aula_04

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Processamento das amostras para 
exame microbiológico
Morfologia bacteriana
Classificação bacteriana de acordo com a forma
As bactérias podem se apresentar em três morfologias. 
Morfologia bacteriana
Cocos
Bactérias com formato esférico ou oval, conforme a sua divisão celular.
Bactérias em formas de cocos.
São exemplos de cocos de importância médica:
▪ Staphylococcus aureus.
▪ Enterococcus spp.
▪ Streptococcus sp.
▪ Neisseria sp.
Morfologia bacteriana
Cocos
Esses cocos podem se apresentar em cinco arranjos:
Dipococos Streptococos Tétrades
Sarcinas Estafilococos
Morfologia bacteriana
Bacilos ou bastonetes
▪ Bacilos ou Bastonetes: Forma bacteriana cilíndrica ou de 
bastão.
▪ Variação morfológica: Extremidades retas ou 
arredondadas, curtas ou longas.
▪ Agrupamento: Geralmente isolados, ocasionalmente 
diplobacilos ou estreptobacilos.
▪ Exceções notáveis: Em alguns casos, como 
Corynebacterium diphtheriae, apresentam arranjos 
distintos.
Morfologia bacteriana
Bacilos ou bastonetes
Veja agora algumas doenças causadas por bactérias em formato de bastonete ou bacilos:
Tétano - Clostridium 
tetani
Tuberculose - 
Mycobacterium 
tuberculosis
Difteria - 
Corynebacterium 
diphtheriae (bacilo 
diftérico)
Hanseníase (lepra) - 
Mycobacterium lepra
Morfologia bacteriana
Espiraladas
Bactérias com formato espiralado ou helicoidal, que aparecem predominantemente como células isoladas.
Morfologia bacteriana
Espiraladas
Elas podem ser divididas em:
Citologia bacteriana
Introdução à citologia bacteriana
Bactérias são procariotas, sem 
membrana nuclear e organelas 
eucarióticas.
A parede celular, ao ser corada, 
ajuda na identificação de grupos 
bacterianos.
Citologia bacteriana: Elementos 
obrigatórios (parede celular, 
membrana, material genético, 
ribossomos) e acessórios 
(plasmídeos, flagelos, esporos).
Essenciais para sobrevida, 
elementos variam entre 
bactérias.
Citologia bacteriana
Parede celular
Parede celular é crucial para bactérias, moldando sua forma e conferindo rigidez.
Essencial na divisão celular, proporciona proteção osmótica entre meios externo e interno.
Composta por peptideoglicanos, sua coloração define bactérias como Gram-positivas ou Gram-
negativas.
Identificação facilita tratamento empírico antes dos resultados de cultura e antibiograma.
Citologia bacteriana
Bactéria Gram-positiva
▪ Bactéria Gram-positiva: Parede celular densa com 
peptideoglicanos, ácidos teicoicos e lipoteicoicos.
▪ Ácidos teicoicos são essenciais para viabilidade e 
virulência bacteriana.
▪ Lipoteicoicos, antígenos de superfície, permitem 
distinção de sorotipos e aderência.
▪ Virulência é a capacidade de causar danos fatais, 
diferente de patogenicidade, que induz doenças.
Citologia bacteriana
Bactéria Gram-negativa
▪ Bactéria Gram-negativa: Parede celular complexa, fina 
camada de peptideoglicanos.
▪ Membrana externa é barreira permeável, protege contra 
condições adversas e resistência a antimicrobianos.
▪ LPS na membrana externa é essencial, induz resposta 
imunológica, mas pode causar choque endotoxêmico.
▪ Resistência crescente a antimicrobianos; causam diversas 
infecções graves em humanos.
Citologia bacteriana
Micobactérias e micoplasma
▪ Micobactérias: Bacilos, parede com 
arabinogalactano e ácidos micólicos.
▪ Não coram bem pelo método de Gram; usado 
Ziehl Neelsen.
▪ Exemplo: Mycobacterium tuberculosis, 
causador de tuberculose.
▪ Micoplasma: Sem parede celular, membrana 
lipoproteica flexível.
Citologia bacteriana
Micobactérias e micoplasma
▪ Micoplasma: Menor bactéria na natureza (0,3µm), sem 
parede celular.
▪ Incorpora esteróis do hospedeiro em sua membrana.
▪ Mycoplasma pneumoniae comum na causa de pneumonia.
Citologia bacteriana
Membrana plasmática
▪ Membrana plasmática: Semipermeável, seletiva, contendo várias enzimas.
▪ Separa citoplasma do meio extracelular, constituída de fosfolipídeos e proteínas.
▪ Semelhante à membrana eucariótica, mas sem esteróis.
Citologia bacteriana
Citoplasma bacteriano
Citoplasma bacteriano dividido em:
▪ Citoplasmática: Rica em RNA, 
partículas proteicas e ribossomos.
▪ Cromatínica: DNA circular dupla fita 
com informações genéticas.
▪ Porção fluida: Nutrientes 
dissolvidos.
Algumas bactérias têm múltiplas 
cadeias de DNA (Vibrio cholerae) ou 
DNA linear (Borrelia burgdorferi).
Elementos acessórios
O que são elementos acessórios?
▪ Elementos acessórios: Estruturas presentes ou 
não em bactérias.
▪ Contribuem para virulência, patogenicidade e 
resistência bacteriana.
Elementos acessórios
Glicocálice
Glicocálice: Revestimento de 
polissacarídeos, cápsula ou 
camada viscosa.
Cápsula é uniforme e aderida à 
parede; camada viscosa tem 
aderência variável.
Funções: Evita fagocitose, atua 
como reservatório de nutrientes, 
auxilia na aderência bacteriana.
Exemplo: Streptococcus mutans 
usa cápsula para fixação e 
perfuração do esmalte dentário.
Elementos acessórios
Plasmídeo
▪ Plasmídeo: DNA circular extracromossomal replicável autonomamente.
▪ Localizado no citoplasma bacteriano, confere vantagens adaptativas.
▪ Exemplo: Resistência a antibióticos.
▪ Podem ser transferidos para outras bactérias; ocorrem em cópia única ou múltipla.
Elementos acessórios
Grânulos ou inclusões citoplasmáticas
▪ Trata-se de grânulos (inclusões ou corpúsculos citoplasmáticos) cuja 
função é a de armazenamento, que pode ser, entre outros exemplos, 
de glicogênio, amido, fosfatos e enxofre. 
▪ Os grânulos podem ser visualizados a partir de colorações especiais, 
pois geralmente são refringentes.
Elementos acessórios
Flagelos
Flagelos: Estruturas de 
locomoção em algumas 
bactérias, formadas por 
flagelina.
Ancorados à membrana por um 
corpo basal, podem ser único ou 
múltiplo.
Tipos: Polar (nas extremidades) 
ou peritríquio (em todo o corpo).
Importantes para busca de 
nutrientes e fuga de substâncias 
tóxicas; visíveis com técnicas de 
coloração.
Elementos acessórios
Pili e fímbrias
Fímbrias: Filamentos semelhantes a fios de cabelo, compostos por pilina.
Ancoram-se nas membranas celulares dos hospedeiros, auxiliando na colonização.
Neisseria gonorrhoeae (gonorreia) e E. coli (trato urinário) usam fímbrias na colonização.
Pili sexuais permitem transferência de material genético na conjugação bacteriana.
Elementos acessórios
Esporos (endosporos)
Esporos: Estrutura resistente 
produzida por algumas bactérias 
(Bacillus, Clostridium).
Formados em resposta a 
ambientes desfavoráveis 
(escassez de água ou nutrientes).
Resistência permite 
sobrevivência por longos anos, 
revertendo à forma vegetativa 
quando o ambiente se torna 
favorável.
Cada célula forma um único 
esporo, liberado após a morte da 
bactéria.
Introdução aos meios de cultivos
▪ Meios de cultura fornecem nutrientes para crescimento 
microbiano.
▪ Composição inclui macronutrientes e micronutrientes essenciais.
▪ Semeadura em meios específicos facilita identificação bacteriana.
▪ Laboratórios usam meios prontos ou preparam a partir de 
desidratados.
Introdução aos meios de cultivos
▪ Meios de cultura podem ser fabricados adicionando constituintes 
específicos.
▪ Exemplo: ágar sangue - ingredientes e preparo.
▪ Consistência sólida obtida com ágar-ágar, polissacarídeo de alga 
marinha.
▪ pH ajustado para 7,3 ± 0,2 a 25°C após preparo.
Preparo dos meios de cultivo
Preparo dos meios de cultivo sólidos em placas
▪ Meios de cultivo sólidos comprados liofilizados.
▪ Exemplo: preparação ágar sangue - regra de 3 para 
determinar quantidade.
▪ Pesagem realizada em copos de plástico ou colheres 
plásticas.
▪ Aquecimento pode ser necessário; autoclavação a 121°C 
por 15 minutos com tampas semiabertas.
Preparo dos meios de cultivo
Preparo dos meios de cultivo sólidos em placas
▪ Placas não devem ser completamente fechadas após 
adição do meio.
▪ Após solidificação, podem ser tampadas, invertidas, 
identificadas.
▪ Embaladas e refrigeradas (2-8°C) para uso posterior.
▪Uso liberado após controle de qualidade, incluindo teste 
de esterilidade e cultivo de bactérias-padrão.
Preparo dos meios de cultivo
Preparo dos meios de cultivo sólidos em placas
▪ Teste de esterilidade: placas incubadas a 37°C por 24-48h.
▪ Ausência de crescimento bacteriano permite uso; 
contaminação exige descarte.
▪ Crescimento de bactérias conhecidas avaliado para 
confirmação.
▪ Preparo de meios não comerciais: pesagem, adição de 
água, ajuste de pH, ágar-ágar aquecido, autoclavado.
Preparo dos meios de cultivo
Preparo dos meios de cultivo sólidos em tubos
▪ Meios sólidos em tubos: fracionamento e autoclavagem.
▪ Tubos inclinados a 45° para solidificar ágar.
▪ Utilizados para armazenamento de colônias, cultura de fungos, 
testes de identificação.
▪ Após solidificação, identificação, controle de qualidade e 
armazenamento refrigerado.
Preparo dos meios de cultivo
Preparo dos meios de cultivo líquidos
▪ Meios líquidos sem ágar-ágar.
▪ Preparação similar aos meios sólidos.
▪ Fracionamento, autoclavagem, resfriamento e armazenamento 
refrigerado.
▪ Diferença: meios líquidos não solidificam após autoclavação.
Preparo dos meios de cultivo
Classificação dos meios de cultivo
Classificação dos meios de cultura baseada em:
▪ Estado físico.
▪ Composição.
▪ Objetivo de utilização.
Preparo dos meios de cultivo
De acordo com o seu estado físico
Meio sólidos Meios semissólidos Meios líquidos 
Preparo dos meios de cultivo
De acordo com a composição química
Meios quimicamente definidos
Meios quimicamente 
definidos
Apresentam a composição 
química de todos os seus 
constituintes conhecida 
(definidos) como, por exemplo, o 
meio AR-103.
Meios complexos
São aqueles cuja constituição 
exata do meio de cultura não é 
conhecida. Em sua composição, 
tais meios apresentam soro, 
sangue, extratos moídos ou 
digeridos de órgãos animais, 
peixes, leveduras, vegetais entre 
outros. 
Preparo dos meios de cultivo
De acordo com o objetivo da utilização
Meios enriquecidos ou ricos
São os meios que contêm um grande suprimento de nutrientes pela adição de diversas substâncias, como 
sangue, soro e extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo.
Colônias de bactérias crescidas 
em meio ágar sangue
Ágar chocolate
Preparo dos meios de cultivo
De acordo com o objetivo da utilização
Meios seletivos
▪ Compostos inibidores (sais biliares, cristal violeta) impedem 
crescimento de certas bactérias.
▪ Exemplo: Ágar MacConkey favorece Gram-negativas, 
inibindo Gram-positivas.
Preparo dos meios de cultivo
De acordo com o objetivo da utilização
Meios diferenciais ou indicadores
Contêm substâncias para distinguir diferentes bactérias.
Colônias rosas - fermentam a 
lactose
Colônias amarelas - não 
fermentam a lactose
Tipos de semeaduras
Semeadura é vital no processamento microbiológico de espécimes clínicos.
Diversas técnicas são empregadas, variando conforme o meio de cultura 
e os testes necessários.
Além da semeadura, exames diretos e análise microscópica, incluindo 
coloração de Gram, são essenciais.
O estudo abrange tipos de colorações e suas finalidades específicas.
Tipos de semeaduras
Técnica de esgotamento
▪ Técnica de esgotamento visa isolar colônias bacterianas para 
análise morfológica e bioquímica.
▪ Permite a observação de colônias sobrepostas e isoladas, 
possibilitando o cultivo puro.
▪ A imagem revela áreas com colônias brancas e rosas sobrepostas 
ou isoladas.
▪ Procedimento envolve transferência de amostra, estrias em 
quadrantes e movimentos ziguezague para esgotar material.
Tipos de semeaduras
Técnica de esgotamento
Esta imagem ilustra o passo a passo da 
semeadura:
Tipos de semeaduras
Técnica de esgotamento
▪ Imagem mostra cultura de amostra semeada por esgotamento.
▪ Inicialmente, alta concentração de colônias dificulta a 
observação.
▪ Ao final, colônias isoladas se tornam visíveis após o processo.
▪ Destaca a eficácia da técnica para obtenção de culturas puras.
Tipos de semeaduras
Técnica quantitativa
▪ Técnica quantitativa para contagem de células em suspensões ou 
espécimes clínicos, como urina.
▪ Amostra é homogeneizada e alça bacteriológica calibrada obtém 
alíquota.
▪ Estria central seguida de movimentos ziguezague uniformemente 
distribuem o material na placa.
▪ Importância da alça submergir a 90° para garantir volume preciso.
Tipos de semeaduras
Técnica quantitativa
▪ Cultura quantitativa de um LBA. 
▪ Repare que, na linha central e nas linhas laterais, 
existe apenas um tipo de colônia, que 
provavelmente é responsável pela infecção.
Tipos de semeaduras
Técnica de espalhamento
▪ Técnica de espalhamento usada para crescimento confluente 
em meio sólido.
▪ Aplicada em antibiogramas, contagem bacteriana e 
urinocultura.
▪ Diluição da amostra é espalhada usando alça de Drigalsky 
para contagem bacteriana.
▪ Nas urinoculturas, amostra homogeneizada é depositada e 
espalhada com alça calibrada.
Tipos de semeaduras
Técnica de espalhamento
▪ Nessa técnica, o crescimento da bactéria ocorre em toda a 
superfície da placa. 
▪ Na imagem a seguir, é possível visualizar colônias de 
bactérias isoladas.
Tipos de semeaduras
Técnica de pour-plate
▪ Técnica de pour-plate para contagem de colônias 
bacterianas no interior do ágar.
▪ Amostra diluída é depositada sobre placa sem meio de 
cultura.
▪ Meio de cultivo fundido é despejado, homogeneizado e a 
placa é incubada na estufa.
Tipos de semeaduras
Técnica de pour-plate
Essa técnica é utilizada para contagem de 
bactérias, mas não é muito empregada 
durante as rotinas dos laboratórios 
clínicos.
Tipos de semeaduras
Análise microscópica
Fase analítica do exame microbiológico inclui exame direto e semeadura para isolamento bacteriano.
Cultura demora pelo menos 48 horas; exame direto é crucial em casos urgentes, como meningite.
Identificação bacteriana e testes de sensibilidade guiados pela análise microscópica após a cultura.
Manipulações devem seguir normas de biossegurança e esterilidade para evitar contaminação e falsos 
positivos.
Tipos de semeaduras
Exame direto
Microscópio óptico 
(aumento de até 
1.000 vezes) comum 
na observação de 
microrganismos.
Bactérias vivas 
podem ser 
visualizadas a fresco 
sem corantes.
Uso de microscópio 
de campo escuro e 
ajustes para 
mobilidade e 
morfologia, 
especialmente para 
bactérias 
espiraladas.
Corantes são 
aplicados após 
fixação para melhor 
visualização da 
morfologia e 
citologia bacteriana. 
Boas técnicas de 
esfregaço são 
cruciais.
Tipos de semeaduras
Processamento das amostras
Diferentes amostras passam por 
processamentos específicos no 
laboratório de microbiologia.
Semeadura segue ordem de 
meios mais ricos para mais 
seletivos.
Incubação a 37°C por 24-48 
horas, variando para atmosfera 
ambiente, microaerofilia ou 42°C 
conforme necessidade.
Culturas de fungos exigem ágar 
Sabouraud e incubação a 25-
30°C, com análise microscópica 
adicional.
Tipos de semeaduras
Sangue
Hemoculturas priorizadas por indicar infecções graves; inoculação em garrafas específicas.
Incubação para crescimento microbiano, tanto aeróbios quanto anaeróbios, em equipamentos 
automatizados ou estufas.
Resultado preliminar importante para orientar tratamento; semeadura nas placas e lâminas de 
Gram para análise da morfologia.
Nas hemoculturas manuais, repiques em dias preestabelecidos; em frascos com carvão, lâmina 
deve ser aquecida a 45°C após esfregaço.
Tipos de semeaduras
Ponta de cateter
▪ Pontas de cateteres são cultivadas junto com amostras de 
sangue, usando técnica semiquantitativa MAKI.
▪ Cateter é enviado em frasco estéril, roscado, de cerca de 5 
cm.
▪ No laboratório, ponta do cateter é rolada sobre ágar sangue; 
sem exame direto.
Tipos de semeaduras
Urina
Urinocultura para 
diagnóstico de 
infecção do trato 
urinário (ITU) requer 
método 
quantitativo.
Homogeneização da 
amostra é essencial 
no momento da 
semeadura.
Meios como ágar 
CLEDou 
cromogênicos 
usados para cultivo 
de Escherichia coli e 
Staphylococcus 
saprophyticus.
Exame direto 
(coloração de Gram) 
raramente 
solicitado; se 
necessário, amostra 
homogeneizada é 
usada sem 
centrifugação para 
preparação das 
lâminas.
Tipos de semeaduras
Fezes
▪ Coprocultura para diarreias crônicas ou 
sanguinolentas, usando meios seletivos/diferenciais.
▪ Ágares EMB-Teague, MacConkey e Salmonella-
Shigella frequentemente empregados.
▪ Amostras podem ser pré-enriquecidas em caldo GN, 
selenito ou tetrationato antes da semeadura.
Amostras sólidas, do trato respiratório e líquidos corporais
Amostras sólidas
Amostras sólidas (biópsias, 
gânglios) fragmentadas com 
gral/pistilo, em salina ou caldo.
Semeadura em ágar chocolate, 
ágar sangue, caldo 
tioglicolato/BHI e, 
opcionalmente, ágar 
MacConkey.
Lâminas feitas por imprint para 
visualizar a "impressão" da 
amostra.
Fragmentos ósseos podem ser 
transferidos para meio líquido se 
inviável fragmentar; incubação e 
semeadura em ágar sangue e 
MacConkey após 24-48 horas. 
Amostras sólidas, do trato respiratório e líquidos corporais
Amostras do trato respiratório
▪ Amostras respiratórias: swabs de orofaringe e nasofaringe 
em ágar sangue para crescimento de patógenos.
▪ Semeadura: deposito e esgotamento; exame direto requer 
coleta adicional.
▪ Escarro: Meios de Löwenstein-Jensen para micobactéria; 
ágar sangue/chocolate para pneumonia.
Amostras sólidas, do trato respiratório e líquidos corporais
Amostras do trato respiratório
Amostras, incluindo escarro e lavado broncoalveolar, 
semeiam por esgotamento ou centrifugação.
No escarro, parte purulenta é depositada em lâmina e 
prepara-se esfregaço.
Lavado broncoalveolar centrifugado; pellet semeado em 
ágar chocolate, ágar sangue e ágar MacConkey; duas 
lâminas feitas para exame direto.
Amostras sólidas, do trato respiratório e líquidos corporais
Amostras de líquidos corporais
▪ Amostras de líquidos corporais (sinovial, pleural, líquor) centrifugadas e semeadas por esgotamento.
▪ Alternativamente, semeadura em meio líquido (caldo tioglicolato ou BHI) é comum.
Classificação das técnicas de coloração
Análise microscópica de 
amostras ou colônias isoladas.
Preparação de esfregaço: 
suspensão de células em salina.
Técnicas de coloração: simples (1 
corante), diferencial (mais de 1 
corante).
Métodos diferenciais 
importantes: Gram, Ziehl-
Neelsen, Albert-Laybourn 
(menos comum).
Tipos de coloração mais empregadas
Coloração de Gram
▪ Desenvolvida por Hans Christian Joachim Gram em 1884.
▪ Distingue bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
▪ Utiliza corantes básicos, mordente (iodo-iodetado), 
agente descolorante (álcool) e segundo corante 
(safranina/fucsina).
▪ Resultado: Gram-positivas aparecem roxas, e Gram-
negativas, vermelhas.
Tipos de coloração mais empregadas
Coloração de Ziehl-Neelsen
▪ Desenvolvida por Franz Ziehl e Friedrich Carl Adolf Neelsen.
▪ Utilizada para bactérias com parede celular hidrofóbica, 
resistente à coloração de Gram.
▪ Gêneros como Micobacterium e Nocardia são "Bacilos-
álcool-ácido-resistentes" (BAAR).
▪ Procedimento: Fixação no calor, fucsina de Ziehl aquecida, 
lavagem, descoloração com álcool-ácido, coloração com azul 
de metileno.
Friedrich Carl Adolf Neelsen.
Tipos de coloração mais empregadas
Coloração de Ziehl-Neelsen
Os BAAR são visualizados como bastonetes finos e vermelhos sobre um fundo corado em azul:
Tipos de coloração mais empregadas
Coloração de Ziehl-Neelsen
Essa técnica ainda pode ser realizada em outras amostras:
Urina Líquidos pleurais Lavado broncoalveolar
Aspirado traqueal Biópsias Líquor
Tipos de coloração menos empregadas
Coloração de Albert-aybourn
▪ Corpúsculos citoplasmáticos corados indicam bacilos 
metacromáticos.
▪ Corynebacterium diphtheriae: diagnóstico da difteria.
▪ Difteria: doença bacteriana, transmissão respiratória ou contato.
▪ Coloração Albert-Layborn: lugol forte revela grânulos em bacilos 
diftéricos.
Tipos de coloração menos empregadas
Coloração de Fontana-Tribondeau
▪ Coloração Fontana-Tribondeau: método de impregnação prateada para 
visualizar bactérias espiraladas.
▪ Bactérias como Leptospira e treponemas são inadequadamente 
coradas por Gram.
▪ Processo envolve fixação, mordente, nitrato de prata, resultando em 
espiroquetas marrons sobre fundo claro.
▪ Microscopia de campo escuro é preferida na atualidade para essas 
bactérias finas e espiraladas.
Tipos de coloração menos empregadas
Coloração para os flagelos
▪ Flagelos bacterianos, estruturas de locomoção, compostos por 
flagelinas.
▪ Coloração envolve cultivar bactéria, preparar lâmina com água 
destilada e aplicar mistura de corantes (fucsina e ácido tânico).
▪ Ácido tânico aumenta diâmetro dos flagelos, tornando-os visíveis ao 
microscópio.
▪ Processo delicado para evitar despolimerização dos flagelos.
Tipos de coloração menos empregadas
Coloração para os esporos
▪ Esporos bacterianos: parede espessa, resistentes a condições 
adversas.
▪ Coloração envolve uso de verde de malaquita e aquecimento 
para corar esporos em verde intenso.
▪ Esporos não são descorados por álcool; contracorante 
safranina facilita diferenciação.
▪ Protocolo inclui fixação, aquecimento com verde malaquita e 
aplicação de safranina para visualização.
Tipos de coloração menos empregadas
Coloração para cápsula
Cápsula bacteriana: estrutura 
antifagocitária, composta por 
açúcares ou polipeptídeos.
Dificuldade de visualização 
devido à remoção na coloração e 
contração celular pelo calor.
Tinta-da-china: coloração 
negativa, onde cápsula rejeita 
corante, destacando 
microrganismos descorados 
envoltos por um halo.
Protocolo inclui cultivo em caldo 
rico, aplicação da tinta-da-china 
e observação microscópica.
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