Relatório-Técnicas de Coloração de Gram

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UNIVERDIDADE ESTÁCIO DE SÁ
CAMPUS – PETRÓPOLIS/RJ
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSOR(A): NATÁLIA CADAXO ROCHAEL 
RELATÓRIO SOBRE IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM
DATA: 01/05/2023
ALUNOS:
LARA REIS ZAINOTTE
REBECA MAYER MACHADO
SHIRLEI MILITÃO DA SILVA
RIO DE JANEIRO – 2023
SUMÁRIO:
I. INTRODUÇÃO ---------------------------------------------------------------------03
II. OBJETIVO--------------------------------------------------------------------------03
III. MATERIAL ------------------------------------------------------------------------03
IV. MÉTODO ---------------------------------------------------------------------------05
V. RESULTADOS E DISCUSSÕES -----------------------------------------------07
VI. CONCLUSÃO ---------------------------------------------------------------------08
VII. BIBLIOGRAFIA-----------------------------------------------------------------09
1. INTRODUÇÃO: 
O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram. 
Por volta de 1884, o médico bacteriologista e farmacologista dinamarquês, Hans Christian Joachim Gram, descobriu, em suas pesquisas, que as bactérias poderiam ser divididas em dois grandes grupos, partindo da observação da maneira como as bactérias reagiam a agentes descolorantes, no caso, o álcool. Suas conclusões foram baseadas na quantidade de lipídios que diferentes bactérias possuíam em suas membranas, de tal modo que isto influenciaria na coloração final após a utilização do álcool. Trata-se, portanto, de um método para diferenciar as bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas.
Em geral, são necessárias colorações biológicas para a visualização de bactérias de modo adequado e demonstração dos detalhes finos das suas estruturas. O advento da coloração representa, em grande parte, o fundamento dos principais avanços produzidos em microbiologia clínica e em outros campos da microscopia diagnóstica durante os últimos 100 anos.
A maioria das colorações utilizadas em bacteriologia tem por finalidade o diagnóstico presuntivo rápido do processo infeccioso e também a prévia avaliação da qualidade da amostra. A coloração de Gram é o método bacterioscópico mais importante e mais utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade é a classificação de microrganismos com base em suas características tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular. 
As bactérias são classificadas basicamente em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas. No que diz respeito às características tintoriais, as bactérias Gram-positivas coram-se de roxo e as bactérias Gram-negativas coram-se de rosa. 
A detecção de microrganismos na amostra é de suma importância, uma vez que pode Materiais e Métodos indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de patógenos e, também, a necessidade da realização de cultura com finalidade diagnóstica e/ou epidemiológica.
Portanto com o procedimento permite que as bactérias retenham a cor por meio de suas diferenças químicas e físicas que permitindo aumentar o contraste entre elas e facilitar a estrutura bacteriana. Assim, com a técnica é possível identificar a forma da bactéria, a cor que consegue absorver nas paredes, espécie. É feito em laboratório e muito importante para identificar qual é a patologia, caso algum individuo seja portador. 
2. OBJETIVOS: 
A coloração de Gram é utilizada para classificar bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratório de microbiologia clínica é um teste adicional rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, sendo também utilizado para avaliar a qualidade da amostra clínica analisada.
A coloração de Gram serve para classificar as bactérias em:
· Bactérias Gram-positivas: são visualizadas com a coloração azul devido ao fato de não serem descoradas pelo álcool, uma vez que possuem parede celular mais espessa e os seus poros contraem-se quando expostos ao lugol;
· Bactérias Gram-negativas: são visualizadas com a coloração rosa/roxo devido ao fato de serem descoradas pelo álcool e coradas pela safranina ou fucsina.
3. MATERIAL:
Durante o procedimento técnico da Coloração de Gram foram utilizados materiais específicos, a fim de garantir uma ação prática segura e estéril para evitar contaminação das amostras: 
- Água Destilada
- Culturas bacterianas previamente semeadas
- Alça bacteriológica 
- Lâmina de vidro limpa e desengordurada
- Bico de Bunsen
- Pegador de lâmina 
- Pipeta Pasteur 
- Corantes de Gram
- Solução salina 
- Papel absorvente
- Óleo de imersão
- Microscópio
3.1.1 Corantes de GRAM: 
· Cristal violeta: (cristal violeta, oxalato de amônio e álcool etílico); 
· Mordente: Lugol 1% (Iodeto de potássio, iodo, álcool etílico);
· Descorante: Álcool etílico e acetona;
· Contra corante: Fucsina fenicada (Fucsina básica, fenol, álcool etílico).
4. MÉTODO:
O Método utilizado pelo grupo consistiu no seguinte procedimento:
4.1. Tipo de Procedimento:
4.1.1. Procedimento Técnico:
 Foi utilizado uma lâmina limpa, esterilizada dentro da zona de segurança do bico de Bunsen, onde adicionou-se com a alça bacteriológica devidamente aquecida até ao ponto de incandescência, uma amostra do inóculo do meio de cultura e espalhou-se na lâmina.
4.1.1.1. Tipo de Amostra:
 	Amostras previamente coletadas da Bancada do Laboratório com swab, inoculadas em meio de cultura e incubadas em estufas. 
- Placa 01: Amostra da Bancada
4.1.1.2. Técnicas para o preparo do esfregaço
Identificamos a lâmina de maneira segura; e rolamos toda a superfície do swab sobre a lâmina com cuidado para não destruir a amostra. 
 Para a fixação da bactéria à lâmina secamo-las lentamente utilizando o Bico de Bunsen.
Com o esfregaço preparado, partimos para a parte da Coloração utilizando os Corantes.
4.1.1.3. Coloração
· 1ª Parte: Adiciona-se cristal violeta, corante principal, de modo a cobrir todo o esfregaço durante um minuto. Lava-se o esfregaço com água para retirar o excesso de cristal violeta da amostra até que não mais seja observada a coloração roxa na água.
· 2ª Parte: adiciona-se o Lugol, que possui a função de mordente, aumentando a afinidade do corante pela célula, de modo a cobrir todo o esfregaço durante 45 segundos. Após o tempo determinado, lava-se com a água novamente.
· 3ª Parte: Em seguida, adiciona-se o álcool-cetona, com a função de desidratar os carboidratos existentes na parede celular de bactérias Gram-positivas e reter o corante primário. Vale lembrar que sua adição deve ser rápida e precisa, durando de 5 a 10 segundos. Após, lava-se novamente a amostra com água.
· 4ª Parte: Adiciona-se Fucsina diluída, corante secundário, que irá corar as células anteriormente descoradas com o álcool-cetona. Sua ação deve ser de 30 segundos.
Por fim, lava-se com água novamente e deixa a lâmina que contém a amostra secar delicadamente em temperatura ambiente de modo a retirar qualquer excesso de água. 
4.1.2. Procedimento Analítico
4.1.2.1. Microscopia
 	Após a amostra seca aplicou-se algumas gotas de óleo de imersão na mesma e levou-se ao microscópio para a leitura.
Observou--se a diferenciação das bactérias Gram-positivas das Gram-negativas ao microscópio óptico, utilizando a lente objetiva de imersão
(Observação: só deve colocar o óleo de imersão na última lente, se não vai sujar as outras lentes em função da altura.)
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES:
Após a realização do experimento conseguimos realizar uma identificação da infecção bacteriana determinando qual o tipo de bactéria, se seria Gram-Positivas ou Gram-Negativas. 
Ao decorrer de todo processo conforme conseguimos identificar nas imagens acima, a amostra se caracterizou em bactérias do tipo Cocos Gram-negativas que resulta em um tom rosado contendo uma parede de peptideoglicano mais fina que não retém o cristal violeta durante o processo de descoloração
6. CONCLUSÃO:
A coloração de Gram demonstrou ser um importante método para distinçãodos dois grandes grupos de bactérias, as Gram positivas e Gram negativas. Tal distinção é possível através da observação da cor obtida ao final da técnica de coloração de Gram, sendo que as bactérias Gram positivas adquirem coloração violeta, enquanto que as bactérias Gram negativas, coloração rosa. 
As colorações obtidas são explicadas pelas diferenças na composição das paredes celulares bacterianas. Vale ressaltar que o formato das bactérias, bem como sua coloração, é determinante para identificação clínica da bactéria analisada, facilitando o diagnóstico.
Apesar de que nem todas as bactérias possam ser diferenciadas através da coloração de Gram, a metodologia é de suma importância no diagnóstico clínico e pesquisa biológica. Auxiliando os médicos a propor ao paciente um tratamento eficaz e adequada para a doença.
7. BIBIOGRAFIA
BRASIL. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica para o Controle de Infecções Hospitalares. Acesso em: 21 de maio de 2020. 
BRASIL. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecções em Serviços de Saúde. Disponível em :< https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_microbiologia_completo.pdf>.
 Acesso em: 01 de maio de 2023.
MAZA. LM de la, Pezzlo MT, Baron EJ. Atlas de Diagnóstico Microbiológico. Porto Alegre: Artmed, 2001. 216 p. 
OPLUSTIL CP, ZOCCOLI CM, TOBOUTI NR, SINTO SI. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. São Paulo: Sarvier, 2000. 254 p. 
PILONETO M, PILONETO DV. Manual de Procedimentos Laboratoriais em Microbiologia - POPs em Microbiologia. Microsciense, Curitiba, 1998.
RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R.; Microbiologia prática: roteiro e manual; Atheneu; 1993; 5-8pp.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10 ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. p. 70
WALTERS NJ, ESTRIDG BH, REYNOLDS AP. Laboratório Clínico: Técnicas Básicas. 3.ed. Porto Alegre: Artmed, 1998