AULA 2 METODOS DE ESTUDO DA CELULA _PARTE 1

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

TEMA: MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA 
CELULAR E MOLECULAR 
MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR E 
MOLECULAR 
• Os primeiros estudos da célula foram iniciados no
séc. XVII com a utilização de microscópios
rudimentares de luz , idealizados por Robert Hooke
(1635-1703), que foram utilizados para observar as
primeiras células vegetais.
• O aperfeiçoamento dos sistemas ópticos concorreu
para o melhoramento da resolução dos microscópios
e para o desenvolvimento dos diversos tipos de
microscópios com maior definição.
MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR E 
MOLECULAR 
• Actualmente, os microscópios ópticos possuem
características especificas, que lhes permitem
visualizar os mais minuciosos aspectos das
particularidades das células.
• O aparecimento dos microscópios electrónicos
(TEM) e de varrimento (Scanning) com poderes de
resolução muito elevados e com sistemas de registo
de imagens, inicialmente fotográficos e
posteriormente digitais, permitiu um avanço no
conhecimento das células e das suas estruturas,
bem como a identificação de outras que a
microscopia de luz até então, não tinha conseguido
visualizar.
O Desenvolvimento de técnicas de preparação laboratorial
para a visualização dos materiais biológicos permitiu o
aparecimento de diversos tipos de microscopia:
• Microscopia óptica (200 nm) 
– Campo claro 
– Fluorescente 
– Avançada: 
• Microscopia Confocal 
• Microscopia de contraste fases, etc. 
• Microscopia electrónica (1 nm) 
– Transmissão (TEM) 
– Varrimento ou Scanning (SEM)
MICROSCOPIA 
• Microscópio óptico composto
• Microscópio de luz ultravioleta 
• Microscópio de fluorescência 
• Microscópio petrográfico 
• Microscópio de campo escuro 
• Microscópio de contraste de fases 
• Microscópio de luz polarizada 
• Microscópio Confocal 
• Microscópio electrónico 
TIPOS DE MICROSCÓPIOS 
• Microscópio electrónico de 
transmissão
• Microscópio electrónico de 
varrido 
• Microscópio de iões em
campo 
• Microscópio de sonda
• Microscópio de efeito túnel 
• Microscópio de força atómica 
• Microscópio virtual 
• Estéreo Microscópio 
UNIDADES DE MEDIDA EM CITOLOGIA 
• Comprimento 
– μm (micra o micrómetro) = 10 -3 mm 
• (milésima parte do milímetro) 
– nm (nanómetro) = 10 -6 mm 
• (milésima parte do micrómetro) 
– Ä (Ängstrom) = 10 -7 mm 
• (décima da milésima parte do 
micrómetro)
Servem para medir as células 
Servem para pesar as células
• Massa:
– mg (miligrama) = 10 -3 g 
– μg (micrograma) = 10 -6 g 
– ng (nanograma) = 10 -9 g 
– pg (picograma) = 10 -12 g 
– Da (dalton) = peso de um átomo de hidrogénio 
• Ex: H2O = 18 Da 
– kDa (quilodalton) = 103 Da 
• Ex: Hemoglobina = 64,5 kDa ou 64 500 Da 
UNIDADES DE MEDIDA EM CITOLOGIA
O MICROSCÓPIO ÓPTICO 
MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO
A luz passa através da amostra fazendo com que a área observada seja
bem iluminada. O feixe de luz passa através da amostra e é captado pela
objectiva. O microscópio usado pela maioria dos estudantes e
pesquisadores é o microscópio de campo claro.
É usada para o exame de rotina de laminas histológicas, visualização de
tecido de células, microrganismos, etc. nos laboratórios de analises clínicas
e pesquisa.
MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO
Alguns raios luminosos incidem na amostra e são captados pela lente
objectiva gerando figuras luminosas num campo escuro.
É indicada para amostras com pouco contraste. Na pratica clínica o
microscópio de campo escuro serve para examinar a existência de cristais
nas amostras de urina, como o acido úrico e oxalato e identificar bactérias
como Treponema pallidum (Sífilis).
Princípios da formação da imagem ao Microscópio 
Células da mucosa bucal
Com coloração 
fluorescente 
Com coloração 
Sem coloração 
Diferenças de 
índices de 
refracção 
Cores de 
interferência 
Campo 
escuro 
Microscopia de campo claro e sistema analisador 
de imagens 
• Sistema Analisador de 
Imagens - medidas manuais e 
automáticas, incluindo filtros de 
estruturas por forma, tamanho e 
cor. 
Preparação do espécime para microscopia de 
campo claro (cortes)
2001/2002 
Prof. Doutor José Cabeda 
MICRÓTOMO
http://www.esacademic.com/pictures/eswiki/50/250px-
Plagiomnium_affine_laminazellen.jpeg 
Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro 
Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro 
Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro 
Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro 
Aplicações da Microscopia 
de Campo Escuro
É empregue para estudos de 
pequenos materiais: 
 Plâncton 
 Bactérias 
 Cristais 
Microscopia de campo escuro 
da bactéria Leptospira spp 
• Permite a localização de moléculas específicas na célula
• Os corantes fluorescentes promovem uma marcação brilhante
contra um fundo escuro
•O corante pode estar directa ou indirectamente relacionado com a
molécula alvo da célula
•Podem ser utilizadas em simultâneo vários pigmentos
fluorescentes
• As células podem estar fixadas ou vivas.
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
• O microscópio de fluorescência usa a capacidade de algumas
moléculas em fluorescer sob luz ultravioleta visualizando
moléculas auto fluorescentes como a vitamina A.
• A excitação e a emissão de luz das moléculas fluorescentes
são reguladas por filtros para promover cor e contraste.
• É utilizada na deteção de antígenos ou anticorpos nos
procedimentos de coloração imunocitoquímicos.
• As moléculas fluorescentes também podem ser injectadas em
animais ou em células para serem usadas como rastreadores.
Tais métodos são usados para estudar as junções
intercelulares, rastrear fibras nervosas e detectar marcadores
de crescimento em tecidos mineralizados.
O MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA
TÉCNICAS AVANÇADAS DE MICROSCOPIA E 
FERTILIZAÇÃO 
• Num estudo publicado na Scientific Reports, investigadores da
Northwestern descobriram que quando o óvulo humano é activado por uma
enzima do espermatozoide, ocorre uma explosão de faíscas de zinco.
• O tamanho da erupção está directamente relacionada com a saúde do ovo
e a sua capacidade de se transformar num embrião viável.
• Para entender o mecanismo molecular da centelha de zinco os
investigadores podem recorrer a quatro abordagens físicas que resolvem
distribuições de zinco em células individuais:
– uma sonda química para imagens de fluorescência de células vivas
dinâmicas
– uma combinação de microscopia electrónica de transmissão com
espectroscopia de energia dispersiva,
– microscopia de fluorescência de raios -X
– tomografia elementar tridimensional para o mapeamento elementar de alta
resolução.
Espermatozoides humanos corados com
laranja de acridina.
Observação microscópica de fluorescência
para avaliar os danos do ADN.
Cabeças dos espermatozoides corados de
verde possuem ADN normal, enquanto que
a coloração laranja indica alteração do
ADN.
Células epiteliais 
em cultura, com 
coloração vermelha 
para a queratina e 
verde para o DNA. 
Foram utilizados três 
fluoróforos: 
• DAPI (emite luz azul) para 
marcar cromossomas 
• GFP (proteína verde 
fluorescente intracelular que 
emite luz verde) 
• rodamina (luz vermelha) para 
marcar os microtúbulos. Cada 
fluorocromo justifica a utilização 
de filtros específicos, 
dependendo do comprimento de 
onda necessário para excitação 
(indicado em cima e do lado 
esquerdo) escala expressa em 
nm. 
Micrografias de células em divisão celular, tiradas com um 
microscópio de fluorescência
MICROSCÓPIO CONFOCAL
MICROSCÓPIO CONFOCAL
Microscopia óptica de objectos 3D
 Microscopia de varrimento Confocal
– Gera imagens 3D de células vivas
– Remove imagens fora de foco
 seccionamento óptico
– Pode se fazer observações no interior de espécimes
espessos (ovos, embriões, tecidos)
Microscópio Confocal de
Raios Laser Cianobactéria
filamentosa Microcoleus
encontradas em solos de
terras áridas
em todo o
mundo
Aplicações da Microscopia Confocal a Laser
Células em prófase 
Células em apoptose: condrócitos 
Protozoário Macrófago 
Aplicações da Microscopia Confocal a Laser 
Aplicações da Microscopia Confocal a Laser 
Divisão celular / Fuso mitótico 
Grãos de Pólen 
• Permite a observação de células vivas transparentes
• Os desvios de fase induzidas pela luz através do espécime são utilizados
para gerar contraste.
– Contraste de fase (luz refractada e não refractada)
– Contraste de interferência diferencial (dois feixes de luz)
MICROSCOPIA ÓPTICA AVANÇADA 
MICROSCOPIA DE CONTRASTE INTERFERENCIAL 
MICROSCOPIA DE CONTRASTE INTERFERENCIAL 
Os prismas modificam a fase da onda luminosa
Contraste com o meio em que se encontra o material a ser
analisado 
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
Observação de materiais biológicos sem coloração:
1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices dos parasitas
(taxonomia)
2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material
biológico
3. Monitorização de culturas celulares 
Escamas
Algas
APLICAÇÕES DA MICROSCOPIA DE CONTRASTE 
INTERFERENCIAL 
Cultura Celular: macrófago Ácaro 
O microscópio de polimerização é uma modificação simples do microscópio 
óptico e possui
 2 Filtros ou Prismas: 
1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o espécime 
2º Analisador → Entre a objectiva e a ocular 
Promovem a seleção de apenas um plano de direcção de vibração das
ondas luminosas. Plano da luz polarizada (PLP)
Filtros: 
Observação:
Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de
vibração em todos os planos
MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO 
MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO 
2º 
1º 
APLICAÇÕES DA MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO
1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados
de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina
2. Análise de células que apresentem organização interna de
suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular
esquelética, espermatozoides (ordem molecular).
3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos
arranjos de macromoléculas: tecidos ósseos, cartilagens, etc
4. Análise de componentes cristalinos dos minerais
5. Outros: parede celular; amido.
Tecido ósseo 
Grãos de Amido 
Aplicações da Microscopia de Polarização 
Aplicações da Microscopia de Polarização 
Tecido ósseo : sistema de Havers 
ou ósteon / fibras colágenas 
Tecido ósseo: osso esponjoso / 
fibras colágenas 
Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada