Amplificação in vitro de DNA

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Ampli�cação
in vitro de DNA
Prof.ª Camila Freze Baez
Descrição
Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e
introdução de suas aplicações em rotina laboratorial.
Propósito
Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in
vitro em suas diferentes formas e entender quais são suas vantagens,
desvantagens e aplicações em contextos diversos é importante para o
profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de
trabalho.
Objetivos
Módulo 1
Elementos fundamentais à ampli�cação de
ácidos nucleicos
Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos
nucleicos in vitro.
Módulo 2
Variações entre cada técnica de PCR
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Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.
Módulo 3
Aplicações apropriadas ao uso de cada
método
Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método.
Introdução
Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que
carregam informações genéticas. Você já parou para pensar
como certas características físicas passam dos pais para os
filhos? Traços físicos como formato do rosto, altura, cor da pele e
dos olhos são traduções de informações transmitidas às
gerações futuras dos ácidos nucleicos. No corpo humano e na
maioria dos seres vivos, encontramos dois tipos de ácidos
nucleicos: o ácido desoxirribonucleico (ADN – também
conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico
(ARN, ou RNA, em inglês).
Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções
diferentes dentro da menor unidade viva conhecida — a célula. O
DNA possui fita dupla, sendo mais estável e resistente que o
RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA para armazenar as
informações genéticas em longo prazo. Já o RNA, normalmente,
em fita simples e mais instável, tem como principal função
intermediar a informação entre o DNA e as unidades efetoras da
maioria das funções celulares, as proteínas.
Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da
estrutura óssea que, em grande parte, é feita de proteínas. O
papel das proteínas não se limita apenas em traços físicos, mas
também em funcionais.
Mas o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos
nucleicos?
Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a
amplificação do DNA por conta própria em um ambiente
extremamente complexo e controlado – do pH e nível de oxigênio
disponível, ao momento que a célula está em seu ciclo de vida.
São dezenas de enzimas envolvidas na síntese de novas
moléculas de DNA, tantas que os cientistas ainda não

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compreendem completamente todas as etapas envolvidas nesse
processo. Apesar de toda a complexidade da duplicação do DNA
in vivo, já somos capazes de sintetizar pequenos trechos do DNA
em um tubo de ensaio.
Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é possível
neste material.
Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em RNA,
que é traduzido em proteína.
1 - Elementos fundamentais à ampli�cação de ácidos
nucleicos
Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer elementos fundamentais à ampli�cação
de ácidos nucleicos in vitro.
Princípios da PCR concencional
Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro,
devemos primeiro relembrar algumas informações sobre o DNA e o
RNA: suas funções, composições, similaridades e diferenças. Tanto o
DNA quanto o RNA são formados por nucleotídeos, que são como os
tijolos dos ácidos nucleicos e, consequentemente, do material genético.
A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e RNA.
Mas como são esses tijolos?
Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose.
Essa ribose é uma das formas mais simples dos carboidratos – a forma
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mais conhecida de um açúcar simples é a glicose. É na ribose que
reside a principal diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma
molécula de oxigênio ligada ao segundo carbono da ribose que o DNA
não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA,
existem quatro tipos diferentes de bases nitrogenadas:
Desoxirribonucleico
Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto,
“desoxi” representa o oxigênio que está ausente.
Para o RNA há uma diferença:
No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as
mesmas, mas, em vez de T, existe uma Uracila (U).
Essas bases são as responsáveis pela informação
genética.
Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser
humano, usando apenas uma das letras do teclado do computador.
Como seria possível entender a informação que você quis codificar?
Agora, se você escrever um texto com pelo menos duas letras (ou
números) do teclado, usará um código binário. Isso também acontece
com a informação genética: a célula utiliza essas cinco bases
nitrogenadas para codificar, em sequência, uma informação preciosa.
Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto
carbono da (desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila
(álcool orgânico) presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose,
fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é
conhecida como fosfodiéster, sendo considerada o “cimento” dos
 Adenina (A)
 Citosina (C)
 Guanina (G)
 Timina (T)
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nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de DNA ou RNA são
formadas. É importante manter em mente que o grupamento fosfato
confere carga negativa à molécula de DNA – vamos voltar a falar a
respeito disso mais à frente.
Código binário
Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar
informação, como computadores.
Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato, desoxirribose e
base nitrogenada.
A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato
de outro nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres
para interação com outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo
oposto. As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em
dois grupos químicos, de acordo com o número de anéis aromáticos
que possuem:
Pirimidinas
(C, T, U) - Possuem um anel.
Purinas
(A, G) - Possuem dois anéis.
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja,
pirimidinas pareiam com purinas, de acordo com as cargas livres de
cada base. Desse modo, A interage com T, pois ambas têm duas cargas
livres para interação, e C interage com G através de três cargas. Essas
interações são chamadas de pontes de hidrogênio e são consideradas
fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a
temperatura, e químicos, como o pH.
Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das
bases por complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas
(seta verde) entre adenina e timina, e as triplas (seta preta) entre
citosina e guanina.
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Pareamento de bases nitrogenadas.
No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a
sequência de DNA livre de erros e garantem à molécula uma de suas
características fundamentais: a complementariedade. É a partir dessa
complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA
e do RNA, as polimerases,sabem qual nucleotídeo adicionar para
manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo
tempo, é a característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla.
Chamamos essa característica de replicação semiconservada.
Semiconservada
Uma fita original (fita parental) é mantida na duplicação, como molde para a
síntese da fita nova (fita filha).
Atenção!
Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para
a direita, por exemplo, veremos que uma das fitas se encontra com o
carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à esquerda, enquanto a
outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso
acontece porque, para interagirem, as duas fitas precisam estar em
sentidos opostos – por isso, nós as chamamos de fitas antiparalelas.
Esse sentido de interação por complementariedade traz à tona outra
característica do DNA: sua replicação deve ser feita de forma
semidescontínua (In vivo, apenas a fita no sentido antiparalelo (3’→5’) é
lida de forma contínua, e a fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’)
é lida de forma descontínua. Isso acontece por causa do sentido de
abertura da forquilha de replicação).
Reação em cadeia pela polimerase:
ampli�cando DNA in vitro
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os
itens necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as
enzimas.
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Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.
Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo
de ensaio! Precisamos utilizar os conhecimentos da físico-química do
DNA e os princípios básicos de sua replicação para simplificação e
adaptação da técnica in vitro. Veja:
Complementariedade entre �tas antiparalelas
Primeira característica do DNA importante na sua replicação in
vitro: as bases nitrogenadas de uma fita interagem
especificamente com as bases correspondentes da outra fita
(A-T, C-G) por meio de interações frágeis que podem ser
desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de 90ºC,
podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em
duas fitas simples. Isso deixa as bases nitrogenadas expostas
para interagirem e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos
fazer com que a fita dupla se refaça e a informação seja
mantida. Vamos ver como esse processo funciona passo a
passo mais à frente.
Síntese enzimática pela polimerase
Segunda característica importante para a replicação do DNA in
vitro. Essa enzima lê cada base nitrogenada da fita simples
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como se fosse um molde, e adiciona a base nitrogenada
complementar na fita que está sendo sintetizada através da
ligação fosfodiéster. In vivo, a polimerase não inicia a
duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita
dupla em fitas simples, identificar o local certo de início de
replicação ou adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula
utiliza enzimas para abrir a fita dupla, as helicases, e adição
dos primeiros nucleotídeos é feita por outra enzima, chamada
primase.
Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da
polimerase (polymerase chain reaction – PCR), a abertura do DNA em
fitas simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma enzima
termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso, usamos
pequenas sequências de nucleotídeos em fitas simples e
complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas
sequências sintéticas são chamadas de iniciadores ou
oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno de 20 nucleotídeos,
conhecidos como primers, em inglês.
Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um
chamado senso, que se liga ao DNA molde fita simples no sentido
3’→5’; e um antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.
Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do
DNA ocorre apenas no sentido 5’→3’, pois o trifosfato
(na posição 5) do nucleotídeo livre dará a energia
necessária à ligação fosfodiéster com o carbono 3 da
ribose do nucleotídeo que já estará na fita. Isso
acontece em ambas as fitas (paralela 5’→3’ e
antiparalela 3’→5’), e ambos os oligonucleotídeos são
sintetizados em laboratório no sentido 5’→3’. Os
oligonucleotídeos iniciadores irão demarcar a região
do genoma a ser amplificada. Essa informação é
importante para dar especificidade à PCR!
Etapas da reação em cadeia da polimerase
Já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas
simples quando aquecida próximo a 100ºC, e sabemos que a reação de
síntese de novas fitas de DNA é feita por meio de uma enzima
termorresistente chamada de Taq polimerase. Também descobrimos
que a enzima precisa de oligonucleotídeos iniciadores que se ligam por
complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples.
Agora, podemos entender como essa última se desenvolve. Assim como
em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes
básicos – ou reagentes mínimos – para a síntese de DNA acontecer.
Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um microtubo. Os
reagentes mínimos necessários para a amplificação são:
O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.
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Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região
do DNA molde a ser amplificado.
A Taq polimerase, termorresistente.
Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento
eficaz da polimerase.
Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP,
dCTP, dTTP) – lembre-se de que os três fosfatos são usados como
fonte de energia para que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq
polimerase aconteça.
A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de
nucleases.
Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR).
O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a
diversos ciclos de elevação e redução da temperatura do qual a PCR
consiste. Vejamos:
1. A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla
de DNA em suas fitas simples pelo aquecimento da reação a, pelo
menos, 95ºC, por um tempo prolongado – algo em torno de 5 a 10
minutos. Esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas
de DNA que podem estar muito concentradas, superenoveladas e
ser muito longas.
2. Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3
etapas: desnaturação, anelamento e extensão.
Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas
simples, o anelamento dos iniciadores à sequência-alvo por
complementariedade e a extensão pela Taq polimerase.
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Ilustração das etapas da PCR.
Entenda melhor como acontecem estas etapas:
É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é
aquecida a 95ºC por cerca de 1 minuto. O tempo de
desnaturação pode variar de acordo com cada reação e genoma.
Por exemplo, genomas ricos em CG precisam de tempo e
temperatura maiores para desnaturar, pois C faz pontes triplas
com G, enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos
menores por possuírem ligações duplas.
Segunda etapa de cada ciclo. A temperatura será reduzida para
cerca de 50 a 65ºC por, aproximadamente, 30 segundos. Essa
redução da temperatura deve ser feita com exatidão para que os
iniciadores se liguem especificamente à fita simples de DNA. Se
a temperatura for baixa demais, a fita se renatura e a PCR não
acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído podem se
ligar inespecificamente e sua reação não funcionará
apropriadamente. Se for alta demais, os oligonucleotídeos se
ligarão apenas parcialmente,ou até mesmo não se ligarão, e a
eficiência da sua reação será gravemente comprometida. Você
pode estar se perguntando como saber exatamente a
Desnaturação 
Anelamento 
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temperatura a ser usada. A resposta certa dependerá de vários
fatores, como o tamanho do seu oligonucleotídeo, seu conteúdo
de CG, e a concentração de sais no tampão de PCR. De modo
geral, quanto maior o tamanho e o conteúdo de CG, maior será a
temperatura de anelamento.
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA
molde, a Taq polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita
dupla. Como a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da
temperatura a 95ºC não a destrói – na realidade, ela funciona melhor em
temperaturas mais elevadas.
No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a
melhor temperatura de adição de nucleotídeos em uma PCR é, em torno
de 70ºC a 72ºC.
Atenção!
O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do
tamanho da sequência entre os oligonucleotídeos. Uma reação para
amplificar menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase
com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter
um tempo de extensão de 30 a 40 segundos.
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC,
para que as fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo
desnaturação-anelamento-extensão se repita de 30 a 40 vezes. No final,
é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir que a
síntese de todas as fitas seja concluída. Após o término, a reação deve
ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar,
aquecem e resfriam rapidamente: os termocicladores. Esses aparelhos
foram um grande avanço para as ciências biológicas e permitiram a
grande difusão da PCR em diversas áreas. Graças a eles, uma PCR
convencional média dura de 1 hora e meia a 2h.
A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os
iniciadores senso e antissenso, conhecida como amplicon (produto
amplificado) – dobra. Dessa forma, se, no primeiro ciclo, tínhamos
apenas uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do
primeiro ciclo, teremos 2 cópias; no final do terceiro ciclo, 4; depois, 8, e
então 16, e assim sucessivamente.
A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da
sequência-alvo. Assim, no final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de
1 bilhão de cópias da mesma sequência! Um número tão grande de uma
mesma sequência vai ser muito mais facilmente identificado
posteriormente.
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Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia, em aparelho
termociclador.
Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:
PCR qualitativa
Todos os ciclos ocorrem em um termociclador comum, precisa de
etapas posteriores para revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se
dá pela constatação da presença ou ausência do produto alvo da
amplificação. Abordaremos alguns outros tipos de PCR que se
encaixam nessa categoria.
PCR quantitativa
Também conhecida como em tempo real. Os ciclos se dão em um
aparelho capaz de ler automaticamente a amplificação e, assim, é capaz
de quantificar em tempo real. Existem dois métodos que são mais
comuns para a quantificação. Nesse caso, não há necessidade de
revelação posterior à reação, o que a torna mais rápida.
Eletroforese em gel de agarose: separando e
revelando o resultado
Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um
microtubo com nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é
transparente como a água. Naturalmente, não podemos observar a olho
nu o resultado da reação: é necessário revelá-la. Para isso, precisamos
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manter em mente que, após uma PCR bem-sucedida, temos uma
sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento
específico dos oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto,
precisamos separar as sequências por tamanho para verificarmos se o
tamanho corresponde ao do nosso produto. Também vamos precisar de
algo que revele a localização do DNA, ou um agente revelador especial.
Dica
Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie
de malha gelatinosa chamada de matriz ou gel de agarose.
Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha,
certo? A agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo
que se dissolve em líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado,
se solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha
com pequenos orifícios que permitirão a passagem do DNA, de modo
que moléculas menores de DNA passarão com maior facilidade e mais
rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior
dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem
pela malha. Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo
com tamanho. Dependendo do tamanho do nosso DNA amplificado,
poderemos usar uma malha mais fechada ou mais aberta simplesmente
variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel.
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios
chamados de poços, feitos com um pente com pequenos dentes largos.
Para podermos visualizar a passagem do tampão da PCR pelo gel de
agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais
denso do que o tampão de corrida e faz com que o DNA se assente no
fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione
adequadamente.
Montagem de gel de agarose com uso de pentes para formação de poços e aplicação do produto
de PCR.
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido
pipetado nos poços do gel com o corante azul, podemos começar a
eletroforese. Para a eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou
recipiente que contenha entradas para corrente elétrica, uma fonte
elétrica e um tampão ionizável. A eletroforese parte do princípio de que
um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas
moléculas ionizadas migrando em direção a um dos polos: as
moléculas negativas migram para o polo oposto, o cátodo, e as
moléculas positivas migram para o polo negativo, o ânodo.
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo
que o DNA migre para o polo positivo (cátodo) quando em solução
submetida à corrente elétrica. Como o DNA está no fundo do gel de
agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele
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passa por dentro da agarose e, assim, será separado de acordo com seu
tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de
carga negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de
DNA, migrará pelo gel mais rapidamente, servindo apenas como
marcador da velocidade de migração, e não da posição do DNA.
Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.
Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um
marcador de tamanho molecular do DNA que consiste em sequências
de DNA de tamanhos conhecidos, como se fosse uma escada cujos
degraus representam os tamanhos. Ele é um parâmetro para
estimarmos o tamanho das sequências de DNA que amplificamos –
coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose de
bandas.
Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto
amplificado (ou amplicon) no gel de agarose. Esse reagente, chamado
de fluoróforo, é uma molécula capaz de fluorescer quando excitada nocomprimento de onda correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo
que intercale especificamente com o DNA. A molécula mais comumente
utilizada é o brometo de etídio, capaz de se intercalar com qualquer fita
dupla de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna
potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos
manter nossa segurança e as boas práticas laboratoriais para evitar de
nos contaminarmos com ele.
Existem diversas formas de se utilizar brometo na
revelação do gel, podendo ser adicionado antes da
solidificação do gel (antes da eletroforese) ou depois
da eletroforese, com uma incubação extra. Finalmente,
o brometo de etídio é excitado no comprimento de
onda ultravioleta em um equipamento chamado
transiluminador.
Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das
bandas de DNA amplificado de acordo com o marcador de tamanho
molecular.
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Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de etídio em luz
ultravioleta.
Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da
PCR, seu resultado pode ser uma única banda de DNA no gel de agarose
ou múltiplas bandas. Algumas vezes, resultados inesperados também
podem aparecer, como múltiplas bandas de DNA, onde apenas uma
banda única era esperada.
Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do
profissional para interpretação e resolução de possíveis problemas.
Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos
nucleicos. Um exemplo é o gel de acrilamida/bisacrilamida, usado para
separar sequências de DNA com alta resolução, de forma que bandas
com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser
diferenciadas. O gel de acrilamida/bisacrilamida também permite a
separação de RNA e proteínas. No entanto, exige revelação por sistemas
diferentes, mais complexos, que nem todos os laboratórios possuem
estrutura para execução.
Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida
eletroforética também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de
agarose corado por brometo de etídio é a técnica de revelação de PCR
mais utilizada.
PCR e eletroforese
Veja na prática a reação em cadeia pela polimerase.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
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Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do
DNA in vitro. Sobre a PCR, é correto afirmar que
Parabéns! A alternativa B está correta.
As DNA-polimerases são incapazes de reconhecer o local de início
de replicação, sendo função das primases a colocação dos
primeiros nucleotídeos. Assim, precisamos usar iniciadores que se
anelarão por complementariedade específica à sequência-alvo
desejada. O anelamento dos oligonucleotídeos permite o
reconhecimento pela polimerase, que sintetizará a fita dupla a partir
do molde.
Questão 2
A PCR convencional contém diversas etapas, desde pipetagem da
reação até sua leitura. Considerando as etapas, leia as afirmativas a
seguir e assinale a alternativa correta:
I - A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para
separar as fitas duplas de DNA em fitas simples.
II - A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de
síntese de DNA é próxima a 70ºC.
III - Logo após a amplificação, podemos facilmente visualizar o
resultado, pois se trata de reação colorimétrica.
IV - Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada,
devemos separar as moléculas de acordo com o tamanho, através
de eletroforese em gel de agarose, e depois revelar, usando
intercalantes de DNA fluorescentes em ultravioleta.
V - A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar
A
a polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os
nucleotídeos necessários, de maneira inespecífica.
B
a especificidade da reação é por oligonucleotídeos
iniciadores para demarcar a sequência e permitir
que a polimerase inicie a síntese.
C
a PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma
etapa de variação de temperatura se repete.
D
a Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e
deve ser adicionada a cada novo ciclo.
E
apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro
carbono da ribose são adicionados pela Taq
polimerase.
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através do gel em direção ao cátodo, quando submetido à corrente
elétrica.
Parabéns! A alternativa E está correta.
Na PCR, ocorre o aumento exponencial do número de fitas duplas
de DNA correspondentes à sequência-alvo. No entanto, esse
aumento é invisível a olho nu e precisa ser revelado.
2 - Variações entre cada técnica de PCR
Ao �nal deste módulo, você será capaz de diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.
Variações da técnica de PCR
Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não
ser a técnica ideal para o nosso objetivo. Podemos nos deparar com
casos em que a concentração do DNA total da amostra é muito baixa, o
que pode limitar o uso do produto amplificado em outras aplicações,
como o sequenciamento. Em determinadas ocasiões, queremos saber o
A Somente a afirmativa II está correta.
B Somente as afirmativas I, II e III estão corretas.
C Somente as afirmativas II, III, IV e V estão corretas.
D Somente as afirmativas I, IV e V estão corretas.
E Somente as afirmativas I, II, IV e V estão corretas.
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quanto de determinada sequência temos em nossas amostras. Em
outras situações, podemos estar interessados no produto da expressão
de um determinado gene, e precisamos olhar para o RNA mensageiro ao
invés do DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são mantidos
constantes, salvo raras exceções.
Dica
Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR
convencional dará apenas a base para que variações mais complexas,
específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas.
Reação de transcrição reversa
Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita
de DNA a partir de uma fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA
polimerase DNA-dependente. Mas, em muitas ocasiões, é necessário
investigar a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças
causadas por vírus que não têm material genético feito por DNA. Nesses
casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o RNA.
A Taq polimerase, no entanto, não é capaz de reconhecer ou de
adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.
Como conseguimos resolver esse problema?
Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!
Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da covid-19, existem
outros vírus de genoma RNA. Os primeiros vírus a serem estudados pela
humanidade foram os de genoma RNA chamados de retrovírus. Esses
vírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA →
RNA → proteína do dogma central da Biologia Molecular, usando uma
enzima para sintetizar um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma
RNA. Isso mesmo, os retrovírus usam o RNA de seu genoma como
molde para síntese de DNA.
Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de
RNA, cujo nome oficial é DNA polimerase RNA-dependente.
Corriqueiramente, ela é chamada de transcriptase reversa, ou TR, pois
faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que
os pesquisadores conseguiram isolar a TR, ela passou a ser usada para
reações in vitro. Namaioria dos casos, é usada uma TR purificada a
partir de vírus aviários, de forma que as TR não representam nenhum
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risco de infecção ao manipulador e são seguras para diagnóstico e
pesquisa.
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição
reversa (RT - usada daqui em diante para designar a reação em si)
precisa de alguns fatores elementares. O primeiro fator necessário é o
RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que requer muito
cuidado na manipulação e extração do material. Esse RNA é assim
chamado por possuir o mesmo sentido de transcrição e tradução que
um RNA mensageiro (mRNA), mas expande o entendimento para vírus
que nem sempre tem seu RNA+ diretamente traduzido na célula, como
os próprios retrovírus. Além do RNA+, a RT também precisará da enzima
transcriptase reversa para fazer a síntese de cDNA a partir do RNA+.
Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais
rudimentar, a TR não é resistente à temperatura. Dessa forma, a reação
de transcrição reversa deve preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas
temperaturas de desnaturação. Da junção de reação de transcrição
reversa (RT) seguida por PCR, vem o termo RT-PCR. A TR precisará de
pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma
PCR convencional, para iniciar a transcrição.
Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são
chamados de hexâmeros. Eles podem ser específicos para determinada
sequência de RNA, ou podem ser uma sequência curta rica em timinas
(poli-T), que se anelará à cauda poli-A do mRNA, ou podem ser
aleatorizados, sendo este último o mais usado por permitir a síntese e o
armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes.
 Primeiro caso
Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao
RNA (mensageiros ou não) ao qual os hexâmeros
se anelam.
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Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes
para a amplificação de determinada sequência, a RT é linear: cada etapa
acontece apenas uma vez, o que não permite amplificação de sinal.
Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+
por poucos minutos. Na maioria dos casos, não há necessidade de
temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples.
Contudo, podem ocorrer estruturas secundárias no RNA que precisam
de temperaturas moderadas para desnaturação.
Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do
RNA, seguido por anelamento dos hexâmeros iniciadores à sequência-
alvo por complementariedade, e síntese de cDNA pela transcriptase
reversa.
Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT).
Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de
extensão pela TR. Diferentemente da PCR convencional, a RT possui
 Segundo caso
Podemos criar cDNA complementares a todos os
mRNA da célula, o que constitui uma biblioteca de
expressão gênica.
 Terceiro caso
Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma
biblioteca de cDNA correspondente a todos os
RNAs da célula, mensageiros ou não. Similar à PCR,
uma vez que os oligonucleotídeos se ligam à fita de
RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA
complementar usando o quarto reagente, os
desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).
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diversas TR de origens diferentes que podem ser usadas. Assim, os
protocolos variam entre diferentes marcas de enzimas. Em alguns
casos, a RT pode ter apenas essas duas temperaturas, de anelamento e
extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser
armazenado por meses a anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou
usado imediatamente como molde em uma PCR – a chamada RT-PCR.
Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do cDNA em uma
RT-PCR.
Nested-PCR
A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar
determinada sequência que esteja presente em pouquíssima
quantidade. Quando há dificuldade em se amplificar o DNA alvo na PCR
convencional, o gel de agarose pode não ter capacidade suficiente para
evidenciar o amplicon. Nós chamamos essa capacidade de o resultado
representar a realidade de sensibilidade.
A sensibilidade da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do
DNA-alvo, em amostras que possuem o DNA-alvo na realidade.
Normalmente, a PCR tem ótima sensibilidade por aumentar
exponencialmente a sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a
sensibilidade da PCR convencional pode não ser suficiente, pois existe
uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em
que não há aumento do número de fitas devido ao esgotamento dos
reagentes. Então, ter mais de 40 ciclos em uma PCR não oferecerá
nenhum benefício, porém, pode aumentar as chances de produtos
inespecíficos que atrapalharão a interpretação.
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Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por
fluorescência, aumenta exponencialmente até chegar a um platô, em
que não há mais aumento significativo de DNA a cada ciclo.
Gráfico representativo das qPCR.
A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples:
usar uma fração da primeira reação como molde para uma segunda
PCR, em uma técnica conhecida como nested-PCR (ou PCR aninhada).
Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo o par de primers
para a primeira reação, chamado de iniciadores externos, e os primers
usados na segunda PCR, conhecidos como internos.
Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a
primeira reação, e conseguimos aumentar o número de ciclos de
amplificação de, no máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e
80 ciclos no total de ciclos combinados nas duas reações
subsequentes. Consequentemente, aumentamos a quantidade de DNA
amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada
corretamente, a adição de etapa nested pode melhorar muito a
sensibilidade e a especificidade da PCR.
Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles
está no desenho da reação, que deve ser pensada como um conjunto. A
primeira PCR deve possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a
determinada região, permitam que a polimerase produza um amplicon
longo e específico o suficiente para ser usado como DNA-molde na
segunda reação.
Saiba mais
Caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas,
precisaremos levar em consideração uma primeira PCR cujo amplicon
contenha regiões específicas ao redor das repetições, para que haja
uma boa reação secundária. Isso porque, essa última precisa de
iniciadores que se anelem especificamente à região que foi amplificada
anteriormente.
Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da
primeira reação, já que podem reduzir a eficácia da segunda reação,
além de gerar produtos inespecíficos. Outro cuidado recomendável para
a segunda reação é a purificação do produto da primeira reação antes
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de utilizá-lo na segunda, o que evita contaminações entre amostras,
reduz o risco de inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR.
Note o uso de iniciadores externos na primeira reação, amplificando um
produto que será usado como molde de amplificação na segunda
reação, que usa iniciadores internos.
Representação esquemática de uma nested-PCR.
PCR quantitativo em tempo real – qPCR
Até agora, todas as técnicas que discutimosprecisam da eletroforese
em gel de agarose para separação dos produtos da PCR e posterior
revelação das bandas através de agentes intercalantes do DNA que
emitem fluorescência; por exemplo, o brometo de etídio, quando
submetido à luz ultravioleta. Esses tipos de PCR são categorizados
como qualitativos e podem ser muito úteis, especialmente, quando o
DNA amplificado for utilizado em outra técnica subsequente. Entretanto,
existem situações em que a PCR qualitativa se torna pouco informativa.
Exemplo
Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na
redução de um marcador genético específico. Nesse caso, a PCR
convencional e suas variações vistas até agora não informam o
suficiente para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que
revelem a quantidade de certa sequência específica de DNA com o
máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR quantitativa -
também conhecida como PCR em tempo real - (qPCR).
A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de
leitura em tempo real dos resultados, sem necessidade de revelação
posterior. Isso porque, ela possui dois fatores adicionais a uma PCR
qualitativa: a adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um
termociclador capaz de detectar o sinal fluorescente. Dessa forma, a
cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre
aumento da quantidade de DNA-alvo e da emissão de fluorescência
proporcional à quantidade de DNA sendo sintetizada naquele ciclo.
Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de
termocicladores que contenham lasers para excitação do fluoróforo e
detectores da fluorescência. Esse aparelho é mais sofisticado, mais
caro e mais complexo do que um termociclador convencional, porém
seus resultados podem ser igualmente mais informativos e precisos.
Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos ter uma
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temperatura única para anelamento e extensão: todas as duas
acontecem a 60 oC.
Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de amplificação e a
fase de curva de dissociação.
Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e
TaqMan. Elas diferem especialmente na forma como a fluorescência é
emitida e na especificidade do sinal fluorescente. As formas de
quantificação são, por outro lado, semelhantes. Vamos explorar as duas
em mais detalhes? Vejamos!
SYBR Green
O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar
em fitas duplas de DNA. Quando está associado ao DNA, o SYBR pode
ser excitado em comprimento de onda azul, e então emite fluorescência
verde. Quando não está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR tem sua
fluorescência drasticamente reduzida. Por sua capacidade de fluorescer
quando ligado ao DNA fita dupla, ele também é usado como um sistema
alternativo na revelação da PCR convencional em gel de agarose, já que
é menos tóxico que o brometo de etídio.
Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência
na fase de extensão, pois esse é o momento em que há maior número
de bases pareadas em fitas duplas. O aparelho termociclador irá incidir
um laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa
fluorescência será detectada pelo aparelho, que mostrará a quantidade
de fluorescência por ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência
emitida, pois maior será a quantidade de DNA fita dupla sendo
sintetizada.
Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional à
quantidade de DNA amplificado a cada ciclo, até que a reação atinja sua
saturação, e um platô após a curva de crescimento exponencial será
observado. Repare que, quando não está ligado ao DNA dupla fita,
devido à sua desnaturação, o SYBR não emite fluorescência. Ao ligar-se
à fita dupla de DNA, durante a sua extensão, a fluorescência é emitida.
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Esquema ilustrando a teoria por trás da fluorescência do SYBR.
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita
dupla de DNA não é controlada:
O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de
DNA. Isso faz com que a emissão de fluorescência
seja menos específica: como em uma reação
convencional, apenas os oligonucleotídeos iniciadores
são responsáveis pela especificidade. Assim, outras
formas de controle da reação foram criadas para
garantirmos que o sinal fluorescente usado na
quantificação corresponda apenas ao produto
desejado.
Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação
(melting curve). Nessa etapa, o termociclador aquecerá a PCR
lentamente, para medir em qual temperatura 50% das fitas duplas de
DNA sintetizadas se dissociam. Essa dissociação será medida, mais
uma vez, através da fluorescência pelo SYBR. Essa temperatura
dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o tamanho da
sequência.
Por isso, reações de SYBR tem amplicons com tamanho limitado em
cerca de 100 nucleotídeos em média. Em uma curva de dissociação boa
e específica, todas as moléculas amplificadas irão se dissociar na
mesma temperatura e, assim, só um pico é observado no gráfico. Em
uma qPCR por SYBR sem especificidade, mais de um pico será visto na
curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um
importante nível de controle de qualidade da reação que não deverá ser
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ignorado.
A existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas um
produto amplificado, o que confirma a especificidade da qPCR. Observe:
Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma qPCR por SYBR Green.
Quanti�cação absoluta por SYBR
Confira mais detalhes sobre PCR em tempo real pela metodologia SYBR
para fazer uma curva de quantificação absoluta.
TaqMan
Outra forma bastante comum de qPCR, cujo nome vem da referência ao
jogo de videogame dos anos 1980, PacMan. Assim como na técnica
SYBR, a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da
emissão e detecção de fluorescência a cada ciclo de amplificação.
Entretanto, a TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão da
fluorescência acontece: Além de todos os reagentes que uma PCR
convencional possui, temos a presença de uma sequência extra,

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complementar à região interna dos iniciadores. Essa sequência extra é
conhecida como sonda e é curta, com tamanho aproximadamente igual
ao dos oligonucleotídeos iniciadores, e possui temperatura de
anelamento pouco superior à deles. A sonda contém uma molécula
fluorescente na extremidade 5’, e outra molécula na extremidade 3’, que
bloqueia a emissão de fluorescência.
A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada
não representa muito, se a molécula fluorescente não for liberada de seu
bloqueador. Para isso, a enzima Taq polimerase usada na TaqMan é
diferente das outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos
(polimerização), como as demais polimerases, e remove nucleotídeos
(função exonuclease).
A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da
fluorescência, pois, quando a enzima chega ao nucleotídeo da sonda
que contém o fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará
livre de seu bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável. A cada
novo ciclo da PCR, as fitas duplas serão desnaturadas, os iniciadores e a
sonda se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com
remoção dos nucleotídeos da sonda, o fluoróforo nela contida é liberado
para emitir fluorescência proporcional a cada nova sequência-alvo
sintetizada.
Repare na ilustraçãoque a sonda anelada entre os dois iniciadores é
clivada pela TaqMan polimerase durante a extensão do DNA, permitindo
a emissão de fluorescência.
Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan.
A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da
reação: o anelamento da sonda é específico para a região alvo a ser
amplificada. A especificidade dada pela sonda é tamanha que
diferenças de apenas um nucleotídeo podem ser detectadas – essas
mutações são conhecidas como single nucleotide polymorphism (SNP).
Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação
da especificidade, como a curva de dissociação, o que a faz mais rápida
do que a técnica de SYBR. Entretanto, as sondas tornam a reação mais
cara. Outra vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a
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capacidade de múltiplas detecções na mesma reação com maior
precisão e confiabilidade. Veremos mais detalhes à frente.
Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o
DNA ou cDNA. A técnica como a quantificação é obtida varia, mas a
maioria das análises posteriores podem ser usadas igualmente – uma
vez que resultados confiáveis tenham sido obtidos através de rigoroso
controle de qualidade.
Quanti�cação
Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá
fluorescência, que será detectada pelo aparelho.
O primeiro ciclo em que a fluorescência de determinada amostra
ultrapassa o limiar de detecção acima do ruído (ou da fluorescência de
base) é chamado de valor de Ct. Esse valor é importante por estar
diretamente relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo da amostra
amplificada. A relação entre concentração inicial de DNA-alvo na
amostra e Ct é inversamente proporcional, o que significa que, quanto
menor for o Ct de uma amostra, maior a quantidade de DNA que ela
originalmente continha.
 Deve-se ajustar o programa do aparelho para que
ele saiba qual laser e quais filtros usar para a
excitação de cada fluoróforo e em qual espectro da
emissão ele deverá buscar o sinal para detecção.
Isto é, você é o responsável em dizer ao aparelho o
que ele deve fazer.
 Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine,
nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o nível em
que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído.
Como a qPCR utiliza fluoróforos para a
quantificação, por vezes existe um “vazamento” de
fluorescência no início da reação que não está
relacionada com a amplificação da sequência-alvo
em si.
 Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos
primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído
(background). O ruído vai ser utilizado para
determinar o limiar de detecção (threshold).
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Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para
ajustar (ou normalizar) a reação internamente são a
ROX, um fluoróforo passivo (cuja fluorescência não
aumenta de acordo com a amplificação do DNA) usado
como referência, e o Rn, que representa um ajuste (ou
normalização) entre o sinal do fluoróforo de escolha
(SYBR ou da sonda TaqMan) e a referência ROX. A
maioria dos reagentes para qPCR já possuem ROX
adicionados ao tampão, cabendo a nós apenas a
observação para eventual detecção de anomalias que
podem invalidar a reação. Mais uma vez, a qPCR tem
que manter padrões rígidos de controle de qualidade
para que diferenças mínimas na quantidade sejam
confiáveis.
Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais
modernos detectarão o sinal emitido a cada ciclo e darão, em tempo
real, o resultado na tela do computador ao qual ele precisa estar ligado
para funcionar, em um gráfico chamado de curva de amplificação.
Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da
Saccharomyces cerevisae. Note a reta paralela ao eixo x (horizontal), que
representa o valor de limiar de detecção / quantificação. Abaixo dela,
temos o ruído da reação. As curvas amarelas e vermelhas representam
a quantificação das amostras e, como você pode observar, existem 4
amostras em duplicata; a com maior quantidade de DNA é a mais à
esquerda no gráfico, com menor Ct.
Você consegue dizer qual é o Ct da amostra mais concentrada?
Gráfico de amplificação.
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva
padrão e por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou
ΔΔCt).
Pela curva padrão
Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é
necessária. Para isso, devemos ter em mãos uma curva padrão, com
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concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa curva pode ser comprada
de laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós
mesmos, através de clonagens e purificação. A partir da concentração
mais alta, faremos uma diluição seriada. Para isso, colocamos uma
fração da solução de maior concentração em um tubo contendo apenas
água, e depois deste tubo para outro com apenas água, e assim
sucessivamente até termos pelo menos 5 pontos de curva.
Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) como exemplo, porém para a nossa
metodologia é utilizada a escala em microlitro (µL).
Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada
concentração da curva está, de forma que o próprio computador calcule
os parâmetros de qualidade da curva. Com esses valores, o computador
calcula a quantidade de DNA existente nas nossas amostras de
concentração desconhecida. Alguns dos principais valores dados pela
curva padrão que usamos para determinar a concentração da amostra-
teste são a linearidade da curva e a eficiência de amplificação.
Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da
curva padrão (em vermelho), obtidas pela diluição seriada, e três
amostras desconhecidas (em azul) cuja quantidade de DNA foi
calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da curva
padrão.
Exemplo de curva padrão para quantificação absoluta do DNA.
Linearidade da curva
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Matematicamente conhecida como R2,, deve ser superior a 0.985 para
que a reação seja aceitável, e a quantificação de sua amostra-teste seja
calculada com máximo de precisão. Usando fórmulas de linearidade,
calculamos o valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da
amplificação começar, baseado no Ct de cada uma.
E�ciência de ampli�cação
Com ela, a cada ciclo, espera-se que a quantidade de DNA-alvo
amplificado dobre, o que significaria uma eficiência de 100% da reação.
Porém, devido a pequenos erros, podemos considerar aceitáveis
eficiências que variem entre 90 e 110%. Esses parâmetros serão mais
robustos com uso de replicatas (repetições da mesma reação em poços
diferentes.).
Por quanti�cação relativa, ou método de delta-
delta-CT (ou ΔΔCt)
Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o
DNA de interesse, cuja quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA
de referência. A determinação da quantidade de um DNA-alvo de
interesse é feita a partir da subtração (ou seja, o delta) do Ct (ciclo em
que a amostra ultrapassou o limiar) pelo Ct do outro DNA quantificado
na amostra, o de referência. Isso porque, a quantidade do gene de
interesse pode variar de acordo com diversos fatores biológicos, mas
também pode ser devido à quantidade de material usado na extração.
Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA
total e, para isso, usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um
gene constitutivo expresso em níveis estáveis nas células. O segundo
delta, ou a segunda subtração, é feita entre a diferença da primeira
subtraçãona amostra-teste e uma amostra controle, usada como
calibradora. A amostra calibradora também precisará ter passado pela
primeira subtração; ou seja, também terá sido normalizada. Dessa
forma, temos:
Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de
quantificação dos dois DNAs-alvo têm eficiência entre 90-110%, e não
devem diferir em mais de 10% entre si. Por isso, curvas-padrão iniciais
para cada gene devem ser construídas para se verificar as eficiências da
reação, antes de procedermos para a técnica de quantificação relativa.
Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e
um calibrador, usamos um método especial. Você consegue identificar
qual? A pista mais importante é: você está investigando a expressão
gênica, e não a existência do gene em si. Portanto, você não está
olhando diretamente o genoma, mas um produto dele. Qual produto do
DNA podemos detectar via PCR?
Resposta
Δ Ct = Ctgene alvo − Ctgene de referéncia SeguidoporΔ Δ Ct = (Ctgene alvo − Ctgene de referencia )calibrador − (Ctg
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Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e
completo da técnica utilizada é RT-qPCR: uma reação de transcrição
reversa acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.
PCR em multiplex
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja
de PCR convencional, nested-PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos
detectar mais de um alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações
separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores
específicos para cada produto desejado, e depois fundir as duas PCRs
em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é
identificado chamamos de multiplex – múltiplos produtos são
detectados, e até quantificados.
Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já
conversamos e, é claro, os quatro (ou mais) oligonucleotídeos
necessários, sendo cada par correspondente à sua sequência-alvo. O
mais importante para fazermos um multiplex em uma PCR convencional
é que os amplicons tenham tamanhos distintos o suficiente para serem
separados pelo gel de agarose, a fim de que os sinais de ultravioleta não
sejam confundidos. Normalmente, os produtos menores de 1000 pares
de base (pb) devem ter mais de 200 pb de diferença. Para produtos
maiores de 1000 pb, a diferença entre os produtos também deve ser
maior.
Lembre-se de que você deverá levar em consideração
o tamanho do maior produto para o tempo de
extensão. Outro fator ao qual você deverá estar atento
é a temperatura de anelamento dos múltiplos pares de
iniciadores, que devem ter temperaturas o mais
próximas possível.
Em uma qPCR-TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes
sequências na mesma reação é possível ao utilizarmos duas (ou mais)
sondas distintas, cada uma capaz de hibridizar especificamente a sua
sequência-alvo, e ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e
emitam fluorescência em comprimentos de onda diferentes.
Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de
onda azul e emita fluorescência no espectro verde, e outro fluoróforo
que seja excitado e floresça no comprimento vermelho, e assim por
diante.
Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR
são mais difíceis. Isso porque a emissão de fluorescência pelo SYBR é
inespecífica e ocorre sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas
do DNA. Assim, a reação multiplex fica limitada e, muitas vezes, não é
possível distinguirmos entre os sinais dos diferentes produtos.
Em alguns casos, entretanto, a distinção é possível graças à curva de
dissociação. Isso ocorre quando os produtos distintos têm sequências
diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação de 50%.
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Então, observamos dois picos na curva de dissociação, em
temperaturas diferentes. No entanto, sequências distintas sem diferença
suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas, pois
não veremos diferenças em suas curvas de dissociação.
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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na
pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações, é
correto afirmar que
Parabéns! A alternativa C está correta.
A Taq polimerase usada para amplificação de DNA não é capaz de
reconhecer e polimerizar RNA. Quando queremos analisar RNAm,
precisamos que o cDNA seja sintetizado pela DNA-polimerase RT
dependente, ou transcriptase reversa. Então, usamos o cDNA
sintetizado como molde em uma PCR.
Questão 2
Existem diferentes técnicas de PCR com aplicações variadas.
Considerando isso, leia as afirmativas abaixo e, em seguida,
A
na nested-PCR, fazemos duas reações em um único
tubo, amplificando regiões diferentes que geram
produtos de tamanhos distintos.
B
o SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex
que dá maior estabilidade à reação.
C
na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes:
uma de síntese de cDNA a partir de RNA, e outra de
amplificação da sequência-alvo presente no cDNA.
D
uma PCR multiplex consiste em utilizar duas
reações subsequentes, sendo que o produto
amplificado da primeira serve como molde para
amplificação na segunda.
E
a reação de transcrição reversa utiliza uma
polimerase especial, capaz de sintetizar RNA a partir
de DNA.
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assinale a alternativa correta.
I – Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e
cloná-lo em um vetor, e modificarmos geneticamente um organismo
simples.
II – Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes,
a qPCR TaqMan pode ser usada na identificação e quantificação de
mutações em diferentes alelos.
III – As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina
clínica, pois são demoradas e de aplicações muito restritas.
IV – O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças
genéticas.
Parabéns! A alternativa A está correta.
A PCR convencional pode ser utilizada para clonar um gene através
de um vetor, como plasmídeo. Na qPCR-TaqMan, as sondas
auxiliam na quantificação de mutações de alelos diferentes. O
tamanho e conteúdo das STRs oferecem grande precisão na
identificação de indivíduos. As técnicas moleculares, como a PCR e
as suas variações, têm ganhado muito espaço na rotina clínica. Há
situações em que o diagnóstico por amplificação de ácidos
nucleicos é o padrão-ouro e, às vezes, é a única opção. Suas
aplicações vão de diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas
ao acompanhamento da evolução e tratamento de cânceres e
infecções crônicas, assim como determinação de riscos genéticos
e aconselhamentos.
A Somente as afirmativas I, II e IV estão corretas.
B Somente as afirmativas I e IV estão corretas.
C Somente as afirmativas III e IV estão corretas.
D Somente as afirmativas I e II estão corretas.
E Somente as afirmativas I, III e IV estão corretas.
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3 - Aplicações apropriadas ao uso de cada método
Ao �nal deste módulo, você será capaz de identi�car aplicações apropriadas ao uso de cada
método.
Aplicações da PCR
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial
de uma sequência específica de DNA até termos milhões e bilhões de
cópias da mesma exata sequência, ou amplicon, que pode ser
visualizada a partir de técnicas especiais. Também vimos algumas
variações daPCR que a tornam ainda mais relevante e útil em diversos
contextos.
Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais
são as aplicações disso? Para ilustrar melhor o quão útil a PCR é,
veremos alguns exemplos a seguir.
A PCR e as suas variantes em ciências
forenses
A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a
aplicação forense. Você já deve ter entrado em contato com a
identificação de um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do
crime, seja por ter assistido a alguma série policial, seja por ter lido
alguma reportagem da vida real. Isso só é possível porque cada ser
humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos
idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista
forense pode olhar para confirmar a origem do DNA. Denominadas
marcadores moleculares, elas são conhecidas pela alta frequência de
polimorfismos genéticos – regiões com grande variação na sequência
de DNA entre indivíduos sem causar nenhum tipo de interferência
funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.
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Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises
forenses são as repetições curtas em tandem (ou STRs – short tandem
repeats).
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as
pessoas e oferecem grande precisão na identificação
de indivíduos se a detecção de várias STRs for usada
em conjunto.
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil
genético pode ser visualizado por separação das bandas em gel de
agarose e coloração por brometo de etídio.
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser
usado para, assim, aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse
caso, o perito pode optar pelo uso de uma nested-PCR, lembrando que
os primers externos e interno precisam de regiões não repetidas para se
anelarem. Um cientista forense, além de fazer a extração do DNA e sua
amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos através do seu
perfil genético.
Ilustração de um gel de agarose mostrando múltiplas bandas e representando os marcadores
moleculares.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de
doenças genéticas
Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina,
de prevenção ao diagnóstico, acompanhamento e prognóstico, ou
evolução, de doenças. Ao amplificarmos certas regiões do DNA,
podemos identificar a presença ou ausência de sequências que
deveriam ou não existir em determinado contexto. Seu uso pode auxiliar,
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ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que
variam desde genéticas a infecciosas. As doenças genéticas podem ser
muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes perfis –
autossômico dominante ou recessivo, ligado ao cromossomo X,
multifatoriais e multigênicas. O uso da PCR no diagnóstico dessas
doenças pode ser feito de diversas maneiras, dependendo de qual é a
doença e de seu perfil genético.
O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo
expresso, dentre dois alelos distintos, em uma mesma reação e assim
ajudar no reconhecimento de pequenas mutações que levariam ao
desenvolvimento de uma doença genética. Mas temos outras
aplicações, usando PCR convencional.
Vamos usar a doença de Huntington como exemplo. Nessa doença
genética autossômica dominante, ocorre um excesso de repetição de
três nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica uma proteína chamada
Huntingtina. Esse excesso leva a uma doença neurodegenerativa sem
cura que causa perdas motoras, cognitivas e psiquiátricas ainda na
idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil também. A PCR
torna-se uma importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar
sequências próximas da região de repetição, pode nos dizer seu
tamanho e, assim, informar o risco e até o prognóstico da doença em si.
Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em
pessoas portadoras de Huntington, o número de repetições aumenta
para 35 ou mais. De modo geral, quanto maior o número de repetições,
maior o risco de aparecimento e de progressão da doença. Essa
gradação de fenótipo – no caso da doença de Huntington, de sintomas
– é algo conhecido em genética como penetrância.
Atenção!
Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores
que se anelem próximo a STRs, mas não nas STRs em si, pois isso
geraria inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de
doenças infecciosas
Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da
PCR para diagnóstico de doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para
amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos
diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não
deveria estar presente naquela amostra biológica. Sua simples presença
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pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da doença.
A PCR é especialmente útil no diagnóstico de organismos fastidiosos,
que não crescem bem em cultivo, como o Mycobacterium tuberculosis,
por possuir alta sensibilidade e especificidade. Em outros casos, a
presença do material genético de determinado microrganismo não é
suficiente para seu diagnóstico como agente causador da doença, e
testes complementares a PCR podem ser necessários, assim como
técnicas de PCR mais elaboradas que darão maiores informações.
Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular da covid-19. O SARS-
CoV2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), assim como os
demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético.
Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um
cDNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.
Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação
de casos ativos de infecção pelo SARS-CoV2. Isso porque, o material
genético viral é identificado de forma relativamente rápida – entre
coleta, extração, RT e qPCR, o resultado pode sair em algumas horas.
Além disso, esse método é muito sensível e específico, conseguindo
detectar nas amostras pequenas concentrações do vírus (carga viral).
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A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de
outras infecções virais. A efetividade do tratamento para HIV pode ser
monitorada através de RT-qPCR, sendo esperadas reduções drásticas na
carga viral após introdução da terapia. O mesmo princípio de
quantificação de cDNA obtido por transcrição reversa também é
aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em leucemias e
linfomas: o oncologista pode requerer uma RT-qPCR para
acompanhamento de determinado marcador gênico do câncer em
questão.
Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao
longo do tempo podem ser cruciais no tratamento e evolução do
paciente. A PCR convencional multiplex também pode ser utilizada no
diagnóstico diferencial entre dois patógenos que possam causar os
mesmos sintomas, mas que exigem abordagens clínicas diferentes.
Exemplo
Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames
bioquímicos que levem o nefrologista a pensar em duas possibilidades:
na primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade pode estar
acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na
segunda, pode estar acontecendo uma infecção viral grave no rim
transplantado que poderia rapidamente levar à perda do órgão e até
mesmo ao óbito do paciente.A PCR e as suas variantes em pesquisa
cientí�ca
Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas
ocasiões, a PCR pode ser utilizada para manipulação genética de
organismos simples, como bactérias, leveduras e células em cultivo.
Nesse contexto, podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um
gene. Fazemos isso ao amplificarmos a sequência gênica que
desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas
regiões distintas. A primeira região liga-se ao gene que queremos
manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda
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é a região que se liga ao DNA molde do vetor dentro do qual queremos
colocar nosso gene clonado.
O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do
organismo alvo, mas que é capaz de se replicar autonomamente quando
inserido na célula. Um exemplo de vetores muito usados são os
plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de
uma célula a outra, comuns em bactérias.
Representação esquemática de uma técnica de clonagem por restrição, com a inserção (ou
clonagem) de um gene de origem diferente, que foi amplificado por PCR, ao vetor original.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para
amplificarmos o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa,
usamos o produto amplificado, juntamente com o vetor, para inserirmos
o gene clonado no vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de
enzimas de restrição para cortar o DNA em pontos específicos, após
amplificação por PCR.
A pesquisa científica é uma área de atuação muito
grande e, por vezes, ela está interessada em entender
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mecanismos complexos de regulação genética sob
diversas condições. A RT-qPCR é uma ferramenta
muito útil nesse caso, para a avaliação dos níveis de
expressão de genes em células submetidas a diversas
condições diferentes.
É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a
quantidade de um gene de interesse com um gene constitutivo de
expressão estável) para avaliarmos como o metabolismo celular pode
mudar mediante o meio que se encontra. Em geral, você pode
considerar que qualquer aplicação que determinado método ou técnica
tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas áreas não apenas é
usada em pesquisa científica, como, provavelmente, foi originada de
uma.
Quanti�cação relativa de genes por
RT-qPCR e seu uso em pesquisa
Veja mais sobre quantificação relativa usando RT-qPCR pelo método de
SYBR.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na
pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações em
ciências forenses, é correto afirmar que:
A
a nested-PCR não é útil, uma vez que o material
genético é encontrado em abundância em situações
forenses.
B
a PCR pode nos dar informações importantes, mas
não pode determinar a identidade de indivíduos.
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Parabéns! A alternativa C está correta.
Short tandem repeats (STRs) apresentam grande variação de
sequência e de tamanho entre indivíduos. Pela identificação de
diferentes padrões de um conjunto de STRs, podemos correlacionar
amostras com grande precisão, além ser possível também
estabelecer grau de parentesco.
Questão 2
A técnica de PCR e suas variações são metodologias importantes
para amplificações na pesquisa e diagnósticos. Sobre a PCR,
escolha a alternativa correta:
C
as STRs são regiões cuja variabilidade as tornam
úteis para distinguir indivíduos geneticamente.
D
a qPCR é uma ferramenta necessária para
amplificação do material genético de uma amostra
antes de seu sequenciamento.
E
o sequenciamento do genoma não é uma
ferramenta viável para a identificação de indivíduos,
além de ser trabalhoso e caro.
A
Um dos principais métodos utilizados em análises
forenses é o sequenciamento de genes
conservados dentro de um DNA.
B
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre
genes diferentes dentro de um mesmo organismo e
oferecem grande precisão na identificação de
cromossomos se a detecção de várias STRs for
usada em conjunto.
C
Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA)
de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar
uma infecção, já que o material genético de tal
agente não deveria estar presente naquela amostra
biológica.
D
Normalmente, para usarmos a clonagem por PCR
basta a amplificação do gene alvo que queremos
clonar.
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Parabéns! A alternativa C está correta.
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises
forenses são as repetições curtas em tandem e não sequências
conservadas. As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as
pessoas e oferecem grande precisão na identificação de indivíduos
se a detecção de várias STRs for usada em conjunto. Este processo
não compara genes entre cromossomos de um único indivíduo,
mas vários. Normalmente, usamos a clonagem por PCR para
amplificar o gene alvo e depois inserir o gene clonado no vetor. O
diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2, assim como os
demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético.
Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um
DNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-
qPCR.
Considerações �nais
Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia
da polimerase, em que a variação cíclica de temperatura permite a
desnaturação, o anelamento e a extensão de sequências-alvo
específicas, de acordo com aquelas que desejamos detectar. Como
estudado, os oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita simples de
DNA que foi aberta por desnaturação por complementariedade entre as
bases nitrogenadas. Essas últimas são elementos fundamentais dos
nucleotídeos por conterem a informação genética.
As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos
conhecê-las para podermos escolher qual a melhor técnica para cada
caso: para aumentar a quantidade final de DNA-alvo amplificado; para
síntese de cDNA a partir de RNA polaridade positiva; para quantificação
de DNA ou cDNA; e para diferenciação rápida entre diferentes produtos
de amplificação.
Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e
as suas variações têm em áreas da ciência, como na forense, na
pesquisa e na clínica, participando do diagnóstico, acompanhamento e
prognóstico.
Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da
Biologia Molecular, uma área empolgante e que se torna, a cada dia,
mais importante para diversas áreas das ciências biológicas.
E
O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2,
assim como os demais coronavírus, tem o DNA
como material genético. Isso facilita o processo de
laboratório porque o material já está disponível para
qPCR.
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