Aula 3 - Meios de cultura e crescimento bacteriano

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Aula 3 – Estruturas, cultura e isolamento de microrganismos
Estrutura comum entre bactérias:
· Mesossomos são as invaginações que podem ocorrer na membrana citoplasmática das bactérias. Essas invaginações auxiliam principalmente no processo de divisão binária (replicação da bactéria) onde as paredes invaginadas vão se aproximando da periferia ao centro até se unirem e por fim se separarem, formando então duas bactérias. 
Estruturas que estão contidas em algumas bactérias: 
· Cápsula: Dificulta a ligação antígeno-anticorpo devido a uma camada de muco logo a fagocitose é impedida, sistema complemento não age visto que o ato de neutralizar a bactéria não é feito pela não ligação da bactéria ao anticorpo. Porém, com o passar do tempo a camada de muco dessa estrutura vai se perdendo e ai sim a ligação com o anticorpo é possível. Portanto, quanto mais as células de defesa tentam se ligar, mais elas vão conseguindo. Essa estrutura não impede a neutralização (ligação com o antígeno), porém, dificulta bastante. Bactérias encapsuladas são bastante agressivas devido a resistência mecânica que elas apresentam e ainda em observação macroscópica de colônia dessas bactérias, é possível ver na placa um aspecto brilhante que ao mexer é mucoso parecendo requeijão, é um exemplo de bactéria encapsulada o estafilococos aureus. 
· Endosporo: É uma estrutura de dipicolinato de cálcio que se forma dentro da bactéria formando um compartimento que armazenará estruturas e nutrientes importantes para a vida da bactéria como parede celular, membrana celular, material genético etc. É um fator de resistência principalmente ambiental (já que as bactérias vivem de forma livre), visto que bactérias que possuem endósporo podem sobreviver muito tempo em ambiente hostil sem ser afetada. A formação do endósporo é denominada esporulação e se dá quando as bactérias sentem mudanças não favoráveis no ambiente levando a condições inadequadas para a sua vida, lembrando que apenas algumas bactérias possuem a capacidade de sintetizar essa estrutura. Ao formar o endosporo a bactéria que já armazenou tudo necessário a sua sobrevivência, se desvencilha do que sobrou fora desse endosporo como na imagem abaixo: 
Quando o meio se torna favorável novamente ou a bactéria que se encontra no esporo maduro necessita de nutrientes, a síntese de dipicolinato de cálcio é interrompida e o esporo aos poucos degradado. Desta forma, a bactéria volta a se multiplicar e interagir com o meio caracterizando o processo de germinação. 
As bactérias esporuladas sentem que o meio está favorável diante de mudança de diferentes estímulos externos. Ainda, estas por possuírem está rígida estrutura resistem á métodos de esterilização, deste modo, passam por 2 ciclos ou até 3 de autoclave por exemplo (que consiste em pressão e temperatura) para serem eliminadas. São exemplos de bactérias esporuladas: 
- Clostridium Tetani – Causadora do tétano, leva a paralisia pela contração muscular excessiva; 
- Clostridium Dificile – Causadora da colite pseudomembranosa; 
- Clostridium Perfringens – Ocasiona a gangrena gasosa; 
- Clostridium Botulinum – Causadora do botulismo, leva a paralisia por flacidez muscular excessiva. 
Cultura e isolamento de microrganismos
Cultura e isolamento são etapas distintas que são importantes na microbiologia, visto que o cultivo de microrganismos pode ser benéfico em diversos setores seja o de pesquisa, industrial, produção de vacinas entre diversos outros. Já o isolamento é importante para que a cultura de fato aconteça e o microrganismo possa ser identificado. 
Portanto, as etapas devem seguir com o isolamento que consiste em retirar o microrganismos do material e depois com a cultura e identificação. 
O meio de cultura é o ambiente que contém substâncias que favorecem às bactérias, criando condições para que elas cresçam. Todo meio é feito a partir de gelatina extraída de algas chamada de Ágar, onde com a adição de mais ou menos água se obtém os meios líquidos ou mais sólidos. 
De modo geral, há três parâmetros que determinam o sucesso no cultivo das bactérias que são: Nutrição, atmosfera e temperatura. 
· Nutrição: 
A nutrição se refere aos compostos químicos necessários para as bactérias crescerem e de acordo com essa nutrição, pode-se classificar os meios nutricionalmente como simples e complexos. Sendo:
· Meio simples: Neste meio, os nutrientes são adicionados de acordo com a bactéria a ser cultivada, portanto, é um meio mais utilizado na pesquisa já que já se sabe qual microrganismo se trata e haverá uma padronização de nutrição para cada tipo. Esse meio é seletivo, ou seja, apenas a bactéria específica será cultivada visto que é determinado os nutrientes usados para que apenas ela se desenvolva. 
· Meio complexo: É um meio altamente rico em diversos nutrientes onde independente do microrganismo e quantidade, haverá o cultivo. Esse meio é caracterizado pela grande quantidade de nutrientes que não é possível quantificar cada um destes no meio, diferente do simples que são determinados as quantidades. Um exemplo de meio complexo é o Agar sangue de carneiro que a cada 100 ml de agar há +/- 5% de sangue de carneiro, onde os nutrientes macro e micro não são possíveis de quantificar. Sabendo que qualquer microrganismo pode se proliferar nesse meio uma vez que ele é rico em inúmeros nutrientes, bactérias de fora do meio podem também crescer levando a contaminação do meio. Este meio é utilizado quando não se sabe qual bactéria deve ser cultivada, aumentando assim a chance de cultivar por exemplo uma bactéria causadora de uma infecção urinária e identificá-la, mas da mesma forma que é um ponto positivo essa falta de especificidade também é uma desvantagem diante de manipulações erradas levando a contaminação de bactérias que não favorecem o diagnóstico como bactérias da flora vaginal em uma má assepsia da região para a coleta que iria para cultura. 
· Meio diferencial: É o meio onde pode-se diferenciar colônias diante de cores diferentes que elas produzem entre outros. No caso desse meio, pode-se adicionar corantes que serão absorvidos pelas bactérias permitindo a identificação dessas pela cor da colônia. Esse meio é bastante utilizado na área de análise de alimentos. 
· Atmosfera:
A atmosfera, é um fator importante que se refere ao meio rico em 02 ou não, há bactérias que conseguem se proliferar em meios com CO2 por exemplo já outras não conseguem, então, mesmo que bem nutridas por um meio simples ou complexo, necessitam da atmosfera ideal para que elas possam crescer. As bactérias podem ser classificadas de acordo com a sua preferência atmosférica, sendo: 
· Bactérias aeróbicas: Precisam de oxigênio.
· Bactérias micro aeróbicas: Precisam de oxigênio em baixas concentrações e não suporta altas concentrações. 
· Bactérias anaeróbicas: Não suportam oxigênio e só crescem em ambiente com presença do CO2.
· Bactérias anaeróbicas facultativas: São bactérias aeróbicas que se adaptam á ambiente sem oxigênio, crescendo, portanto, na presença de CO2 (gás carbônico) caso ela queria. 
· Bactérias capnofílicas: Só crescem em ambiente com muito CO2. 
Lembrando que as bactérias aeróbicas, anaeróbicas e anaeróbicas facultativas são as que normalmente causam doenças. 
· Temperatura:
A temperatura é um parâmetro também decisivo com relação ao cultivo de bactérias, uma vez que as bactérias possuem preferências nutricionais e atmosféricas, elas também possuem preferências com relação a temperatura, já que sem a temperatura ideal elas não conseguem se proliferar. As bactérias podem ser classificadas com relação a essa preferência de temperatura, sendo: 
· Temófilas: Bactérias que residem em temperaturas acima de 40º C, portanto, habitam por exemplo águas termais ou vulcânicas. 
· Mesófilas: Bactérias que preferem temperaturas de 20º á 40º C. 
· Psicrófilas: Bactérias que preferem de 20º á 0º C (até abaixo de 0ºC). 
Ainda em relação aos meios, pode ser classificado de acordo com o estado físico, sendo: 
· Meio Líquido: Também conhecidocomo caldo, é um meio em estado líquido que aumenta a biodisponibilidade dos nutrientes, logo a produção de bactéria é aumentada. Geralmente, esse meio é límpido e quando aumenta a população de bactérias se torna turvo, ainda bactérias que estão nesse meio não necessita de flagelos, pois, os nutrientes se encontram em todo o meio. Este meio, atua na etapa de enriquecimento, onde as bactérias se reproduzem não conseguem se unir entre si e podem ser levadas a outro meio. 
· Meio Sólido: Meio em que se permite formar a colônia de fato e observá-las. As bactérias irão formar a colônia na região que contém os nutrientes da placa sólida, portanto, este meio atua na etapa de isolamento e cultivo. 
· Semi-sólido: Meio gelatinoso que é possível observar rastros deixados pelas bactérias indicando a presença de flagelos, portanto, é utilizado para a prova de motilidade. 
Portanto, os meios podem ser simples e complexos, seletivos ou diferenciais, líquido sólido. Por exemplo o meio pode ter diversas características juntas podendo ser meio sólido simples seletivo e diferencial. 
Crescimento bacteriano
As bactérias para crescer além de todas as condições citadas acima precisam de tempo, uma vez que quando levadas a um meio levam um tempo para se adaptar e proliferar. 
Denomina-se Lag o período em que a bactéria leva para reconhecer e se adaptar ao meio que em bactérias aeróbicas pode levar em média 2 á 4 horas e bactérias anaeróbicas aos menos 7 dias. Depois desse período de lag, a bactéria se prolifera dando entrada no período chamado de log (logarítmica), depois se vê no período estacionário onde algumas começam a morrer devido o fim dos nutrientes disponíveis e outras ainda se proliferam. Ao acabar os nutrientes entram em declínio e por fim a morte. 
O tempo em que ocorre essas etapas vai variar de acordo com o tipo de bactéria e é um parâmetro importante a ser observado para que não haja falsos resultados emitido seja pela morte das bactérias da cultura ou por nem terem se proliferado. Segue exemplo de crescimento de bactéria aeróbica:
 Concentração de microrganismos (CM)
Esta é a fase ideal para se fazer análises, pois, ainda terá bactérias vivas para testes.
Estacionária (nutriente diminui)
Log (cresce CM)
Morte
Declínio
Lag
2 - 4hs 12hs 16 - 18hs 18 - 24hs Tempo