Testes Imunológicos

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02/03/2023
Imunologia Clínica
Testes Imunológicos
Profª Dra. Brunna Robles
Abertura
Testes imunológicos
Detectar e quantificar ANTICORPOS e ANTÍGENOS
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Epitopos.png
DROGAS, HORMÔNIOS, ÁCIDOS NUCLÉICOS,
CITOCINAS, RECEPTORES DE CÉLULAS.
Anticorpos para detectar antígenos de algum patógeno
na amostra do paciente.
Antígeno para detectar anticorpos contra algum
patógeno na amostra do paciente.
Testes imunológicos
São testes que fornecer informações importantes para o
diagnóstico e cuidado clínico de pacientes.
Os usos de testes imunológicos incluem:
a) Confirmação de uma impressão clínica;
b) Diagnóstico precoce de uma doença;
c) Exclusão de determinada enfermidade;
d) Acompanhamento do progresso da doença;
e) Avaliação da efetividade da terapêutica.
https://vectorportal.com/pt/vector/teste-de-gravidez/25987
Testes imunológicos
VANTAGENS DO IMUNODIAGNÓSTICO.
Rapidez.
Simplicidade.
Possibilidade de automação.
Armazenamento de material biológico.
Baixo custo operacional.
Oferta de kits comerciais padronizados.
○ Interação antígeno x anticorpo
■ Especificidade
■ Afinidade
■ Avidez
■ Reatividade cruzada
○ Imunodiagnóstico
■ Reação de aglutinação
■ Imunodifusão
■ Quimiluminescência
■ Imunofluorescência
■ ELISA
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Interação antígeno x
anticorpo
Interação anticorpo x antígeno
Quais as características do reconhecimento dos antígenos pelos anticorpos?
ESPECIFICIDADE:
• É a habilidade do anticorpo em distinguir seu imunógeno de outros antígenos.
• Conceito de chave e fechadura.
https://www.fcav.unesp.br/Home/departamento
s/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8-
interacao-ag-ac-testes-sorologicos-primarios-e-
secundarios.pdf
Interação anticorpo x antígeno
Quais as características do reconhecimento dos antígenos pelos anticorpos?
AFINIDADE:
 Força de ligação do Ag com o Ac em um único sítio.
 Ac de alta afinidade estabelecem ligações fortes e mais duradouras.
 Ac de baixa afinidade ligam-se fracamente e dissocia-se com facilidade. https://www.fcav.unesp.br/Home/departament
os/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8-
interacao-ag-ac-testes-sorologicos-primarios-e-
secundarios.pdf
Quanto maior a afinidade do
anticorpo pelo antígeno, mais
estável será a interação.
Interação anticorpo x antígeno
AVIDEZ:
 Força resultante de interações múltiplas entre uma
molécula de anticorpo e os epítopos de um antígeno.
 Quanto maior a avidez, melhor seu efeito biológico
final (ex. reconhecimento de antígenos complexos
sobre a superfície de patógenos).
 A baixa afinidade de um Ac pode ser compensada
por sua elevada avidez.
https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8-interacao-
ag-ac-testes-sorologicos-primarios-e-secundarios.pdf
Quais as características do reconhecimento dos antígenos pelos anticorpos?
Interação anticorpo x antígeno
REATIVIDADE CRUZADA
 Habilidade de um anticorpo interagir com mais de um determinante antigênico.
 Dois antígenos diferentes apresentam epítopos estruturalmente semelhantes.
 Anticorpos específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não relacionado, mas com
propriedade química similares.
https://www.fcav.unesp.br/Home/departamento
s/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8-
interacao-ag-ac-testes-sorologicos-primarios-e-
secundarios.pdf
Interação anticorpo x antígeno
CONCENTRAÇÕES RELATIVAS DE ANTÍGENO E ANTICORPO
 Zona de equivalência: precipitação máxima.
 Efeito pró-zona: quando a quantidade de anticorpos presente
na amostra de soro puro é desproporcional em relação à
quantidade de antígeno do teste. https://www.fcav.unesp.br/Home/departamen
tos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8-
interacao-ag-ac-testes-sorologicos-primarios-e-
secundarios.pdf
Reações de aglutinação falsamente
negativas em soros com elevado título
de anticorpos aglutinantes.
Efeito eliminado diluindo o soro (ex:
1/4).
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Imunodiagnóstico:
-Reação de aglutinação
- Imunodifusão
Imunodiagnóstico
Ensaios imunológicos se baseiam nas interações entre
antígenos e anticorpos, formando complexos Ag-Ac:
https://sml.snl.no/antistoffer
PRIMÁRIOS: detectam a interação
direta entre antígeno e anticorpo.
 Imunodifusão
 Aglutinação
 Precipitação
 Fixação de Complemento
 Imunofluorescência
 Radioimnoensaio
 Quimioluminescentes
 Enzimáticos
SECUNDÁRIOS: detectam conseqüências
da interação antígeno e anticorpo –
mudanças no estado físico do antígeno.
Reação de aglutinação
 Formação de agregados visíveis (floculação celular) 
interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis
(látex) que contém determinantes antigênicos na
superfície.
 Sensível, de fácil execução e baixo custo.
 Boa especificidade e reprodutibilidade.
 Baixa sensibilidade e pouca estabilidade Ag-Ac.
Diagnóstico: doenças auto-imunes; detecção de
hormônios e tipagem de grupos sanguíneos
https://www.ufrgs.br/lacvet/sit
e/wp-
content/uploads/2013/05/veig
a_compara%C3%A7aoCRP.pdf
Reação de aglutinação
https://pt.wikipedia.org/wiki/Tipagem_sangu%C3%ADnea#/
media/Ficheiro:ABO_sangre_tipo.svg
https://saude.rs.gov.br/upload/arquivos/carga20180626/2516
2613-conceitos-basicos-em-imunohematologia-lais-garcia-
hospital-de-clinicas-de-porto-alegre.pdf
AGLUTINAÇÃO DIRETA
O antígeno (agregados visíveis) faz parte naturalmente da célula, e
haverá aglutinação dessas células promovida por anticorpos contra
esses antígenos (hemácias, bactérias, fungos, protozoários – podem ser
aglutinados diretamente pelos ac).
Ex: toxoplasmose, tipagem de grupos sanguíneos, mononucleose infecciosa.
Aglutinina 
Aglutinogênio
Reação de aglutinação
Adsorção de anticorpos ou antígenos solúveis protéicos
ou polissacarídeos na superfície de micropartículas
inertes (suportes) que não interferem na interação
antígeno-anticorpo (látex, gelatina).
Ex: látex (partículas de látex revestidas com antígeno específico)/
ASO – Antiestreptolisina O/ Fator reumatoide / Proteína C Reativa
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd07_08.pdf
AGLUTINAÇÃO INDIRETA
Ocorrem interação entre uma partícula inerte e recoberta
de antígeno solúvel e seu anticorpo específico.
Mais sensível.
Teste de Coombs
 Identificar anticorpos presentes no sangue:
utilizado em pré-natal de gestantes Rh
negativo, triagem de anemias hemolíticas e
provas pré-transfusionais.
ERITROBLASTOSE FETAL
Fonte: Mesquita et al, 2005.
Anticorpo da mãe
promove a lise das
hemácias do feto.
imunoglobulina anti Rh(D) (vacina Rogan)
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Teste de Coombs
ERITROBLASTOSE FETAL
https://recipp.ipp.pt/bitstream/10400.22/16502/2/Manual%20pr%C3%A1tico%20IH_2020.pdf
PESQUISA DE ANTI-D
 PRÉ-NATAL DE MULHER Rh-
 TRANSFUÇÃO (doador Rh - e receptor Rh +
 Soro do paciente é incubado com hemácias O+
(antígeno)  pesquisa de anti-D (anticorpo) no
soro do paciente testado.
 Interação ac-ag  soro de coombs (antig-IgG
humana) se liga a esse complexo aglutinando.
Anti-IgG humana
Diluição seriada:
titulo de anticorpo
Anti-D se liga 
ao antígeno D 
na hemáciaAnti-D? Soro de coombs
Imunodifusão
REAÇÕES EM PRECIPITAÇÕES EM GEL
 Técnica simples: colocar antígenos e anticorpos em orifícios separados
em um suporte semisólido (ex: ágar).
 Em seguida, os Ags e Acs misturam-se através do suporte por difusão.
Quando se atinge uma zona de equivalência, forma-se uma linha de
precipitação, que pode ser visível quando a luz atravessa o gel.
 Falta de sensibilidade e da necessidade de utilizar alta quantidade de Ag
e Ac.
 Tempo para a precipitação pode tornar o teste demorado.
-
-
+
+
+
+
Fonte: o autor
Imunodifusão
IMUNODIFUSÃO RADIAL DUPLA: detecção de ac.
Método semi-quantitativo.
 São inoculados na placa de ágar o antígeno e o anticorpo, o
ponto onde os reagentes se encontram formam linhas de
precipitação.
+
+
Figura 3. Avaliação da reatividade de uma das amostras soropositivas e para candidíase sistêmica com exoantígeno de P. brasiliensis.A-Amostra soropositiva para PCM; B- Amostra soropositiva para candidíase sistêmica.
Ex - Exoantígeno de P. brasiliensis, P – Amostra pura; Diluição 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32.
http://www.profbio.com.br/aulas/ac3_11.pdf
Fonte: o autor
Imunodiagnóstico:
-Quimioluminescência
-Imunofluorescência
Quimioluminescência
ENSAIOSLUMINESCENTES
Baseados na emissão de luz produzida em algumas
reações químicas de oxidação.
A emissão de luz é medida pelo luminômetros como
detector.
As reações mais utilizadas envolvem reações de
oxidação do luminol e do isoluminol, ésteres de
acridina e decomposição catalisada pela fosfatase
alcalina de adamantil 1,2-dioxetano aril-fosfato.
http://www.profbio.com.br/aulas/ac3_11.pdf
Transformam a luz emitida em impulsos elétricos
Quimioluminescência
http://www.profbio.com.br/aulas/ac3_11.pdf
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Imunofluorescência
 Técnica baseada na ligação de anticorpos com fluorocromos.
Marcação de estruturas celulares por anticorpos específicos que
estão ligados quimicamente a corantes fluorescentes.
 Estes anticorpos ligam-se diretamente ou indiretamente aos
antígenos de interesse.
O corante fluorescente é submetido a uma fonte de luz, absorve
essa luz (energia) e então emite luz  o antígeno marcado é
visualizado ao microscópio de fluorescência pela luminosidade
que emite.
https://www.bio.fiocruz.br/index.php/br/noticias/157
3-brasileiros-sao-convocados-para-participar-de-
mobilizacao-contra-o-aedes-aegypti
Detecta antígeno
Detecta antígenos 
ou anticorpo
Amostra do paciente
Amostra 
do 
paciente
Conjugado: Anti-anticorpo
humano com fluorocrómo
Antígeno 
fixado na 
lâmina
Fator antinúcleo (FAN) – doenças auto imunes
 Indireta: um primeiro anticorpo liga-se ao
antígeno de interesse, um segundo
anticorpo que contem o fluoróforo é
adicionado e liga-se com o primeiro
anticorpo.
 Direta: um anticorpo ligado ao fluoróforo
liga-se ao antígeno de interesse.
Imunofluorescência
http://www.profbio.com.br/aulas/ac3_11.pdf
Imunodiagnóstico:
-ELISA
ELISA
ENSAIO DE IMUNOABSORÇÃO LIGADO A ENZIMA (ELISA)
A reação Ag-Ac é monitorada por medida da atividade enzimática.
 Ensaios qualitativo e quantitativos, para a detecção tanto de antígenos
quanto de anticorpos.
 Estes testes usam o produto da mudança de cor da interação da enzima
com o seu substrato para medir a reação entre o antígeno e o anticorpo.
Detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos.
ELISA direto (Ag.).
ELISA indireto (Ac.).
ELISA sanduiche.
ELISA competitivo.
https://www.immunology.org/public-
information/bitesized-immunology/experimental-
techniques/enzyme-linked-immunosorbent-assay
ELISA
ENSAIO DE IMUNOABSORÇÃO LIGADO A ENZIMA (ELISA)
A Enzima do conjugado irá reagir com o substrato.
Os substratos cromogênicos empregados pela degradação
enzimática dão origem a produtos solúveis coloridos, cuja
determinação é feita medindo-se a densidade ótica:
espectrofotometria.
 Conjugado= anticorpo anti-humano ligado a
uma enzima (peroxidase).
 Substrato = revelador – cromógeno (cor) +
peroxido de hidrogênio (H2O).
https://www.immunology.org/public-information/bitesized-
immunology/experimental-techniques/enzyme-linked-immunosorbent-assay
ELISA DIRETO
MEDIDA DE ANTÍGENO: antígeno é fixado a uma placa sendo adicionado
uma proteína bloqueadora (albumina) para fechar todos os outros locais
de ligação.
Adiciona-se o anticorpo ligado a enzima. Ao se adicionar no substrato, a
enzima é detectada ilustrando o sinal do antígeno.
http://www.profbio.com.br/aulas/ac3_11.pdf
Amostra do paciente (antígeno) Anticorpo ligado a enzima
Ac primário 
acoplado a enzima
Substrato 
cromogênio 
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ELISA DIRETO
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/1031398/1/DT145online.pdf
ELISA INDIRETO
https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-pratica_elisa-v-3-out-12-17.pdf
MEDIDA DE ANTICORPOS: avalia a concentração de anticorpo usando o
antígeno ligado à fase sólida, onde o anticorpo da amostra se ligará.
O imunocomplexo será evidenciado pelo anti-anticorpo marcado com
enzima e a subsequente adição do substrato/cromógeno.
lavagem lavagem lavagem
Antígeno 
adsorvido 
no poço
Anticorpos 
ligados á enzima 
ligam-se aos 
anticorpos 
humanos
Substrato é add e 
convertido pela enzima cor. 
A coloração é proporcional 
a quantidade de anticorpo.
Anticorpo 
específico liga-
se ao antígeno
ELISA INDIRETO
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/1031398/1/DT145online.pdf
ELISA SANDUICHE
O anticorpo para um antígeno específico, chamado de anticorpo de captura é,
inicialmente, adsorvido no poço.
Depois, a amostra com o antígeno é adicionada e se liga a esse anticorpo. A revelação é
feita com anticorpo marcado.
http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/ C2_AGAB
ELISA SANDUICHE
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/1031398/1/DT145online.pdf
ELISA DE COMPETIÇÃO
Utiliza antígeno marcado para competir com o alvo.
O antígeno marcado se liga menos quando houver mais antígeno não-marcado (da amostra) e
assim, a cor fica mais fraca quando houver muito do alvo na amostra.
A intensidade da cor é inversamente proporcional a [ ] de Ag da amostra pesquisada  quanto ↑ a
quantidade de Ag-teste, ↓ a possibilidade de ligações do Ag marcado e assim, a intensidade de cor
emitida.
http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/ C2_AGAB
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Fechamento
○ Interação antígeno x anticorpo
■ Especificidade
■ Afinidade
■ Avidez
■ Reatividade cruzada
○ Imunodiagnóstico
■ Reação de aglutinação
■ Imunodifusão
■ Quimiluminescência
■ Imunofluorescência
■ ELISA (direto – ag/ indireto – ac)
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