Relátorio aula prática. Extração DNA. PRONTO

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CENTRO UNIVERSITÁRIO SAGRADO CORAÇÃO
FELIPE MATHEUS DA CUNHA
LÍVIA PREVIDELLO POPOFF
MARIA EDUARDA GONÇALVES MACHADO
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA:
EXTRAÇÃO DNA
ELETROFORESE – VISUALIZAÇÃO DO DNA (EXTRAÍDO)
PCR – PREPARAÇÃO DO MIX 
Bauru
2020
FELIPE MATHEUS DA CUNHA
LÍVIA PREVIDELLO POPOFF
MARIA EDUARDA GONÇALVES MACHADO
RELATÓRIO AULA PRÁTICA: EXTRAÇÃO DNA
ELETROFORESE – VISUALIZAÇÃO DO DNA (EXTRAÍDO)
PCR – PREPARAÇÃO DO MIX 
Relatório de Aula Prática apresentado a disciplina de Biologia Molecular ministrada pela Prof. Dra. Ana Paula F. T. Garlet 
Bauru
2020
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO	4
2. MATERIAL E MÉTODO	5
2.1 MATERIAIS	5
2.2 MÉTODOS	5
2.3.1 EXTRAÇÃO DNA	5
2.3.2 ELETROFORESE-VISUALIZAÇÃO DO DNA (EXTRAÍDO)	5
2.3.3 PCR-Preparação do Mix-Termociclador	6
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO	6
4. CONCLUSÃO	8
REFERÊNCIAS	9
1 INTRODUÇÃO
	A biologia molecular surge aproximadamente no meio do século XX, onde foi validado o ácido desoxirribonucleico (DNA), que carrega o código genético da célula, enquanto o ácido ribonucleico (RNA), tem o trabalho de transmutar esse código em sequências definidas de aminoácidos em proteínas (De FARIAS, 2006). Desta forma, tendo a informação biológica estava armazenada (Referência), a segunda foi o desenvolvimento da ideia de um gene uma enzima (BEADLE e TATUM, 1941 citado por DE FARIAS, 2006). 
	No processo de extração do material ocorre o retiramento de DNA ou RNA, que pode ser efetuado em diversos tipos de organismo e por meio de distintos tipos de amostra é possível visualizar vários métodos para a realização do processo, isto é, cada amostra terá sua concentração e procedimento (ROSA, 2008).
 	 Possui alguns tipos de eletroforese, como, por exemplo, eletroforese livre, eletroforese com suporte, eletroforese em gel de agarose, eletroforese em gel de poliacrilamida, eletroforese nativa, eletroforese em condições desnaturantes e eletroforese capilar. A eletroforese é uma técnica de divisão que tem um direcionamento para a migração de moléculas, onde a eletroforese apresenta o movimento de colóides por meio de uma influência de um campo elétrico. Sendo assim, um método utilizado na separação e purificação macromoléculas, especialmente em relação aos ácidos nucleicos e proteínas que são expostos a um campo elétrico, que no processo acabam migrando para um polo positivo ou negativo que é referente a sua carga (MORAES et al.)
	A reação de polimerase em cadeia,é uma técnica usada para aumentar continuamente um segmento de DNA particular em diversas ordens de grandeza, que ocasiona em muitas cópias de tal sequência de DNA. Apresentando o avanço tecnológico e vem conquistando espaço no meio clínico e laboratorial, por conta das pesquisas, pois é uma técnica que tem uma capacidade de gerar, eficiência e rapidez (ROSA, 2008;VALONES et al., 2009).
2. MATERIAL E MÉTODO
	
2.1 MATERIAIS
	Os materiais utilizados foram: Pellet de leucócitos, Solução TM2, Solução SDS 10%, Solução de dNTPS, Solução de MgCl2 50Mm, Solução de Oligo F 10μm, Solução de Oligo R 10μm, Solução de Taq Recombinant 5U/μL, Solução de DNA, Pipetas automáticas: AP1000, AP 200, AP100 e AP10, Ponteira plástica 1000μL, Ponteira plástica 100μL, Ponteira plástica 10μL, Eppendorf 2ml, Eppendorf 1,5ml, Tubo Falcon 15ml, Solução NaCl 5M, Solução Etanol absoluto, Solução Orange Loading buffer 10x, Gel de Agarose (pronto), Cuba de Eletroforese, Estufa, Água DNAse e RNAse Free, Termociclador.
2.2 MÉTODOS
2.3.1 EXTRAÇÃO DNA	
	Acrescentou-se ao Pellet de leocócitos 1,6ml de Solução TM2, elevando as células, em seguida acrescentou-se 160μL de solução SDS 10% e vortexar.Incubou-se em banho-maria por um período de quinze minutos, a uma temperatura de 56°C graus, em seguida foi incorporado 480μL de solução de NaCl 5M gelado e estimulado.	A solução foi transferida a um Tubo de Eppendorf 2ml e centrifugada em um período de cinco minutos a uma velocidade de 12.000rpm.Foi retirado o sobrenadante e transferido para um Tubo Falcon de 15ml, em seguida adicionou-se 5ml de Etanol absoluto gelado. O tubo foi vedado em seguida homogeneizado por inversão, até que ocorresse a precipitação do DNA.	Com uma Pipeta automática AP200, o DNA foi retirado e transferido para um tubo de Eppendorf de 1,5ml e seco na estufa em uma temperatura equivalente a 50°C graus no período de cinco minutos. O DNA foi ressuspendido em 200μL de água DNAse e RNAse Free e incubado em banho-maria em uma temperatura de 56°C graus no período de dez minutos.
Armazenou-se o DNA a -20°C graus, até que estivesse pronto para o uso.	 
2.3.2 ELETROFORESE-VISUALIZAÇÃO DO DNA (EXTRAÍDO)
	As amostras do DNA foram preparadas e aplicadas no gel, adicionando-se a um Eppendorf 5μL de DNA+ 4μL de água DNAse e RNAse Free + 1μL de Solução Orange Loading Buffer 10%. Em seguida as amostras foram aplicadas no Gel de Agarose (gel pronto).
	No momento em que de iniciar a corrida, a tampa da Cuba de Eletroforese foi fechada, e foram conectados os eletrodos, a fonte foi programada para 110V e assim, iniciou-se a corrida.
2.3.3 PCR-Preparação do Mix-Termociclador
	Preparação de uma mistura chamada Master Mix, que conterá todas as substâncias necessárias à síntese de novas cópias de DNA.
	Foram utilizados no procedimento de preparação do Mix PCR 28,5μL de Água DNAse e RNAse FREE, 5μL de Solução PCR BUFFER 10X, 5μL de Solução de dNTPS 10mM, 2μL de Solução de MgCl2 50mM, 2μL de Solução de Oligo F 10μm, 2μL de Solução de Oligo R 10μm, 0,5μL de Solução de Taq Recombinant 5U/μL e 5μL de Solução de DNA.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
	Extrair DNA é uma operação que abrange os fatores de quebra das células, procedimento autodenominado lise celular, expondo o DNA interno, remoção da membrana lipídica, adição de detergente e remoção das proteínas. 	 Após a precipitação do DNA com etanol absoluto gelado, os instrumentos manuseados na extração, são: equipamento de eletroforese em gel e centrífuga. O eletroforese em gel é utilizado para separar DNA enviando cargas através de gel de agarose. Um "bead beater" é usado para romper ou dividir as células para acessar o material genético, e a centrífuga gira a velocidades acima de 15000 rpm para ajudar a separá-lo em diferentes fases de extração.
	Duração dos ciclos de temperatura: Descrição da programação do termociclador passo a passo: 
I. Denaturação inicial: 4 minutos a 95ºC;
II. Denaturação: 1 minuto a 95ºC ;
III. Anelamento: 1 minuto operando na temperatura de anelamento específica do primer, podendo ser aumentada até 90 segundos;
IV. Extensão: Temperatura ótima da enzima. Para a Taq, utiliza-se 1 minuto a 72ºC, podendo ser aumentada até 2 minutos de acordo com a quantidade utilizada, o número de ciclos e o tamanho do produto desejado;
V. Extensão Final: Após o término dos ciclos, costuma-se acrescentar um passo de 4 minutos a 72ºC, como oportunidade adicional para a polimerase agir;
VI. Final: Programa-se o termociclador para um hold, de 0 a 4ºC, para manter as amostras conservadas até o momento de estocagem.
	DNA Polimerase, Buffers (Soluções-Tampão) e MgCl2: A DNA polimerase escolhida deve sempre operar sob as condições de reação instituídas e mantidas pelos tampões específicos, além de ser ativada pela presença de um íon metálico específico, e de obrigatoriamente ser termoestável. A Taq é a DNA polimerase mais utilizada em reações convencionais, são diretamente responsáveis pela atividade da enzima. Primers: Antes das etapas experimentais, deve-se planejar cuidadosamente a seqüência e algumas características dos primers Além da complementaridade, um ponto importantíssimo da natureza deste reagente é o seu Ponto de Fusão Médio, denominado Tm (Temperature of Melting), que é a temperatura na qual metade dos iniciadores está anelada às fitas de DNA e a outra livre na solução. Para cada par de primers que é utilizado, um Tm diferente é determinado. Dois componentes do par (Sense e Antisense Primers) devem possuir Tm igual ou muito próximo para evitar alguns problemas na reação. A partir do valor de Tm podemos determinaro Ta, que é a temperatura ótima de reação do par de primers. 	DNA Molde: Sua concentração deve ser adequada às condições da reação. Produtos inespecíficos podem indicar excesso de template nas reações. A lise consiste no tratamento das membranas celulares com detergentes SDS (Sodium Dodecyl-Sulphate) assim, todo o conteúdo citoplasmático torna-se livre na solução etanol 70% gelado, precipitando totalmente as cadeias de ácido nucléico em centrífuga. MgCl2: Obrigatório para o funcionamento da enzima. dNTP’s: Utiliza-se uma solução estoque de 10mM em água e pH 7,0 de todos os dNTP’s utilizados (ATP, TTP, CTP e GTP) em concentrações iguais. Adiciona-se à reação uma quantidade suficiente para se obter uma concentração final entre 20 e 200µM, dependendo também do tamanho do segmento que se quer amplificar e da duração da reação.
	 Normalmente a concentração final de deoxinucleotídeos na reação é ajustada para 25µM Outros Componentes foram, os tampões de reação, fornecidos juntamente com as polimerases, possuem uma grande diversidade de componentes, normalmente, os tampões possuem um pH a 20ºC entre 8,3 e 8,8. Possuem Tris (Tris(hidroximetil)aminometano), importante para o tamponamento, NaCl, KCl, e outros reagentes.
4. CONCLUSÃO 
	 Concluindo que os resultados obtidos não foram mais aprofundados, devido a escassez de tempo, impossibilitando uma melhor observação ou coleta de dados mais satisfatória. Além de que, os procedimentos foram realizados de maneira a permitir o entendimento dos alunos para com a matéria, demonstrando tanto a eficácia dos procedimentos quanto o material extraído. Foi possível visualizar o material e o procedimento, pois foi realizado de maneira didática.
REFERÊNCIAS 
MORAES, C. S. et al., Série em Biologia Celular e Molecular Métodos experimentais no estudo de proteínas. Rio de Janeiro: IOC- Instituto Oswvaldo Cruz. v.1. p. 84.2013.
DE FARIAS, S. T.. AMINOACIL-TRNA SINTETASES, O CÓDIGO GENÉTICO E A ORIGEM DA VIDA. Belo Horizonte. Departamento de Biologia Geral Instituto de Ciências Biológicas. 2006.
ROSA, D. D.. Método rápido de extração de DNA de bactérias. Summa phytopathol.,  Botucatu ,  v. 34, n. 3, p. 259-261,  Sept.  2008  
VALONES, M. A. A. et al . Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: a review. Braz. J. Microbiol.,  São Paulo ,  v. 40, n. 1, p. 1-11,  Mar.  2009.