Yeast - 2010 - Partow - Characterization of different promoters for designing a new expression vector in Saccharomyces (2) pt

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Levedura
Yeast 2010; 27: 955 - 964.
Publicado on-line em 12 de julho de 2010 na Wiley Online 
Library (wileyonlinelibrary.com) DOI: 10.1002/yea.1806
Artigo de pesquisa
Caracterização de diferentes promotores para 
projetar um novo vetor de expressão em 
Saccharomyces cerevisiae
Siavash Partow1 , Verena Siewers1 , Sara Bjørn2 , Jens Nielsen1 * e Je' roˆme Maury2
1Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, SE-41296 Go¨teborg, Suécia
2Fluxome Sciences A/S, Gymnasievej 5, DK-3660 Stenløse, Dinamarca
*Correspondência para:
Jens Nielsen, Department of 
Chemical and Biological 
Engineering, Chalmers University 
of Technology, Kemiva¨gen 10, 
SE-41296 Go¨teborg, Suécia.
E-mail: nielsenj@chalmers.se
Resumo
A série de vetores pESC amplamente utilizada (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) com o 
promotor bidirecional GAL1 /GAL10 oferece a possibilidade de expressar 
simultaneamente dois genes diferentes a partir de um único vetor em Saccharomyces 
cerevisiae. Esse sistema pode ser induzido por galactose e é reprimido por glicose. Como 
a S. cerevisiae prefere a glicose como fonte de carbono e como sua taxa de crescimento é 
mais alta em glicose do que em meios contendo galactose, comparamos e avaliamos sete 
promotores diferentes expressos durante o crescimento em glicose (pTEF1, pADH1, 
pTPI1, pHXT7, pTDH3, pPGK1 e pPYK1) com dois promotores fortes induzidos por 
galactose (pGAL1 e pGAL10), usando lacZ como gene repórter e medindo a atividade de 
LacZ em lote e em cultivo contínuo. Os promotores TEF1 e PGK1 apresentaram o 
padrão de atividade mais constante em diferentes concentrações de glicose. Com base 
nesses resultados, projetamos e construímos dois novos vetores de expressão que 
contêm os dois promotores constitutivos, TEF1 e PGK1, em orientação oposta um ao 
outro. Esses novos vetores mantêm todos os recursos
do plasmídeo pESC - URA, exceto pelo fato de a expressão gênica ser mediada por 
promotores constitutivos. Direitos autorais © 2010 John Wiley & Sons, Ltd.
Palavras-chave: atividade do promotor; vetor de expressão; promotor bidirecional; 
levedura
Introdução
A Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente 
utilizada como organismo hospedeiro para a 
expressão eficiente de proteínas heterólogas. Para 
atingir esse objetivo, f o r a m projetados e 
desenvolvidos d i f e r e n t e s sistemas de 
expressão, como os plasmídeos integrativos de 
levedura (YIps) para a integração do gene desejado 
no genoma da levedura ou os plasmídeos episomais 
de levedura (YEps) para a expressão de alto número 
de cópias. Com base nesses sistemas, foram 
construídos diferentes plasmídeos que abrigam 
promotores com diferentes perfis de regulação, 
forças e vários recursos adicionais (Miller et al., 
1998; Li et al., 2008; Hermann et al., 1992, 
Mumberg et al., 1994, 1995).
A maioria dos plasmídeos de expressão permite a 
expressão de apenas um gene. Para a expressão de 
vias metabólicas inteiras, por exemplo, é desejável
ser capaz de expressar mais de um gene por unidade 
de plasmídeo. Por exemplo, Miller et al. (1998) 
usaram um promotor bidirecional constitutivamente 
ativo que consiste no promotor da gliceraldeído 3-
fosfato desidrogenase (pGPD = pTDH3 ) e um 
fragmento do promotor da álcool desidrogenase 1 
(pADH1 ). Os vetores de expressão bidirecional 
criados por Li et al. (2008) carregam um promotor 
GAL1 ou GAL10 modificado induzível em uma 
direção e um promotor GPD constitutivo na direção 
inversa.
Um conjunto de vetores de expressão amplamente 
usado em S. cerevisiae é a série pESC da 
Stratagene, com o cassete promotor bidirecional 
GAL1 /GAL10 que oferece a possibilidade de 
expressar dois genes diferentes ao mesmo tempo em 
um único v e t o r , e sua aplicabilidade bem-
sucedida já foi publicada anteriormente (por 
exemplo, Maury et al., 2008; Asadol-lahi et al., 
2007). Sistemas de expressão baseados na
Direitos autorais © 2010 John Wiley & Sons, Ltd.
Recebido: 2 de dezembro de 
2009
Aceito: 31 de maio de 2010
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956S . Partow et al.
Os promotores GAL1/GAL10 estão entre os mais 
fortes (Schneider et al., 1991). No entanto, a 
expressão dos promotores GAL1 e GAL10 está 
sujeita tanto à indução de galactose quanto à 
r e p r e s e n t a ç ã o de glicose (Zhang e Rathod, 
2002; Lohr et al., 1995; West et al., 1987). Essa é 
uma grande desvantagem, pois as fontes de carbono 
preferidas das leveduras são a glicose e a frutose; 
além disso, o indutor galactose pode ser considerado 
muito caro quando o foco é aumentar a síntese de 
produtos comercialmente valiosos (Haufa et al., 
2000). Além disso, a mudança de glicose para 
galactose causa grandes mudanças metabólicas 
(Quintero et al., 2007). Para desenvolver um 
sistema experimental à base de glicose análogo ao 
sistema GAL1 /GAL10 dos vetores pESC, iniciamos 
este estudo com o objetivo de comparar a força 
desses dois fortes promotores à base de galactose 
com diferentes promotores à base de glicose. Vários 
promotores fortes de glicose foram descritos 
anteriormente e demonstraram ser úteis para a 
expressão de genes heterólogos em leveduras. Neste 
estudo, comparamos a força de sete diferentes 
promotores constitutivos ou baseados em glicose 
derivados dos seguintes genes [TEF1, que codifica o 
fator de alongamento transcricional EF-1α 
(Gatignol et al., 1990); PGK1, que codifica a 
fosfoglicerato quinase (Ogden et al., 1986; Holland 
e Holland, 1978); TPI1, que codifica a triose fosfato 
isomerase; HXT7, que codifica um transportador de 
hexose (Diderich et al, 1999; Reifenberger et al., 
1997); PYK1, que codifica a piruvato quinase 1 
(Nishizawa et al., 1989); ADH1, que codifica a 
álcool desidrogenase 1 (Denis et al, 1983); e TDH3 
(GPD ), que codifica a triose fosfato desidrogenase 
(Bitter e Egan 1984)] com a força dos promotores 
GAL1 e GAL10 (Adams, 1972; St. John et al., 1981; 
Laughon e Gestland, 1982). Quatro desses 
promotores (pPGK1, pTPI1, pPYK1 e pTDH3) são 
promotores de genes glicolíticos importantes e, na 
literatura, são geralmente considerados promotores 
fortes. O comprimento total de pADH1, pTEF1 e 
pTDH3 também foi utilizado para construir a série 
de vetores p4XXprom amplamente utilizada 
(Mumberg et al., 1996). Para essa comparação, 
usamos o lacZ como gene repórter e construímos 
nove diferentes plasmídeos integrativos, nos quais a 
expressão do lacZ foi controlada por qualquer um 
desses promotores. Em todos os casos, os 
plasmídeos integrativos construídos foram 
integrados ao locus URA3.
Com base nessa análise, construímos dois novos 
cassetes de expressão divergentes, substituindo o
Promotores GAL1/GAL10 em pESC - URA com um 
cassete promotor bidirecional TEF1-PGK1 em duas 
orientações diferentes. Esses dois novos vetores são 
chamados de pSP-G1 e pSP-G2, respectivamente.
Materiais e métodos
Construção de plasmídeos integrativos
O vetor integrativo pSF011 usado neste estudo foi 
derivado do pRS306 (Sikorski e Hieter, 1989). Ele 
contém URA3 como marcador selecionável e o gene 
repórter lacZ localizado a jusante de um sítio de 
clonagem múltipla (MCS) (Figura 1). lacZ e o 
terminador CYC1 foram clonados conforme descrito 
anteriormente (Flagfeldt et al., 2009). Todos os 
promotores baseados em glicose foram amplificados 
por PCR a partir do genoma de S. cerevisiae 
CEN.PK 113-7D (MAT a MAL2-8c SUC2; 
gentilmente cedido por P. Ko¨tter, Universidade de 
Frankfurt, Alemanha). Os amplicons de cada um 
dos sete promotores baseados em glicose (pTEF1, 
pPYK1, pHXT7, pPGK1, pTPI1, pADH1 e pTDH3) 
foram digeridos por Not I- XhoI e clonados no 
pSF011 a montante do lacZ. O promotor GAL10 foi 
clonado no pSF011 como um fragmento Not I-
BamHI isolado do pESC - URA (Stratagene, La 
Jolla, CA, EUA). O promotor GAL1 foi primeiro 
amplificado por PCR a partir do pESC - URA, 
digerido por XhoI-BamHI e clonado no pSF011.A 
Tabela 1 mostra todos os primers usados para 
amplificar os promotores.
Transformação de S. cerevisiae
Os plasmídeos integrativos foram linearizados por 
NcoI e transformados em S. cerevisiae CEN.PK 
113-5D (MAT a MAL2-8c SUC2 ura3-52 ; 
gentilmente cedido por P. Ko¨tter) usando um 
procedimento padrão de trans- formação (Gietz e 
Woods, 2002). Os transformantes foram 
selecionados em placas contendo
Figura 1. pSF011, plasmídeo integrativo
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Caracterização de promotores para projetar um novo vetor de expressão em S. cerevisiae 957
Tabela 1. Primers de oligonucleotídeos usados neste estudo
Nome do primerSequência (5r -3 )r
pADH1-top GTTGTTCTCGAGGGGGGGATCGAAGAAATGATG
pADH1-bot GTTGTTGCGGCCGCTGTATATGAGATAGTTGATTG
pHXT7-top GTTGTTCTCGAGCCGTGGAAATGAGGGGTATG
pHXT7-bot GTTGTTGCGGCCGCTTTTTGATTAAAATTAAAAAAAC
pPGK1-top GTTGTTCTCGAGGGAAGTACCTTCAAAGAATG
pPGK1-bot GTTGTTGCGGCCGCTTGTTTTTTATATTTGTTGTAAAAAG
pPYK1-top GTTGTTCTCGAGGAAAGTTTTTCCGGCAAGCT
pPYK1-bot GTTGTTGCGGCCGCTGTGATGATGTTTTTTATTTGT
pTEF1-top GTTGTTCTCGAGGCACACACCATAGCTTCAAA
pTEF1-bot GTTGTTGCGGCCGCTTGTAATTAAAACTTAGATTAG
pTPI1-top GTTGTTCTCGAGCTACGTATGGTCATTTCTTC
pTPI1-bot GTTGTTGCGGCCGCTTTTAGTTTATGTATGTG
pTDH3-top GTTGTTCTCGAGCAGTTTATCATTATCAATACTCGCC
pTDH3-bot GTTGTTGCGGCCGCGAATCCGTCGAAACTAAGTTCTGGTG
pGAL1-FW GTTGTTCTCGAGCGTCGTCATCCTTGTAATCC
pGAL1-RE ATCAACTTCTGTTCCATGTCG
Pgk-fw GGAAGTACCTTCAAAGAATGG
Tef-fw CCATTCTTTGAAGGTACTTCCGGCCGGGGGCACACACCATAGCTTCAAA
Tef-BamHI GTTGTTGGATCCTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGC
Tef-NotI GTTGTTGCGGCCGCTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGC
Pgk-BamHI GTTGTTGGATCCTTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG
Pgk-NotI GTTGTTGCGGCCGCTTGTTTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG
Os locais de restrição são indicados em negrito; a sequência sublinhada corresponde aos nucleotídeos sobrepostos.
1,7 g/l de base de nitrogênio de levedura sem 
aminoácidos e sulfato de amônio (Difco 
Laboratories, Detroit, MI, EUA), 5 g/l de sulfato de 
amônio, 0,77 g/l de mistura de suplemento completo 
(CSM sem uracil; MP Biomedicals, Solon, OH, 
EUA), 20 g/l de glicose e 20 g/l de ágar.
Cultivo em frasco agitador
Foram usados frascos Erlenmeyer de 500 ml, com 
tampa de algodão, para pré-culturas e também para 
avaliações de protótipos. Os frascos de agitação 
continham 100 ml de meio com a seguinte 
composição: 7,5 g/l (NH )42 SO4 , 14,4 g/l KH2 PO4 
, 0,5 g/l MgSO4 -7H2 O, 2 ml/l de solução de traços 
de metais, 1 ml/l de solução de vitaminas (Verduyn 
et al., 1993) e 50 μl/l de antiespumante sinperônico 
(Sigma, St. Louis, MO, EUA). O pH do meio foi 
ajustado para 6,5 com a adição de NaOH 2 M e foi 
autoclavado separadamente da solução de glicose 
(galactose) a 20% que foi usada como solução de 
fonte de carbono em uma concentração final de 2%. 
A solução de vitamina foi esterilizada por filtro e 
adicionada assepticamente ao meio após a 
autoclavagem. Os frascos de agitação foram 
colocados em triplicatas e incubados a 30◦ C e 150 
rpm.
Cultivo contínuo
Os cultivos contínuos foram realizados em 
duplicações em biorreatores de vidro bem 
controlados, fabricados pela Braun Biostat, de 2,5 l, 
com um volume de trabalho de 2 l. Os 
fermentadores foram inoculados com uma DO 
inicial de600 = 0,01 a partir das pré-culturas 
líquidas. O meio era idêntico ao usado para os 
cultivos em frascos agitados. Dependendo do 
promotor que estava sendo testado, foi adicionada 
glicose ou galactose como fonte de carbono em uma 
concentração de 2%. O pH foi mantido em 5 pela 
adição automática de KOH 2 M. A temperatura foi 
mantida constante em 30◦ C. O fluxo de ar era de 4 
l/min (2 vvm) e foi e s t e r i l i z a d o por 
filtração e o gás de escape passou por um 
condensador. A agitação foi ajustada para manter a 
tensão de oxigênio dissolvido acima de 20% da 
proporção de ar. A taxa de diluição foi ajustada para 
0,1/h durante a operação do quimiostato e o estado 
estável foi considerado obtido após cerca de 50 
horas de cultivo.
Ensaio de β-galactosidase
A atividade da β-galactosidase foi testada 
conforme descrito por Miller (1972). 1 ml de cultura 
de células de S. cerevisiae foi centrifugado e o pellet 
de células foi ressuspendido
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(B)
958S . Partow et al.
em 1 ml de tampão Z resfriado (0,06 M Na HPO24 , 
0,04
M NaH2 PO4 , 0,01 M KCl, 0,001 M MgSO4 -7H2 O,
pH 7) e a OD600 foi determinada. 0,1 ml de solução 
celular foi diluído em 0,9 ml de tampão Z contendo 
2,7 ml/l de β-mercaptoetanol (ME). ◦Foram 
adicionados 100 μl de clorofórmio e 50 μl de SDS 
0,1%, e a amostra foi agitada em vórtex por 15 s. A 
r e a ç ã o foi iniciada com a adição de 0,2 ml de 
solução de ONPG (o-nitrofenil-β-galactosídeo) 
pré-aquecida (30 °C) (80 mg de ONPG em 20 ml de 
tampão Z mais ME) e, após o desenvolvimento da 
cor amarela, a reação foi interrompida com a adição 
de 0,5 ml de Na2 CO3 1 M. A mistura da reação foi 
agitada em velocidade máxima e a OD420 foi 
determinada. A atividade de LacZ foi expressa em 
unidades Miller de acordo com a seguinte equação:
Unidades Miller = 1000 × OD420 /(T × V × OD 
)600
em que T é o tempo de reação e V é o volume (ml) 
de cultura usado para o ensaio.
Construção de promotores divergentes
Os promotores TEF1 e PGK1 foram fundidos um ao 
outro para construir promotores divergentes TEF1-
PGK1 por meio de PCR de fusão. A PCR foi 
realizada com a polimerase de DNA de alta 
fidelidade Phusion (Finnzymes, Espoo, Finlândia) 
em duas etapas. Na primeira etapa, cada promotor, 
pTEF1 e pPGK1, foi amplificado usando os primers 
mostrados na Tabela 1 (primers Tef-fw/Tef-BamHI 
e Tef-fw/Tef-Not I para amplificação do promotor 
TEF1 e primers Pgk- fw/Pgk-BamHI e Pgk-fw/Pgk-
Not I para amplificação do promotor PGK1). O 
primer Tef-fw carrega uma saliência na extremidade 
5r que é complementar à extremidade 5r do 
promotor PGK1. Os produtos de PCR da primeira 
etapa foram usados em uma segunda PCR. A 
segunda reação de PCR foi iniciada sem primers, de 
modo que os promotores TEF1 e PGK1 foram 
fundidos um ao outro por meio das partes 
sobrepostas. Após 15 ciclos, os primers foram 
adicionados e o programa foi executado por 30 
ciclos adicionais. O cassete TEF1-PGK1 foi 
digerido por BamHI/Not I e clonado em ambas as 
orientações em pSF011 e pESC - URA. Os dois 
novos plasmídeos gerados pela substituição do 
promotor GAL1/GAL10 em pESC - URA foram 
denominados pSP-G1 e pSP-G2, respectivamente 
(Figura 2A, B).
Figura 2. (A) Vetor pSP-G1; contém o promotor 
bidirecional TEF1 - PGK1. (B) V e t o r pSP- G2; 
contém o promotor bidirecional TEF1 - PGK1
Resultados e discussão
Comparação de promotores
Várias fusões de lacZ foram construídas para 
comparação da atividade de diferentes promotores, 
incluindo TPI1, ADH1, TEF1, PGK1, TDH3, PYK1
e HXT7. Essas fusões foram integradas de forma 
estável em uma única cópia no genoma de S. 
cerevisiae CEN.PK 113-5D, na região ura3-
52 locus. Embora na última década diferentes 
sistemas repórteres tenham sido desenvolvidos e 
usados para análise de promotores em S. cerevisiae, 
c o m o a proteína fluorescente verde (Li et al., 
2000; Nieden- thal et al., 1996), β-lactamase 
(Cartwright et al., 1994) e β-D-glucuronidase(Nacken et 
al, 1996), a β-galactosidase codificada pelo gene 
lacZ de Escherichia coli é o repórter de expressão 
gênica mais comumente empregado em S. 
cerevisiae e é amplamente utilizado para diferentes 
fins (Yocum et al., 1984; Flick e Johnston, 1990; 
Hermann et al., 1992). Foi demonstrado que o lacZ 
como marcador repórter não é compatível com um 
vetor de alto número de cópias, mas é adequado 
para o monitoramento da expressão em monocópias 
(Purvis et al., 1987). Como queríamos apenas 
comparar a força de diferentes promotores e evitar 
variações no número de cópias do gene, usamos 
lacZ em um plasmídeo integrativo pSF011 para essa 
comparação.
Primeiro, comparamos os promotores à base de 
glicose entre si. A expressão de lacZ controlada por
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Caracterização de promotores para projetar um novo vetor de expressão em S. cerevisiae 959
Tabela 2. Atividades (%) dos promotores usados neste 
estudo
Tempo
Glicose Etanol
(horas) pADH1 pHXT7 pPGK1 pPYK1 pTPI1 pTDH3 pTEF1 (g/l) (g/l)
8 20 10 100 60 60 100 100 12.88 0.44
24 27 109 52 27 31 31 156 nd 0.96
48 14 150 45 14 27 27 136 nd 0.42
As atividades foram normalizadas definindo-se a atividade de pTEF1 às 8 
h como 100%. nd, não detectado.
por esses promotores foi testado 8, 24 e 48 horas 
após a inoculação em frascos agitados com 2% de 
glicose. Os resultados são mostrados na Tabela 2. 
Como o promotor TEF1 é um dos promotores 
constitutivos mais fortes (Gatignol et al., 1990) e 
como ele apresentou a atividade mais estável e mais 
alta em diferentes momentos, optamos por definir a 
atividade do pTEF1 às 8 horas como 100% e 
comparamos a atividade dos outros promotores em 
relação à atividade do pTEF1 nesse momento. Os 
resultados mostraram que, após 8 horas, pPGK1 e 
pTDH3 tinham a mesma atividade que pTEF1. 
pTPI1 e pPYK1 apresentaram 60% da atividade de 
pTEF1. A atividade de pADH1 e pHXT7 foi de 20% 
e 10% da atividade de pTEF1, respectivamente.
Após 24 horas, os promotores ADH1, TPI1, PYK1 
e TDH3 mostraram uma diminuição na expressão e 
suas atividades estavam na faixa de 27 a 31% da 
atividade de pTEF1 às 8 horas. Hauf et al. (2000) 
compararam os promotores TPI1, PGK1, ENO1, 
PYK1, PDC1 e ADH1 entre si e também mostraram 
que, em meio de etanol, o pPYK1 era o mais fraco e 
que o pTPI1 e o pPGK1 tinham atividade 
semelhante em meio de etanol. A Adh1p é 
responsável pela produção de etanol durante o 
crescimento com glicose (Young et al., 1982) e a 
expressão da ADH1 foi reduzida quando as células 
entraram na fase de crescimento com etanol ou 
durante o crescimento com fontes de carbono não 
fermentáveis (Denis et al., 1983). No entanto, 
Ruohonen et al. (1995) demonstraram que 
fragmentos curtos e médios do promotor ADH1 
mantiveram sua atividade durante a fase de etanol. 
A atividade do pPGK1 também diminuiu, enquanto 
a atividade do pHXT7 aumentou continuamente até 
48 h, quando atingiu 150% da atividade inicial do 
TEF1 (Tabela 2). Nossos resultados obtidos para o 
promotor HXT7 podem ser explicados por 
investigações anteriores que definem o Hxt7p como 
um transportador de hexose de alta afinidade que é 
altamente expresso em baixa concentração de 
glicose (<4,4 mM) (Reifenberger et al., 1995; Sedlak 
e Ho, 2004). No último momento, após 48 horas, a 
atividade de
A maioria dos promotores não sofreu alterações 
significativas em comparação com a medição 
anterior, exceto que as atividades de pADH1 e 
pPYK1 diminuíram e ambos os promotores foram 
considerados os promotores mais fracos neste 
estudo.
Em conclusão, observamos que a atividade do 
promotor variou com a concentração de glicose e 
com o fato de as células estarem crescendo com 
glicose ou etanol. Em conjunto, as 
a t i v i d a d e s d o s p r o m o t o r e s , 
com exceção de pHXT7 e pTEF1, diminuíram 
durante o cultivo em frascos agitados, e a 
classificação geral dos promotores é a seguinte:
Quando as células estão na fase de consumo de 
glicose:
pTEF 1 ∼ pPGK 1 ∼ pTDH 3 > pTPI 1 ∼ pPYK 1
> pADH 1 > pHXT 7
Quando a glicose está esgotada e o etanol está 
sendo consumido:
pTEF 1 ∼ pHXT 7 > pPGK 1 > pTPI 1 ∼ pTDH 
3
> pPYK 1 ∼ pADH 1
Comparação em diferentes tipos de cultivo
Para avaliar a força dos promotores estudados com 
dois promotores fortes e bem caracterizados, ou 
seja, os dois promotores induzíveis por galactose, 
pGAL1 e pGAL10, quatro promotores com atividade 
d i f e r e n t e de acordo com os resultados do frasco 
agitado, pTEF1, pTPI1, pADH1 e pHXT7, foram 
escolhidos e comparados em culturas contínuas e em 
lote.
Comparação em cultivo em lote
pTEF1, pTPI1, pADH1, pGAL1 e pGAL10
puderam ser detectadas e medidas desde o início da 
fase exponencial, enquanto a atividade do promotor 
pHXT7 nessa etapa
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(A)
(B)
Figura 3. (A) Atividade de LacZ e perfil de biomassa em cultivo em lote com promotores à base de glicose. Linhas 
tracejadas,
Atividade de β-galactosidase; linhas sólidas, biomassa (OD600 ); diamantes, pTEF1; círculos, pHXT7; triângulos, pTPI1; sem 
símbolos, pADH1.
(B) Atividade de LacZ e perfil de biomassa em cultivo em lote com os promotores GAL1 e GAL10. Linhas tracejadas, 
atividade de β-galactosidase; linhas sólidas, biomassa (OD600 ); triângulos, pGAL1; quadrados, pGAL10
não era detectável ou era muito baixa e depois 
aumentou. No final da fase exponencial e na fase de 
etanol, esse promotor teve uma atividade maior do 
que pTEF1, pTPI1, pADH1 e pGAL1 (Figura 3A, 
B). Como nos resultados obtidos da comparação de 
todos os promotores baseados em glicose (Tabela 
2), o pTEF1 apresentou a atividade mais estável 
durante as fases exponencial e de etanol. Esse 
promotor também apresentou uma atividade alta e 
estável em meio contendo galactose (dados não 
mostrados).
Portanto, parece que a atividade do pTEF1 não é 
tremendamente afetada pela concentração de glicose 
ou por mudanças na fonte de carbono, ou seja, para 
galactose ou etanol, e pode, portanto, ser 
c a r a c t e r i z a d a como um promotor 
verdadeiramente constitutivo. As atividades de 
pGAL1 e pGAL10 diminuíram no final da fase 
exponencial, quando a concentração de galactose é 
baixa e na fase de consumo de etanol. Uma 
tendência semelhante pôde ser observada para 
pTPI1 e pADH1 (Figura 3A, B).
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Caracterização de promotores para projetar um novo vetor de expressão em S. cerevisiae 961
Comparação em quimiostato
As taxas de crescimento de S. cerevisiae em meios 
contendo glicose e galactose são significativamente 
diferentes no cultivo em lote. Para evitar qualquer 
efeito da taxa de crescimento sobre a força do 
promotor, os quatro promotorespTEF1, pHXT7, 
pGAL1 e pGAL10 foram comparados em culturas 
contínuas a uma taxa de diluição fixa (0,1/h nos 
meios de glicose e galactose) e o ensaio da enzima 
β-galactosidase foi realizado quando as culturas 
estavam em estado estável. Os resultados são 
mostrados na Figura 4.
Como esperado pelos resultados do frasco 
agitado, o pHXT7 apresentou a maior atividade 
entre todos os quatro promotores no quimiostato 
(Figura 4). O pTEF1 e o pGAL10 ficaram em 
segundo lugar e apresentaram níveis de atividade 
semelhantes, enquanto o promotor GAL1 foi o mais 
fraco (apresentou metade da atividade média dos 
promotores GAL10 e TEF1). A alta atividade do 
pHXT7 no quimiostato limitado por glicose é 
consistente com sua função de transportador de 
hexose de alta afinidade (Reifenberger et al., 1995; 
Sedlak e Ho, 2004). A expressão do pHXT7 é 
maximizada quando se mantêm concentrações 
muito baixas de glicose no quimiostato (Figura 4). 
Esse alto nível de expressão não foi observado nos 
frascos de agitação, pois a glicose só está presente 
em baixa concentração por um curto período antes 
de se esgotar (Figura 3A). Como observado nos 
frascos agitados (Figura 3B), a pGAL10 também é 
mais forte do que a pGAL1 no quimiostato, o que 
contrasta com pesquisas anteriores. Yocum et al. 
(1984) clonaram um fragmento de 914 pb contendo 
os promotores divergentes GAL1/GAL10 na frente 
de lacZ em plasmídeos simples, multicópias e 
integrativos e
Figura 4. Atividade de LacZ em quimiostato. pTEF1, 
coluna cinza; pHXT7, coluna preta; pGAL1, coluna cinza 
claro; pGAL10, coluna branca. As barras de erro 
representam SEM
avaliaram a atividade do promotor em diferentes 
fontes de carbono. Eles mostraram, em todas as 
condições, que o GAL1 tinha uma atividade de duas 
a quatro vezes maior do que o GAL10. Em outra 
abordagem, West et al. (1987) construíram 
diferentes cassetes promotores quiméricos, 
incluindo a sequência ativadora a montante (UAS) 
do promotor CYC1 e fragmentos do promotor GAL1 
ou GAL10, e usaram lacZ como gene repórter. 
Avaliando a eficiência de diferentes elementos 
reguladores nos promotores GAL1/GAL10, eles 
também observaram uma atividade geralmente 
muito maior para o pGAL1 do que para o pGAL10. 
No último exemplo, Cartwright et al. (1994) usaram 
a β-lactamase como repórter secretado em vetores 
de cópia única e múltipla para comparar os 
promotores PGK1, GAL1, GAL10, PHO5 e CUP1 
sob condições nutricionais variadas. Novamente, os 
resultados mostraram que o promotor GAL1 era 
mais ativo do que o promotor GAL10. Para garantir 
que h o u v e s s e apenas uma única integração do 
pGAL10, testamos as cepas por meio de análise de 
Southern blot, e isso mostrou uma única integração 
tanto para a cepa pGAL1 quanto para a pGAL10 
(dados não mostrados).
Entretanto, como esses dois promotores foram 
clonados usando diferentes enzimas de restrição 
(pGAL1 clonado usando XhoI/BamHI e pGAL10 
clonado usando Not I/BamHI), a distância entre o 
promotor e o gene lacZ foi diferente em ambos os 
casos. Como nossa estratégia de clonagem também 
foi diferente das usadas em outros estudos, isso 
pode ter algum efeito sobre a eficiência da tradução.
Como o objetivo desta pesquisa era construir um 
sistema de expressão duplo baseado em glicose para 
substituir os promotores GAL1 /GAL10 em pESC - 
URA, precisávamos de dois promotores com um 
perfil de expressão semelhante. Conforme os 
resultados da primeira comparação (Tabela 2), os 
promotores PGK1 e TDH3 representam opções para 
um promotor que pode ser combinado com o 
pTEF1. Embora ambos comecem com a mesma 
atividade do pTEF1, após 8 horas, suas atividades 
diminuem. Após 24 horas, essa perda de atividade 
do promotor TDH3 é maior do que a do promotor 
PGK1. Investigações anteriores de Mellor et al. 
(1985) mostraram que, quando o gene PGK1 foi 
clonado em um plasmídeo multicópia e expresso em 
levedura, a Pgk1p acumulou até aproximadamente 
50% da proteína celular total. Além disso, foram 
construídos diferentes vetores de expressão 
potentes, com base na região promotora do gene 
PGK1, e esses vetores foram usados para
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962S . Partow et al.
estudar a expressão de vários genes heterólogos 
(Dernyk et al., 1983; Tuite et al., 1982; Masuda et 
al., 1994). Portanto, escolhemos os promotores 
TEF1 e PGK1 como base para a construção de um 
novo vetor contendo dois promotores bidirecionais.
Comparação de pTEF1 e pPGK1 em 
diferentes contextos
Um fragmento de fusão de PCR consiste em dois 
fragmentos de PCR que são fundidos usando um par 
de adaptadores correspondentes, que contêm uma 
sequência complementar em suas extremidades 5r 
(Erdeniz et al., 1997). Usamos a PCR de fusão para 
fundir os promotores TEF1 e PGK1 em orientação 
oposta um ao outro e, assim, construímos uma 
sequência de nucleotídeos contendo o promotor 
bidirecional TEF1-PGK1. Esses promotores 
bidirecionais foram clonados no pSF011 na frente 
do gene lacZ em ambas as orientações e os vetores 
integrativos resultantes foram integrados ao genoma 
de S. cerevisiae CEN.PK 113-5D no locus ura3-52. 
Para avaliar a atividade de pTEF1 e pPGK1 no novo 
motor bidirecional, comparamos suas atividades 
com pTEF1 e pPGK1 individuais, respectivamente, 
em frascos agitados usando as mesmas condições 
descritas acima. Os resultados mostram que a 
atividade do promotor de PGK1 após a fusão com 
pTEF1 não foi significativamente diferente quando 
comparada com a de pPGK1 isolada (Figura 5A). 
pTEF1 também não apresenta alteração significativa 
na atividade após a fusão com pPGK1 (Figura 5B).
Construções finais
Após a comparação dos diferentes promotores, 
construímos quatro vetores de expressão diferentes 
com promotor forte bidirecional, pTEF1- pPGK1. 
Duas dessas construções, pSP-G1 e pSP-G2 (Figura 
2A, B), são úteis para avaliar e expressar dois genes 
diferentes ao mesmo tempo. As duas orientações 
diferentes do promotor em pSP-G1 e pSP-G2 
permitem uma maior variedade de estratégias de 
clonagem devido às diferentes combinações de 
promotores e locais de clonagem múltipla (MCS). A 
expressão da enzima constitutiva (α-amilase) com 
a ajuda desses vetores foi verificada (dados não 
mostrados).
Figura 5. (A) Atividade do pPGK1 em diferentes 
contextos. As colunas pretas correspondem à atividade 
do pPGK1 sozinho; as colunas cinzas correspondem à 
atividade do pPGK1 fundido ao pTEF1. As barras de erro 
representam SEM. (B) Atividade de pTEF1 em diferentes 
contextos. As colunas pretas correspondem à atividade do 
pTEF1 sozinho; as colunas cinzas correspondem à 
atividade do pTEF1 fusionado ao pPGK1. As barras de 
erro representam SEM
Conclusão
Aqui, as atividades de sete diferentes promotores 
constitutivos e baseados em glicose, pTEF1, pTPI1, 
pTDH3, pADH1, pPGK1, pHXT7 e pPYK1,
foram comparados entre si e também com os dois 
fortes promotores induzidos por galactose, pGAL1 e 
pGAL10. Usamos lacZ como repórter e o plasmídeo 
integrativo pSF011 para essa comparação. Além 
disso, construímos um cassete de promotor 
bidirecional que consiste em pTEF1- pPGK1 e 
mostramos que os dois promotores, nesse contexto, 
têm perfis de expressão semelhantes aos promotores 
isolados correspondentes e, portanto, podem 
suportar a expressão gênica de alto nível. Em 
seguida, integramos esse promotor bidirecional 
baseado em pTEF1 e pPGK1 em um vetor de 
expressão que mantém todos os recursos do 
plasmídeo pESC - URA, exceto que a expressão 
gênica é mediada por promotores constitutivos. 
Dois vetores foram construídos com orientação 
opostado promotor bidirecional. Ambos os vetores 
são muito
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Caracterização de promotores para projetar um novo vetor de expressão em S. cerevisiae 963
útil para projetos de engenharia metabólica que 
visam à produção de alto nível de produtos valiosos 
usando levedura como plataforma de produção.
Nossos resultados mostraram perfis variados de 
atividade para cada promotor; por exemplo, o 
promotor TEF1 mostrou a atividade mais constante 
durante a fermentação e o pHXT7 representou a 
mais forte em cultura contínua limitada por glicose. 
Usamos pPGK1 e pTEF1 para construir o novo 
vetor, mas, dependendo da finalidade, é possível 
usar diferentes pares de promotores com padrão de 
expressão comparável ou diferente. Por exemplo, o 
promotor HXT7 é sugerido para cultivo contínuo ou 
em lote alimentado em condições limitadas de 
glicose para atingir níveis muito altos de expressão 
gênica. Por outro lado, o promotor ADH1 de 
comprimento total seria adequado para a expressão 
condicional de genes em altas concentrações de 
glicose. Portanto, pode ser uma boa ideia usar 
diferentes combinações de promotores para 
diferentes experimentos, já que é simples trocar os 
promotores atuais por qualquer outro promotor 
usado neste estudo para alterar a taxa de nível de 
expressão dos genes clonados.
Agradecimentos
Agradecemos a Nina Gunnarsson pela discussão útil e a 
Luca Formenti por realizar parte dos experimentos com 
frascos agitados.
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