Sequenciamento de Ácidos Nucleicos Clonagem Sequenciamento

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Climatologia e MeteorologiaClimatologia e MeteorologiaSequenciamento de Ácidos Nucleicos Clonagem/Sequenciamento
Curso: Engenharia Ambiental e Sanitária
São Luís
2024
INTRODUÇÃO
A tecnologia de microarranjos de DNA representa um dos últimos avanços na biologia molecular, na detecção e identificação de espécies, e para acessar a diversidade microbiana. Os microarranjos, ou chips de DNA, são lâminas sólidas, nas quais fragmentos de DNA fita simples, denominados de sondas, são depositados e imobilizados de forma ordenada e em áreas específicas, denominados spots. O princípio da técnica baseia-se na hibridização por complementaridade das moléculas de ácidos nucleicos com sondas depositadas na lâmina. Esta ferramenta representa grandes vantagens, pois em um único arranjo, milhares de oligonucleotídeos diferentes podem ser fixados num mesmo microchip, permitindo que milhares de genes sejam simultaneamente acessados. 
Os microarranjos podem conter tanto genes específicos como, por exemplo, os que codificam as proteínas ammonia monoxigenase, ou nitrogenase, obtendo assim informações sobre a diversidade funcional, ou podem conter padrões de amostras ambientais que representem as diferentes espécies encontradas nestas amostras (GREENE; VOORDOUW, 2003). O denominado phylochip, contendo 132 genes ribossômicos 16S marcados específicos para todas as linhagens conhecidas de procariotos redutores de sulfato foi desenvolvido e testado (LOY et al., 2002), e aplicado com sucesso em amostras ambientais e clínicas. Outra tecnologia baseada em microarranjos de DNA é o Geochip (HE et al., 2007), desenvolvido para detectar, caracterizar e quantificar micro-organismos em amostras ambientais. A última geração do Geochip contém aproximadamente 28.000 sondas, cobrindo 57.000 genes e 292 funções relacionadas aos ciclos de carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre, metabolismo energético, resistência a antibióticos e metais e degradação de contaminantes orgânicos
DESENVOLVIMENTO
O sequenciamento de amostras ambientais complexas como solo, água, sedimentos, fezes e trato gastrintestinal tem se tornado uma importante ferramenta para se entender a biodiversidade e suas relações ecológicas. Dentre as primeiras técnicas de sequenciamento, o denominado sequenciamento de Sanger imperou absoluto na ciência genômica ao longo dos 30 anos que se seguiram à sua publicação original. Esta técnica é baseada na incorporação de desoxinucleotídeos (dNTPs) e de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) a uma cadeia de DNA crescente, tendo como molde o DNA de interesse. 
O sequenciamento, juntamente com a PCR e clonagem, é um dos métodos utilizados para explorar a diversidade de comunidades naturais. Na clonagem, fragmentos de PCR são inseridos em um vetor de clonagem (geralmente um plasmídeo), gerando um plasmídeo recombinante. Células de E. coli competentes são transformadas com esse plasmídeo recombinante e suas células são plaqueadas em meio seletivo para a identificação dos clones positivos, ou seja, aquelas que possuem o fragmento de interesse. Esses fragmentos podem então ser rapidamente sequenciados.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Apesar do sequenciamento convencional de Sanger ter se mostrado mais eficiente no desenvolvimento de bibliotecas de clones, para a análise de amostras ambientais complexas havia a necessidade de se ler múltiplas sequencias alvo de DNA, em paralelo. Dessa forma, novas estratégias começaram a ser desenvolvidas para a produção de sequências genômicas de forma ainda mais massiva, mais rápida e mais barata do que utilizando os sequenciadores de eletroforese capilar baseados em didesoxinucleotídeos fluorescentes. Assim, começaram a ser comercializadas, em 2005, as denominadas tecnologias de sequenciamento de nova geração, as quais prometiam o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida, sem a necessidade de se produzir bibliotecas de clones para sequenciar o DNA. 
Apesar de as plataformas existentes utilizarem uma diversa gama de ferramentas químicas e de incorporação e detecção de bases, dois passos são comuns: fragmentação e preparação da biblioteca e detecção dos nucleotídeos incorporados (ZHANG et al., 2011). Estas tecnologias podem ser classificadas em dois grupos. Em um há a necessidade de se produzir amplicons por PCR, por exemplo, Roche 454 (Roche), HiSeq2000 (Illumina), AB Solid Systems (Life Technologies). O outro grupo de plataformas inclui aquelas onde não há necessidade de amplicação para o sequenciamento, como HeliScope (Helicos BioScience) e PacBio (Pacific BioSciences). As aplicações da NGS são ilimitadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de genomas, sequenciamento de cDNA (RNA seq) e metagenoma. No metagenoma, o material sequenciado é extraído diretamente do ambiente (shotgun metagenoma). Todo o DNA extraído da amostra é fragmentado e sequenciado. A análise busca tentar identificar, além da diversidade de genomas, novos genes. Estas técnicas têm mostrado a enorme diversidade e heterogeneidade de ambientes naturais. Para isso, o sequenciamento do gene 16S rRNA é considerado o método mais poderoso para a exploração da diversidade microbiana (MUYZER, 1999), tanto em amostras naturais quanto artificiais. A diversidade e a funcionalidade da microbiota de solos (CAPORASO et al., 2011), do trato gastrintestinal (ZOETENDAL; RAJILIĆ-STOJANOVIĆ; DE VOS, 2008), do microbioma da pele humana (FOULONGNE et al., 2012) e anticorpos de peixes (WEINSTEIN et al., 2009) têm sido avaliadas com estas técnicas.
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