de colônias de granulócitos
• Interferon-α, β e γ
Proteínas recombinantes disponíveis
para terapia humana
Antes da TDR, era extraída 
do pâncreas de boi e porco
Primeiro produto 
recombinante de uso clínico 
aprovado pela FDA, início da 
década de 1980
Cerca de 150 produtos aprovados por agências regulatórias
Produção de Proteínas recombinantes
Como ter acesso e isolar o gene codificante de uma 
proteína de interesse?
Exemplos de proteínas-alvo:
- Interleucinas (Ex. IL-12)
- Hormônio do crescimento
- Defensina
- Proteínas virais (Ex. Spike do SARS-CoV-2)
Extração de 
DNA
Extração de 
RNA
Depende do tipo de 
organismo de onde o 
DNA será extraído
E se não for possível extrair o DNA/RNA? Obtenção das sequências a partir de banco de 
dados (Ex. GenBank)
Acesso NCBI
Produção de Proteínas recombinantes
Como isolar especificamente o gene codificante de uma proteína de 
interesse?
PCR
- Polimerase Chain Reaction
- Amplificação específica do gene inserido no 
genoma
Utilização de primers que se anelarão em locais 
específicos da sequência, permitindo a amplificação 
do gene-alvo 
SEQUÊNCIA NUCLEOCAPSÍDEO
ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGC
AGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTT
AAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGT
GGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGAC
GGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAAC
TTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAAC
AGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAAACGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTT
GACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAA
GAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGG
ACCAGGAACTAACCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCA
TTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTT
TGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCG
CAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGAC
TCAACTCAGGCCTAA
Desenho de primers
Primer Foward: ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCA
Primer Reverse: TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACTG
Polimerase chain reaction (PCR)
Após ter acesso as 
sequências, qual o 
próximo passo?
Inserir o DNA numa célula hospedeira que 
funcionará como biofábrica para a 
produção da proteína
Construção de Moléculas de DNA 
recombinante
Moléculas de DNA recombinante
DNA de interesse + Vetor = DNA recombinante
Como é feita a escolha? Como isolar? Quais 
possibilidades de “DNA doador” ou “DNA de origem”?
DNA sintetizados quimicamenteDNA genômico cDNA
Manipulação das moléculas de DNA
DNA de interesse + Vetor = DNA recombinante
Elementos transportadores da 
sequência clonada para uma célula 
hospedeira
Vetores de clonagem
Componentes essenciais:
1) Origem de replicação
- Permite que os plasmídeos sejam mantidos e replicados 
dentro de uma célula hospedeira
2) Gene marcador selecionável
- Geralmente é um gene de resistência a antibiótico
- Permite a distinção entre as células que levam ou não o 
plasmídeo
3) Polylinker/sítios de clonagem múltipla
- Sítios que permitem inserção do gene de interesse
Plasmídeos
Moléculas de DNA circular
Geralmente a replicação é epissomal
Tipos de Vetores
Plasmídeo
Vetores derivados 
de bacteriófagos λ
BAC (Bacterial 
Artificial 
Chromosome)
YAC (Yeast 
Artificial 
Chromosome)
MAC (Mammalian 
Artificial 
Chromosome)
Fagos Cosmídeos
Manipulação das moléculas de DNA
DNA de interesse + Vetor = DNA recombinante
FERRAMENTAS
Enzimas de Restrição Técnicas auxiliares 
(PCR, eletroforese)
Extremidades Coesivas
• Endonucleases
- Tipo I Clivagem em sítios aleatórios em ate 1000 pb do sitio de reconhecimento
- Tipo II Clivagem dentro do sitio de reconhecimento (seq. palindrômicas)
- Tipo III Clivagem em sítios aleatórios em ~25 pb do sitio de reconhecimento
Enzimas de Restrição
Extremidades Coesivas Extremidades “Cegas”
XhoI – GENE – HindIII
Como escolher o 
sítio de restrição 
adequado?
SEQUÊNCIA NUCLEOCAPSÍDEO
ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCA
GTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAA
ATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGT
GACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCA
TCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCT
CAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCA
AGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAAACGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGAT
TGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTC
GGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAAC
TAACCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGA
AGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGC
ATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGA
AACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA
Desenho de primers
Primer Foward: CTCGAGATGTCTGATAATGGACCCCAAAATC
Primer Reverse: AAGCTTTTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC
Amplicon: 1272 pb
XhoI – GENE – HindIII
1) IDENTIFICAÇÃO DO 
GENE DE INTERESSE E 
DESENHO DE 
PRIMERS
2) AMPLIFICAÇÃO 
(PCR)
Clonagens
3) INSERÇÃO DO GENE NO 
VETOR (T4 DNA Ligase*)
Ligação (Inserto + Vetor)
Ligação (Inserto + Vetor)
• Transformação;
• Tratamento para tornar células “competentes”= aptas para 
receber o DNA exógeno;
• Métodos: choque térmico (transformação química) ou elétrico 
(eletroporação).
Inserção do DNA (ligação) na bactéria
Transformação
Seleção dos Clones
- Extração do DNA plasmidial, 
seguido por análise restrição
- Sequenciamento (análise 
integridade e identidade das 
sequências e matriz de leitura)
Pode ser feita para diferentes propósitos:
Clonagens
Construção de plasmídeos para sequenciamento
Formação de bibliotecas de sequências gênicas (diferentes vetores são utilizados 
como os BAC – Bacterial Artificial Chromosome)
Construção de vetores como etapa para produção de proteína recombinantes
• 50% dos produtos terapêuticos produzidos são obtidos com uso de microorganismos
(30% em E. coli)
• Diferentes sistemas de expressão:
Procarioto (bactérias)
Eucarioto - Leveduras e fungos
- Células de inseto
- Células de mamífero
- Células vegetais
Como escolher a melhor célula hospedeira?
Produção de proteínas recombinantes
Características funcionais e 
estruturais da proteína a ser 
produzida, e posterior aplicação
Requisitos:
❖ “Aceitar” o DNA exógeno sem modifica-lo ou modifica-lo ao modoque se deseja.
❖ Permitir a fácil seleção dos hospedeiros que contêm o DNA 
exógeno.
❖ Ser deficiente em proteases, se o organismo for hospedeiro para 
expressão em altos níveis de proteínas heterólogas.
❖Apresentar baixo potencial de proliferação no ambiente caso o 
produto do gene a ser clonado possa induzir risco ao meio 
ambiente.
Células Hospedeiras
Transformação Transfecção Transdução
Inserção do DNA recombinante nas células 
hospedeiras
Bactéria Cél. de origem animal Cél. procarióticas e 
eucarióticas, delivery 
feito por vetores virais
Métodos químicos e físicos
•Principal objetivo: 
Obtenção de altos níveis de mRNA estáveis, que serão 
traduzidos resultando em grandes quantidades da 
proteína de interesse.
Vetores de Expressão
Vetores de Expressão
A expressão do gene depende da presença de uma
coleção de sinais que podem ser reconhecidos pelo
org. hospedeiro. 
1) Promotor: marca onde a transcrição deve
iniciar (reconhecido pela RNA polimerase)
2) Terminador: marca onde a transcrição
deve parar
3) Sítio de ligação do ribossomo (RBS):
sequência nucleotídica curta reconhecida
pelo ribossomo no qual ele deve se ligar no
mRNA
OBS: Inclusão de genes reporter nos cassetes de expressão
Vetores de Expressão
Ex. Escherichia coli (diversas linhagens modificadas geneticamente) 
• Vantagens: fácil manipulação, rápido crescimento, alto rendimento
de proteínas e baixo custo; possibilidade de otimização da
expressão;
• Desvantagens: Formação de corpos de inclusão (proteínas
insolúveis e não funcionais), ausência de modificações pós-
traducionais*.
Ausência de maquinaria para o processamento transcricional de genes
derivados de eucariotos, não realizam processamento de mRNA (splicing)
Expressão de proteínas recombinantes em 
bactérias 
Linhagens de E. coli
• Alto nível de expressão de proteínas recombinantes;
• Sistema de expressão baseada no promotor T7;
• Estabilidade aumentada dos transcritos de mRNA.
BL21 DE3
• Apresenta as mesmas características e aplicações que a cepa BL21, além de compensar 
os tRNAS para os códons AGG, AGA, AUA, CUA, CCC e GGA que são os códons menos 
freqüentes em E. coli
Rosetta DE3
• Reúne características das linhagens BL21 e Rosetta (compensa códons raros)
• Permite a formação de ligações dissulfeto
Rosetta-gami 2 DE3
• Leveduras: Saccharomyces cerevisiae; Pichia pastoris; Hansenula
polymorpha
• Rendimento, facilidade de manipulação, altos níveis de expressão,
modificações pós-traducionais (glicosilação, pontes dissulfeto), secreção da
proteína
• Promotores induzíveis e constitutivos
• Status GRAS
• Veículo vacinal
• Altas densidades celulares
• Culturas escalonáveis
(P. pastoris 100 g/L)
Expressão de proteínas recombinantes em 
leveduras
• OBS: P. pastoris induz padrão de glicosilação mais próximo ao de 
células de mamíferos, comparado a S. cerevisiae.
Produtos terapêuticos produzidos em P. 
pastoris
Inibidor de calicreína plasmática humana
• Trat. Angiodema hereditário (Kalbitor®) (aprovado pela FDA em 2009)
Inibidor de elastase
• Trat. Fibrose cística
Endostatina e Angiostatina
• Aplicações como antiangiogênicos
Fator de crescimento epidermal
• Trat. de feridas causadas pela diabetes
Principais vacinas produzidas a partir de 
leveduras
AGENTE INFECCIOSO STATUS
HBV Aprovada (Merck e Co)
HBV - Difteria - Tétano – Coqueluche – Polio Aprovada (GSK)
HBV - Difteria - Tétano – Coqueluche – Polio –
H. influenzae (tipo B)
Aprovada (Sanofi Pasteur)
HPV Aprovada (Merck)
Malaria (Plasmodium falciparum zygotes) Pré-clínico
Schistosoma mansoni Fase I (NCT02337855)
Vacinas de Subunidade
Baculovírus
- Vírus que infectam insetos
- Utilizados no controle biológico de insetos-praga
- Vetores de expressão de proteínas e de terapia gênica.
* Método diferente para obtenção do DNA recombinante (recombinação 
homóloga ou transposição)
* O gene de interesse deve ser introduzido no lócus de um gene não essencial 
para a replicação viral
* Células: Sf9, Sf21, Tn-368, TI-TN-5B1-4
* Plataforma para produção de vacinas (CERVARIX® e PROVENGE®)
Baculovírus para expressão de proteínas 
recombinantes em células de inseto
• Produção de proteínas com características semelhantes às 
presentes em nosso organismo.
• Alto custo de produção e manutenção.
• Aplicações além da produção de produtos terapêuticos.
Células de Mamífero como sistemas de 
expressão
Linhagem celular Origem Aplicações
COS Primata Exp. transiente e prod. de vírus recombinantes
HEK293 Humana Exp. transiente e estável e prod. de vírus recombinantes
BHK-21 Hamster Exp. transiente e estável e prod. de vacinas
Vero Primata Produção de vacinas
MDCK Canina Exp. estável e produção de vacinas
• Interessante capacidade de escalonamento
• Produção através de cultivo de calos indiferenciados ou cél. em 
suspensão
• Transformação (métodos indiretos e diretos): infecção por agrobactérias, 
transdução, biobalísitca, entre outros.
Plantas como biorretores
Possibilidade de produção 
vacinas comestíveis (sem 
necessidade purificar as 
proteínas)
Possíveis produtos:
Plantas como biorretores
Milho Tabaco Tomate
Arroz Alface Soja
Batata Espinafre Banana
Anticorpos
Citocinas
Enzimas
Hormônios
Vacinas*
Tabaco Fatores importantes para escolha da 
espécie hospedeira:
- Tipo e finalidade da proteína a ser 
expressa
- Duração do ciclo de vida
- Quantidade de biomassa
- Facilidade de manipulação genética
- Custos de produção em larga escala
Plantas como biorretores
Planta modelo
Perguntas?
duarte.annaj@gmail.com
Obrigada!
Bons estudos!