LABORATORIO GENET HIBRIDIZACAO

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RELATÓRIO DE PRÁTICA VIRTUAL
	IDENTIFICAÇÃO
	1. Acadêmico: ERICA BERNARDINO DA SILVA
	2. Matrícula: 3340940333333333333333409403333/ 33340940 3340940 40940 
	3. Curso: BIOMEDICINAiomedicina 
	4. Turma: FLC8739BBI
	5. Disciplina: GENÉTICA HUMANA E MEDICA
	6. Tutor externo: LARISSA
	DADOS DA PRÁTICA
	1. Título: HIBRIDIZAÇÃO
	2. Semestre: 5
	3. Data: 20/03/23 PRATICA IV (FISH e CGHarray)
	INTRODUÇÃO
	
 A hibridização é uma técnica que tem o princípio da complementariedade das bases nitrogenadas dos ácidos nucleicos como base (adenina com timina e citosina com guanina). Essa técnica consiste, de forma básica, em localizar sequências de interesse no genoma de quaisquer organismos, hibridizando-as ao próprio DNA da espécie.
 Em cromossomos, podem ser feitas a hibridização in situ fluorescente (FISH) ou a hibridização genômica comparativa (CGH); em sequências diretamente dispostas sobre uma lâmina, a hibridização genômica comparativa de array (CGH array). Suas aplicações médicas e biológicas são diversas. Na FISH, as sondas podem ser constituídas de microssatélites, de loci específicos, ou, ainda, de cromossomos inteiros. Os microssatélites podem ser constituídos por: fragmentos de DNA; diferentes tipos de subunidades de RNA (5S e 18S, por exemplo); ou sequências encontradas nos telômeros (estruturas responsáveis por proteger o final dos cromossomos da degradação durante a replicação do DNA). Esse tipo de sonda é formado por sequências curtas de material genético repetitivo organizado em tandem (ou seja, sequências que ficam uma ao lado da outra), capaz de indicar, de forma simplificada, eventos como heterocromatização genômica e movimentação de RNA, além de fissão e fusão cromossômica.
	OBJETIVOS
		Este experimento permite aprender como as técnicas de hibridização in situ fluorescente (FISH) e genômica comparativa (CGH) são realizadas em cromossomos. Além disso, também permite conhecer a técnica de hibridização genômica comparativa de array (CGHarray). 
	MATERIAIS
		2x SSC; • Álcool a 70%, 90% e 100%; • Amostra DNA referência e DNA teste; • Berço lâmina; • Braçadeira metálica; • Câmara úmida; • Chapa de aquecimento; • Estufa bacteriológica; • H2O destilada; • Hipoclorito de sódio; • Lâmina de vidro e Lamínula a CGH; • Micropipeta 10 µL; • Microscópio de fluorescência; • Notebook; • Óleo de imersão; • Pinça metálica; • Scanner; • Silicone; • Solução DAPI/antifade; • Solução de lavagem 1; • Solução de lavagem 2; • Sonda. 
 Colocar EPI jaleco, mascara, luva, mascara
	METODOLOGIA
	Método de FISH
Prepara lâmina 
5µL da sonda na lâmina colocar, lamínula e selar o material
Levar a lâmina para a chapa de aquecimento 75graus por 5 minutos retirar a lâmina e colocar na câmara úmida levar para a estufa e ligar e deixar por 24hrs, retirar da estufa a câmara e retirar a lâmina e tirar a lamimula
Lavar a lâmina na solução 2ssc por 2 minutos e depois lavar com água 20 segundos e passar a lâmina no álcool 70% 1 minuto retirar, passar no álcool 90% por 1 minuto, passar no álcool 100% por 1 minuto retirar e deixar secar
colocar 10µL de DAPI(antifade)
Serve para manter a fluorescência e depois colocar a lamínula levar para o microscópio
No microscópio aparece pedaços de sondas fluorescentes rosas, roxas, vermelhas,verdes na lente de 100x.
Método Array CGH (aCGH). 
Prepara lâmina 
Colocar 10µL na lâmina e colocar amostra teste de DNA colocar a lâmina na braçadeira e fechar 
Colocar na chapa de aquecimento 60 graus e 20 Rpm por24hrs
Retirar a lâmina da braçadeira e colocar a lâmina no berço lavagem 1 colocar a lâmina na cuba e no aquecedor por 5 minutos retirar e remover e colocar na 2 solução e colocar no aquecedor 37 graus por 20 Rpm por 5 minutos
Retirar a lâmina e espera secar colocar no scaner ligar o computador aparece variar fluorescência
Aparece o gráfico da análise dos cromossomos
Deleção gene ABR
Cromossomo 6
	RESULTADOS E DISCUSSÕES
	1. Qual a diferença do método FISH para o Acgh
FISH Ela permite detectar aberrações estruturais complexas e translocações escondidas, porém não é capaz de identificar mutações pequenas. Visualmente, mostra todos os pares de cromossomos de determinada espécie em cores diferentes em um único experimento de hibridização.
Acgh a técnica de CGH array é capaz de rastrear genes dentro de amplicons ou regiões consistentes de deleção, possibilitando a triagem automatizada de alta resolução para desequilíbrios cromossômicos. Também é possível identificar alterações em uma única cópia de células tumorais, ou rastrear doenças durante exames pré natais 
2. Quais são as aplicações para esses dois métodos? 
 
técnica de hibridização pode ser detectada de forma direta ou indireta. Na detecção direta, a sonda é marcada com fluorocromo, que, após a hibridização, já pode ser visualizado em microscopia de epifluorescência. Por outro lado, na detecção indireta, são usados anticorpos que se ligam ao fluorocromo após a hibridização, para que ele seja detectado (como exemplo, pode-se citar o sistema biotina-estreptoavidina
	REGISTRO FOTOGRÁFICO
	REFERÊNCIAS
	Laboratório virtual
	
	REFERÊNCIAS
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