Aula 4-Amplificação in Vitro de Dna

Prévia do material em texto

Aula 4: Amplificação in Vitro de DNA
Módulo 1: Elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos.
Princípios da PCR concencional 
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica de aumento da produção de DNA para estudo.
A técnica de PCR (ou Reação em Cadeia da Polimerase) é uma tecnologia que consiste na amplificação de uma região específica de DNA. Ou seja, com essa metodologia é possível produzir uma quantidade enorme de cópias de pequenas porções do DNA que se deseja estudar.
Tanto o DNA quanto o RNA são formados por nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos nucleicos e, consequentemente, do material genético. A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e RNA. Mas como são esses tijolos?
· Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é uma das formas mais simples dos carboidratos – a forma mais conhecida de um açúcar simples é a glicose.
É na ribose que reside a principal diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma molécula de oxigênio ligada ao segundo carbono da ribose que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico. (des é ausente/desoxi é ausência de oxigênio)
· O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos diferentes de bases nitrogenadas:
Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G), Timina (T).
Para o RNA há uma diferença: No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T, existe uma Uracila (U). Essas bases são as responsáveis pela informação genética.
A célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas para codificar, em sequência, uma informação preciosa.
Nucleotídeo é a subunidade que forma o DNA e o RNA, ácidos nucleicos relacionados com a hereditariedade e controle da atividade das células.
Um nucleotídeo é constituído por um grupo fosfato, uma base nitrogenada e uma pentose.
DNA e RNA se diferenciam quanto em relação a pentose que possuem e são diferentes tbm em relação as suas bases nitrogenadas.
Ligação fosfodiéster: ligação de nucleotídeos que possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da (desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila (álcool orgânico) presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo.
É importante manter em mente que o grupamento fosfato confere carga negativa à molécula de DNA.
A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres para interação com outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo oposto.
As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois grupos químicos, de acordo com o número de anéis aromáticos que possuem:
Pirimidinas: (C, T, U) - Possuem um anel.
Purinas: (A, G) - Possuem dois anéis.
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, pirimidinas pareiam com purinas, de acordo com as cargas livres de cada base.
Essas interações entre as bases são chamadas de pontes de hidrogênio e são consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a temperatura, e químicos, como o pH.
Essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de DNA livre de erros e garantem à molécula uma de suas características fundamentais: a complementariedade.
· É a partir dessa complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA e do RNA, as polimerases, sabem qual nucleotídeo adicionar para manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA, é a característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de replicação semiconservada.
Quando essas fitas interagem em um sentido único, uma das fitas se encontra com o carbono 5, a outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece porque, para interagirem, as duas fitas precisam estar em sentidos opostos.
Esse sentido de interação por complementariedade traz à tona outra característica do DNA: sua replicação deve ser feita de forma semidescontínua.
(In vivo, apenas a fita no sentido antiparalelo (3’→5’) é lida de forma contínua, e a fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’) é lida de forma descontínua. Isso acontece por causa do sentido de abertura da forquilha de replicação).
Reação em cadeia pela polimerase: amplificando DNA in vitro
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.
Em tubo de ensaio produzir DNA é mais complexo, pois, não existem as mesmas estruturas que há no IN VIVO. Precisamos utilizar os conhecimentos da físico-química do DNA e os princípios básicos de sua replicação para simplificação e adaptação da técnica in vitro.
1-Complementariedades entre fitas antiparalelas:
· A primeira característica do DNA na sua replicação in vitro é: as bases nitrogenadas de uma fita interagem com as bases da outra fita (A-T, C-G), essa interação entre as fitas é bem frágil, podendo ser desfeita por fatores como o calor.
Se aquecermos essa solução em 90°C, podemos desfazer essa interação e quebrar a fita dupla em duas fitas simples que vai possibilitar que as bases nitrogenadas de interagirem.
Se baixarmos a temperatura da solução, a fita dupla irá se refazer e a informação contida será mantida. 
2-Síntese enzimática pela polimerase
· A polimerase é a segunda característica mais importante para replicação do DNA in vitro.
A polimerase lê cada base nitrogenada da fita simples, enquanto essa fita está sendo sintetizada por uma ligação fosfodiéster.
A polimerase no ambiente in vivo, não inicia a duplicação do DNA sozinha pq ela não consegue abrir a fita dupla em fita simples. Ela precisa de enzimas para abrir a fita dupla. 
· A polimerase vai precisar de helicases e nucleotídeos que é feito pela enzima primase.
Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da polimerase, a abertura do DNA em fitas simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase (enzima resistente ao calor).
Além disso, usamos pequenas sequências de nucleotídeos em fitas simples e complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências sintéticas são chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos.
Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.
Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA ocorre apenas no sentido 5’→3’, pois o trifosfato (na posição 5) do nucleotídeo livre dará a energia necessária à ligação fosfodiéster com o carbono 3 da ribose do nucleotídeo que já estará na fita.
Isso acontece em ambas as fitas (paralela 5’→3’ e antiparalela 3’→5’).
Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando aquecida próximo a 100ºC.
A reação de síntese de novas fitas de DNA é feita por meio de uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase.
A Taq polimerase precisa de oligonucleotídeos iniciadores que se ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples.
Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes básicos – ou reagentes mínimos – para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a amplificação são:
· O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.
· Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA molde a ser amplificado.
· A Taq polimerase, termorresistente.
· Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase.
· Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se de que os três fosfatos são usados como fonte de energia para que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq polimerase aconteça.
· A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases.
O microtubo com esses poucosreagentes é, então, submetido a diversos ciclos de elevação e redução da temperatura do qual a PCR consiste.
A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em suas fitas simples pelo aquecimento da reação a, pelo menos, 95ºC (de 5 a 10 minutos), esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas de DNA que podem estar muito concentradas, superenoveladas e ser muito longas.
Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão.
Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G), Timina (T).
Etapa 1-Desnaturação: primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95ºC por cerca de 1 minuto. O tempo de desnaturação pode variar de acordo com cada reação e genoma. Por exemplo, genomas ricos em CG precisam de tempo e temperatura maiores para desnaturar, pois C faz pontes triplas com G, enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos menores por possuírem ligações duplas.
Etapa 2- Anelamento: A temperatura será reduzida para cerca de 50 a 65ºC por, aproximadamente, 30 segundos, para que os iniciadores se liguem especificamente à fita simples de DNA. 
Se a temperatura for baixa, a fita se renatura e a PCR não acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído podem se ligar inespecificamente e sua reação não funcionará apropriadamente.
Se a temperatura for alta, os oligonucleotídeos se ligarão apenas parcialmente, ou até mesmo não se ligarão, e a eficiência da sua reação será comprometida.
Temperatura ideal: De modo geral, quanto maior o tamanho e o conteúdo de CG, maior será a temperatura de anelamento.
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla. Como a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da temperatura a 95ºC não a destrói, pois, funciona melhor em temperaturas mais elevadas.
No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor temperatura de adição de nucleotídeos em uma PCR é, em torno de 70ºC a 72ºC.
O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência entre os oligonucleotídeos. Uma reação para amplificar menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um tempo de extensão de 30 a 40 segundos.
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC, para que as fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-anelamento-extensão se repita de 30 a 40 vezes e no final disso é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir que a síntese de todas as fitas seja concluída e por fim a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam rapidamente: os termocicladores. A duração de uma PCR é de 1 hora e meia a 2h.
A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores senso e antissenso, conhecida como amplicon (produto amplificado) – dobra. No final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de 1 bilhão de cópias da mesma sequência!
Por Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:
PCR qualitativa: Todos os ciclos ocorrem em um termociclador comum, precisa de etapas posteriores para revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se dá pela constatação da presença ou ausência do produto alvo da amplificação.
PCR quantitativa: Também conhecida como em tempo real. Os ciclos se dão em um aparelho capaz de ler automaticamente a amplificação e, assim, é capaz de quantificar em tempo real, não há necessidade de revelação posterior à reação, o que a torna mais rápida.
Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando o resultado
Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é transparente como a água.
Não podemos observar a olho nu o resultado da reação: é necessário revelá-la.
Após uma PCR bem-sucedida, temos uma sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento específico dos oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para verificarmos se o tamanho corresponde ao do nosso produto. Também vamos precisar de algo que revele a localização do DNA, ou um agente revelador especial.
· Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa chamada de matriz ou gel de agarose.
A agarose funciona de maneira semelhante a gelatina que fazemos na cozinha, o gel de agarose é um polissacarídeo que se dissolve em líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha com pequenos orifícios que permitirão a passagem do DNA, de modo que moléculas menores de DNA passarão com maior facilidade e mais rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior dificuldade de passar demorando mais tempo. Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma malha mais fechada ou mais aberta simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel.
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de poços, feitos com um pente com pequenos dentes largos. Para podermos visualizar a passagem do tampão da PCR pelo gel de agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais denso do que o tampão de corrida e faz com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione adequadamente.
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos poços do gel com o corante azul, podemos começar a eletroforese.
A eletroforese parte do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas moléculas ionizadas migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas migram para o polo oposto (positivo), o cátodo, e as moléculas positivas migram para o polo negativo, o ânodo.
Como o DNA está no fundo do gel de agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa por dentro da agarose e, assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel.
O corante azul, também de carga negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo gel mais rapidamente, servindo apenas como marcador da velocidade de migração, e não da posição do DNA.
Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de tamanho molecular do DNA que consiste em sequências de DNA de tamanhos conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus representam os tamanhos, chamamos essas sequências em gel de agarose de bandas.
Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado (ou amplicon) no gel de agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, é uma molécula capaz de fluorescer quando excitada no comprimento de onda correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo que intercale especificamente com o DNA. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, capaz de se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos manter nossa segurança e as boas práticas laboratoriais para evitar de nos contaminarmos com ele.
Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do gel, podendo ser adicionado antes da solidificação do gel (antes da eletroforese) ou depois da eletroforese, com uma incubação extra. Finalmente, o brometo de etídio é excitado no comprimento de onda ultravioleta em um equipamento chamado transiluminador.
Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de DNA amplificado de acordo com o marcador de tamanho molecular.
Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu resultado pode ser uma única banda de DNA no gel de agarose ou múltiplas bandas.
Cada situaçãodemandará a experiência e o conhecimento do profissional para interpretação e resolução de possíveis problemas.
Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo é o gel de acrilamida/bisacrilamida, usado para separar sequências de DNA com alta resolução, de forma que bandas com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser diferenciadas.
O gel de acrilamida/bisacrilamida também permite a separação de RNA e proteínas.
Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida eletroforética também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose corado por brometo de etídio é a técnica de revelação de PCR mais utilizada.
Obs
As DNA-polimerases são incapazes de reconhecer o local de início de replicação, sendo função das primases a colocação dos primeiros nucleotídeos. Assim, precisamos usar iniciadores que se anelarão por complementariedade específica à sequência-alvo desejada. O anelamento dos oligonucleotídeos permite o reconhecimento pela polimerase, que sintetizará a fita dupla a partir do molde.
Na PCR, ocorre o aumento exponencial do número de fitas duplas de DNA correspondentes à sequência-alvo. No entanto, esse aumento é invisível a olho nu e precisa ser revelado.
Módulo 2: Variações entre cada técnica de PCR
Uma PCR convencional dará apenas a base para que variações mais complexas, específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas.
Existem vários interesses em um estudo: queremos saber o quanto de determinada sequência temos em nossas amostras. Em outras situações, podemos estar interessados no produto da expressão de um determinado gene, e precisamos olhar para o RNA mensageiro ao invés do DNA.
Reação de transcrição reversa
A DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma fita de DNA molde. A DNA é polimerase DNA-dependente.
Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças causadas por vírus que não têm material genético feito por DNA.
Nesses casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o RNA.
A Taq polimerase, no entanto, não é capaz de reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.
A Taq polimerase só trabalha com desoxirriboses.
Como conseguimos resolver esse problema?
· Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!
Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da covid-19, existem outros vírus de genoma RNA, como os de genoma RNA chamados de retrovírus.
O SARS-CoV2 e o retrovírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA → RNA → proteína do dogma central da Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma RNA. 
· Os retrovírus usam o RNA de seu genoma como molde para síntese de DNA.
· Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, cujo nome oficial é DNA polimerase RNA-dependente.
· Ela é chamada de transcriptase reversa, ou TR, pois faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA.
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa precisa de alguns fatores elementares:
O primeiro fator necessário é o RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, além do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para fazer a síntese de cDNA a partir do RNA+. (transforma RNA em DNA= reverso).
A TR não é resistente à temperatura. Dessa forma, a reação de transcrição reversa deve preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas temperaturas de desnaturação.
As TR não representam nenhum risco de infecção ao manipulador
A TR precisará de pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR convencional, para iniciar a transcrição.
Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados de hexâmeros. Eles podem ser específicos para determinada sequência de RNA, ou podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-T), ou podem ser aleatorizados.
Primeiro caso: Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não) ao qual os hexâmeros se anelam.
Segundo caso: Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que constitui uma biblioteca de expressão gênica.
Terceiro caso: Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA correspondente a todos os RNAs da célula, mensageiros ou não, uma vez que os oligonucleotídeos se ligam à fita de RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA complementar usando o quarto reagente, os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).
Diferença entre PCR e RT:
· Na PCR existem vários ciclos que se repetem várias vezes para a amplificação uma sequência de DNA.
· A RT é linear: cada etapa acontece apenas uma vez, o que não permite amplificação de sinal.
Obs. > Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por poucos minutos. Na maioria dos casos, não há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples. Contudo, podem ocorrer estruturas secundárias no RNA que precisam de temperaturas moderadas para desnaturação.
Em alguns casos, a RT pode ter apenas essas duas temperaturas, de anelamento e extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser armazenado por meses a anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou usado imediatamente como molde em uma PCR – a chamada RT-PCR.
Nested-PCR
A PCR convencional não consegue amplificar determinada sequência que esteja presente em pouquíssima quantidade, assim o gel de agarose pode não ter capacidade suficiente para evidenciar o amplicon.
Nós chamamos essa capacidade de o resultado representar a realidade de sensibilidade.
A sensibilidade da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que possuem o DNA-alvo na realidade.
Normalmente, a PCR tem ótima sensibilidade por aumentar exponencialmente a sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional pode não ser suficiente, pois existe uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há aumento do número de fitas devido ao esgotamento dos reagentes. Assim se uma PCR tiver mais de 40 ciclos não oferecerá nenhum benefício, porém, pode aumentar as chances de produtos inespecíficos que atrapalharão a interpretação.
· Nested-PCR: Consiste em usar uma fração da primeira reação como molde para uma segunda PCR.
Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo o par de primers para a primeira reação, chamado de iniciadores externos, e os primers usados na segunda PCR, conhecidos como internos.
Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação, e conseguimos aumentar o número de ciclos de amplificação de, no máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e 80 ciclos no total de ciclos combinados nas duas reações subsequentes. Consequentemente, aumentamos a quantidade de DNA amplificado obtido ao final da segunda PCR.
Outro cuidado recomendável para a segunda reação é a purificação do produto da primeira reação antes de utilizá-lo na segunda, o que evita contaminações entre amostras, reduz o risco de inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR.
· Até aqui, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de agarose para separação dos produtos da PCR
Esses tipos de PCR são categorizados como qualitativos. Entretanto, existem situações em que a PCR qualitativa se torna pouco informativa.
Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador genético específico. Nesse caso, a PCR convencional e suas variações vistas até agora não informam o suficiente para tomada de decisões.
PCR quantitativo em tempo real – qPCR
A qPCR é uma PCR quantitativa que entra em ação a partir do momento em que as PCRs qualitativas não produzem resultados precisos para saber por exemplo se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador genético específico.
A qPCR é uma técnica que revela quantidade de certa sequência específicade DNA com o máximo de precisão possível.
A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo real dos resultados, sem necessidade de revelação posterior. Isso se dá porque ela possui dois fatores adicionais a uma PCR qualitativa: a adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um termociclador capaz de detectar o sinal fluorescente. Assim a cada novo ciclo ocorre aumento da quantidade de DNA-alvo e da emissão de fluorescência.
Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores que contenham lasers para excitação do fluoróforo e detectores da fluorescência.
Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos ter uma temperatura todas as duas acontecem a 60 oC.
· Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. 
Elas diferem especialmente na forma como a fluorescência é emitida e na especificidade do sinal fluorescente.
SYBR Green
O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas duplas de DNA. Quando não está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR tem sua fluorescência drasticamente reduzida. 
Por sua capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA fita dupla, ele também é usado como um sistema alternativo na revelação da PCR convencional em gel de agarose , já que é menos tóxico que o brometo de etídio.
Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de extensão. O aparelho termociclador irá incidir um laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa fluorescência será detectada pelo aparelho, que mostrará a quantidade de fluorescência por ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois maior será a quantidade de DNA.
A progressão de fluorescência será proporcional à quantidade de DNA amplificado a cada ciclo, até que a reação atinja sua saturação, e um platô após a curva de crescimento exponencial será observado.
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA não é controlada: O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz com que a emissão de fluorescência seja menos específica. 
· Apenas os oligonucleotídeos iniciadores são responsáveis pela especificidade.
Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting curve). Nessa etapa, o termociclador aquecerá a PCR lentamente, para medir em qual temperatura 50% das fitas duplas de DNA sintetizadas se dissociam.
Essa temperatura dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o tamanho da sequência.
TaqMan
Assim como na técnica SYBR, a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e detecção de fluorescência a cada ciclo de amplificação.
a TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão da fluorescência acontece: Temos a presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos iniciadores. Essa sequência extra é conhecida como sonda e é curta. 
A enzima Taq polimerase usada na TaqMan é diferente das outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos (polimerização), como as demais polimerases, e remove nucleotídeos (função exonuclease).
A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois, quando a enzima chega ao nucleotídeo da sonda que contém o fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará livre de seu bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável.
A cada novo ciclo da PCR, as fitas duplas serão desnaturadas, os iniciadores e a sonda se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA.
A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o anelamento da sonda é específico para a região alvo a ser amplificada. Devido a essa especificidade apenas um nucleotídeo pode ser detectado – essas mutações são conhecidas como single nucleotide polymorphism (SNP).
A TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da especificidade.
Outra vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a capacidade de múltiplas detecções na mesma reação.
Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA ou cDNA. A técnica como a quantificação é obtida varia, mas a maioria das análises posteriores podem ser usadas igualmente – uma vez que resultados confiáveis tenham sido obtidos.
Quantificação
Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que será detectada pelo aparelho.
· Ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais filtros usar para a excitação de cada fluoróforo
· Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine, nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o nível em que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído.
· Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído (background). O ruído vai ser utilizado para determinar o limiar de detecção (threshold).
O primeiro ciclo em que a fluorescência de determinada amostra ultrapassa o limiar de detecção acima do ruído (ou da fluorescência de base) é chamado de valor de Ct. O valor é importante e está relacionado com a quantidade inicial de DNA-alvo da amostra amplificada.
Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar ou normalizar a reação: 
· A ROX, um fluoróforo passivo (sua fluorescência não aumenta de acordo com a amplificação do DNA).
· E o Rn, que representa um ajuste (ou normalização) entre o sinal do fluoróforo de escolha (SYBR ou da sonda TaqMan)
A maioria dos reagentes para qPCR já possuem ROX adicionados ao tampão, cabendo a nós apenas a observação.
Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos detectarão o sinal emitido a cada ciclo e darão, em tempo real.
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva padrão e por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT.
Pela curva padrão
Para chegarmos a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra devemos ter em mãos uma curva padrão, com concentrações conhecidas do DNA alvo.
Essa curva pode ser comprada de laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós mesmos, através de clonagens e purificação.
Alguns dos principais valores dados pela curva padrão que usamos para determinar a concentração da amostra-teste são a linearidade da curva e a eficiência de amplificação.
Existem 5 quantidades diferentes da curva padrão obtidas pela diluição seriada, e três amostras desconhecidas cuja quantidade de DNA foi calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da curva padrão.
· Linearidade da curva: Matematicamente conhecida como R2,, deve ser superior a 0.985 para que a reação seja aceitável. Usamos essa fórmula para calcular o valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da amplificação começar
· Eficiência de amplificação: Com ela, a cada ciclo, espera-se que a quantidade de DNA-alvo amplificado dobre, mas, devido a pequenos erros, podemos considerar aceitáveis eficiências que variem entre 90 e 110%.
Por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt)
Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de interesse, cuja quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA de referência.
Qual produto do DNA podemos detectar via PCR?
É o RNA.
Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é RT-qPCR.
RT-qPCR: reação de transcrição reversa acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.
PCR em multiplex (detectar mais de um alvo)
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR convencional, nested-PCR, RT-PCR ou qPCR.
· podemos detectar mais de um alvo por reação em uma PCR multiplex.
Para isso, precisaremos ajustar as reações separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada produto desejado, e depois fundir as duas PCRs em uma.
Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é identificado chamamos de multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até quantificados.
 As reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais difíceis e limitadas, não é possível distinguirmos entre os sinais dos diferentesprodutos.
Mas, a distinção é possível graças à curva de dissociação onde a temperatura deve estar em torno de 50%. Então, observamos dois picos na curva de dissociação, em temperaturas diferentes.
No entanto, sequências distintas sem diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas, pois não veremos diferenças em suas curvas de dissociação.
Módulo 3: Aplicações apropriadas ao uso de cada método
Aplicações da PCR
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA até termos milhões e bilhões de cópias da mesma exata sequência, ou amplicon, que pode ser visualizada a partir de técnicas especiais.
A PCR e as suas variantes em ciências forenses
Você já deve ter entrado em contato com a identificação de um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime. Isso só é possível porque cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar para confirmar a origem do DNA.
Denominadas marcadores moleculares, elas são conhecidas pela alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões com grande variação na sequência de DNA entre indivíduos sem causar nenhum tipo de interferência.
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em tandem (ou STRs – short tandem repeats).
As STRs variam e oferecem grande precisão na identificação de indivíduos.
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode ser visualizado por separação das bandas em gel de agarose e coloração por brometo de etídio.
Se precisar aumentar o material genético a fim de aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito pode optar pelo uso de uma nested-PCR, lembrando que os primers externos e interno precisam de regiões não repetidas para se anelarem.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas
Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos identificar a presença ou ausência de sequências que deveriam ou não existir em determinado contexto.
As doenças genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes perfis – autossômico dominante ou recessivo, ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas.
O uso da PCR no diagnóstico dessas doenças pode ser feito de diversas maneiras.
O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo expresso numa mesma reação, ajudando no reconhecimento de pequenas mutações que podem levar a uma doença genética.
Na PCR convencional. Vamos usar a doença de Huntington como exemplo. A PCR torna-se uma importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar sequências próximas da região de repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim, informar o risco e até o prognóstico da doença em si.
Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições, em pessoas portadoras de Huntington, o número de repetições aumenta para 35 ou mais, quanto maior o número de repetições, maior o risco de aparecimento e de progressão da doença.
Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem próximo a STRs, mas não nas STRs em si.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças infecciosas
Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não deveria estar presente naquela amostra biológica.
Usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.
Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de casos ativos de infecção pelo SARS-CoV2. O tratamento para HIV pode ser monitorado através de RT-qPCR.
O mesmo princípio de quantificação de cDNA obtido por transcrição reversa também é aplicado em tratamentos oncológicos, o oncologista pode requerer uma RT-qPCR para acompanhamento.
A PCR e as suas variantes em pesquisa científica
A PCR é bastante recrutada na pesquisa científica.
A PCR pode ser utilizada para manipulação genética de organismos simples, como bactérias, leveduras e células em cultivo.
Podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene.
Fazemos isso ao amplificarmos a sequência gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos.
Um exemplo de vetores muito usados são os plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de uma célula a outra, comuns em bactérias.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos o produto amplificado, juntamente com o vetor, para inserirmos o gene clonado no vetor.