Aula 1_Radicais Livres - Estresse oxidativo e nitrosativo,

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Radicais Livres - Estresse oxidativo e nitrosativo, causas e mecanismo de formação de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio
Profa lilian tatiani dusman Tonin
Disciplina: antioxidantes
RADICAIS LIVRES 
Toda e qualquer entidade química que possui um ou mais elétrons não pareados.
Alta reatividade química
São gerados no organismo naturalmente através de processos metabólicos oxidativos como na respiração celular e na digestão dos alimentos
O2 que respiramos é metabolizado na mitocôndria (85-90%)
2 a 5% do O2 são reduzidos univalentemente e transforma-se em radicais livres 
 geração de radicais livres constitui um processo contínuo e fisiológico, cumprindo funções biológicas relevantes
Em pequenas quantidades os RL trazem benefícios para nosso organismo: 
as células de defesa do nosso corpo produzem-nos para destruir vírus, bactérias e fungos durante o processo de infecção 
possibilita a geração de ATP (energia), por meio da cadeia transportadora de elétrons
fertilização do óvulo 
sinalizadores de transdução 
ativação e transcrição de genes
regulação da atividade da guanilato-ciclase (enzima essencial para a via de sinalização do óxido nítrico)
Em excesso, os RL conduzem a danos oxidativos: 
 destroem enzimas, 
 atacam células: causando sérios danos estruturais - mau funcionamento e até morte celular. 
Consequências do dano oxidativo do 
 DNA: 
Câncer;
Prejudicam a função imune;
Arteriosclerose;
Doenças cardiocoronarianas;
Doenças neurodegenerativas.
FONTES DE RADICAIS LIVRES
1986 - Ucrânia
 Álcool
 Consumo de açucares e gorduras poli-insaturadas
 Exercícios em excesso
 Metabolismo de determinados fármacos
 Stress 
FONTES DE RADICAIS LIVRES
FONTES DE RADICAIS LIVRES
HISTÓRICO
 1896 – W. F. Ostwald: “A natureza de radicais orgânicos é tal que não se pode isolá-los”
1900 – Moses Gomberg: conseguiu preparar soluções de um radical estável em ausência de ar e publicou um artigo chamado Um caso de carbono trivalente
1940 – RL estavam bem aceitos como intermediários de reações químicas; 
Principais mecanismos para produção de RL foram elucidados
Produção de Radicais Livres
HISTÓRICO
1956: Denham Harman - hipótese de que radicais de oxigênio poderiam ser formados como subprodutos de reações enzimáticas in vivo 
descreveu RL como a “Caixa de Pandora” responsável por danos celulares em algumas enfermidades: processo de mutagênese, câncer, processo degenerativo do envelhecimento biológico
1969: McCord e Fridovich - descoberta da função catalítica da superóxido dismutase e a síntese do óxido nítrico - houve um rápido progresso no campo da biologia dos RL
1975: teoria dos RL estimulou o interesse sobre a função dos antioxidantes da dieta na prevenção de doenças como câncer, aterosclerose, artrite reumatoide, neurodegeneração e diabetes.
CLASSIFICAÇÃO DOS RADICAIS LIVRES
1) Segundo o número de átomos componentes: monoatômicos (Cl.), diatômicos (HO.), tetra-atômico (H3C.), hepta-atômico (H3C-H2C.)
II) Orgânicos (H3C.) e Inorgânicos (Na.)
III) Carregados eletricamente (O2.-, Fe3+)
IV) nomeados com base no nome das funções químicas das quais derivam (alquila: metila, alcóxi: metóxi)
V) Radicais de diferentes naturezas químicas (1O2)
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS)
(Reactive oxygen species)
Os mecanismos de geração de RL ocorrem, normalmente, nas mitocôndrias, membranas celulares e no citoplasma; 
 A mitocôndria, por meio da cadeia transportadora de elétrons, é a principal fonte geradora de RL; 
 Na mitocôndria existe a citocromo oxidase, controla a produção de RL; 
 Citocromo oxidase e outras proteínas ao reduzirem O2, liberam pequenas quantidade de ânion radical superóxido (.O2-) (Fig.) e H2O2, estas e as espécies geradas a partir destas são as ROS
 As células se defendem das ROS com o auxílio da superóxido dismutase (SOD) pela reação:
	2 .O2- + 2 H+ O2 + H2O2 
Dependem de cátions Mn (da mitocôndria) e Zn e Cu (forma citossólica)
Danos causados a lipídios e proteínas exercem papel importante no envelhecimento
Produção de ânion radical superóxido pelas mitocôndrias
SOD: enzima superóxido dismutase
 O radical ânion superóxido (O2∙-) é gerado a partir do O2
O2 + e-  O2∙-
 Ao contrário da maioria dos radicais livres, é inativo, e em meio aquoso, sua reação principal é a dismutação, na qual é produzido o peróxido de hidrogênio. 
O2∙- + O2∙-  H2O2 + O2
 É um agente oxidante fraco, incapaz de causar peroxidação lipídica.
 Pode reduzir o ferro iônico e seus complexos proteicos, podendo causar danos aos aminoácidos ou então causar perda da função proteica. 
Sua maior toxicidade está na capacidade de produzir outros radicais livres mais citotóxicos e reativos, como HO∙. 
Apesar dos efeitos danosos no organismo, o radical O2∙- possui importância vital para as células de defesa, protegendo contra infecções causadas por vírus, bactérias e fungos, sendo produzido in vivo pelos fagócitos ou linfócitos e fibroblastos, durante um processo inflamatório 
O peróxido de hidrogênio (H2O2) é gerado in vivo pela dismutação do ânion-radical superóxido (O2∙-)
Catalisada pela enzima superóxido dismutase – SOD – acelera até 104 vezes a reação em pH fisiológico.
O H2O2 é então parcialmente eliminado por catalases, glutationa peroxidase e peroxidases ligadas à tioredoxina (proteína), sendo que uma grande parte é liberada para a célula. 
Possui meia vida longa e é capaz de atravessar camadas lipídicas e reagir com metais de transição e algumas hemoproteínas. 
Em presença de metal de transição gera •OH, através da reação de Fenton
			Fe2+ + H2O2  Fe3+ + -OH + •OH
É pouco reativo frente às moléculas orgânicas na ausência de metais de transição. 
Pode induzir alterações cromossômicas, romper a coluna do ácido DNA e, na ausência de catalisadores, oxidar compostos sulfidrila (-SH)
Exerce papel importante no estresse oxidativo por ser capaz de transpor facilmente as membranas celulares e gerar radical hidroxila
 Íons de metais de transição – possuem e- desemparelhados
 o Fe2+ encontra-se complexado com proteínas de transporte (transferrina), armazenamento (ferritina e hemosiderina) e hemoglobina (transporte de oxigênio dos pulmões para os tecidos)
 os organismos desenvolveram mecanismos complexos e proteínas específicas para transportar, armazenar e entregar diferentes íons de metais de transição às proteínas “corretas”, minimizando suas disponibilidades como catalisadores de reações de óxido-redução deletérias
a disponibilidade de íons de metais de transição em células ou organismos aumenta em condições de contaminação por metais, quando há aumento na produção de RL e em diversas patologias 
o aumento na disponibilidade de íons de metais de transição aumenta a produção de RL
doenças genéticas que prejudicam o metabolismo de íons Fe (hematocromatose, porfirias, talassemias) ou Cu (doença de Wilson)
 tratamento com quelantes (desferal@ – impedem que os íons metálicos participem de reações de óxido-redução)
 Radical hidroxil ou oxidrila HO∙
 Reação de Fenton
 Reação de Haber-Weiss
 É o mais deletério ao organismo;
 Possui meia-vida curta, o que dificulta o sequestro in vivo;
 Causa danos ao DNA, RNA, às proteínas, lipídios e membranas celulares do núcleo e mitocondrial. Nos aminoácidos e proteínas, o radical pode reagir na cadeia lateral, onde ataca preferencialmente cisteína, histidina, triptofano, metionina e fenilalanina, gerando danos com consequente perda de atividade enzimática, dificuldades no transporte ativo através das membranas celulares, citólise e morte celular;
 Oxigênio singleto (1O2), é a forma excitada de oxigênio molecular e não possui elétrons desemparelhados em sua última camada; 
 é capaz de atravessar a membrana celular e induzir danos na molécula de DNA, via catálise enzimática
 pode atuar de forma benéfica, na defesa contra infecção, quando a bactéria estimula os neutrófilosa produzirem ERO com a finalidade de destruir o microorganismo
FORMAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE NITROGÊNIO (RNS)
 óxido nítrico (.NO), óxido nitroso (N2O3), ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2-), nitratos (NO3-) e peroxinitritos (ONOO-)
 Formação do radical livre óxido nítrico (.NO) – catalisada pela óxido nítrico sintetase
L-citrulina
Medicamentos para impotência masculina
Inibe a enzima fosfodiasterase – aumentando a vida média da cGMP, mantendo o músculo do corpo cavernoso relaxado, propiciando maior afluxo sanguíneo
FORMAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE NITROGÊNIO (RNS)
1
II
III
IV
I) O óxido nítrico não é suficientemente reativo para atacar o DNA diretamente, mas pode reagir com o radical ânion superóxido (O2∙-), produzido pelos fagócitos, gerando peroxinitrito, que, pode sofrer reações secundárias formando agentes capazes de nitrar aminoácidos aromáticos 
II) O peroxinitrito pode levar à formação do radical hidroxil
III) O NO reage com O2 para formar NO2 
 
IV) O N2O3 é considerado um potencial doador de nitrosônio (NO+), intermediário-chave, podendo ser transferido para uma grande diversidade de nucleófilos presentes em biomoléculas, como as aminas, por exemplo, levando à formação de nitrito e N-nitrosaminas
REATIVIDADE DOS RADICAIS LIVRES
FOCOS DE ATUAÇÃO DAS ESPÉCIES REATIVAS
membrana celular, a qual é essencial para o funcionamento normal da célula; 
 
membranas das organelas intracelulares, tais como mitocôndria, retículo endoplasmático e núcleo;
 
dano celular resulta de ataque sobre as macromoléculas, tais como lipídios, DNA, proteínas e açúcares;
 
membranas das células e organelas contém grandes quantidades de ácidos graxos poliinsaturados 
são constituídas por uma bicamada lipídica - quando sofre ataque dos RL, desencadeia-se um processo denominado lipoperoxidação
reação em cadeia, representada pelas etapas de iniciação, propagação e terminação
 
peroxidação lipídica inicia-se com o sequestro do hidrogênio da membrana celular com consequente formação do radical lipídico
radical reage rapidamente com o oxigênio, resultando em radical peroxila, que, por sua vez, sequestra novo hidrogênio do ácido graxo poliinsaturado, formando novamente o radical lipídico
O término da lipoperoxidação ocorre quando os radicais produzidos propagam-se até destruírem a si próprios
Peroxidação lipídica
Peroxidação lipídica
Hidroperóxido de lipídio
pode ser catalisada por íons ferro, por conversão de radicais lipídicos, em espécies altamente reativas, que por sua vez, iniciam nova cadeia de reações;
causam mudanças nas propriedades físicas e químicas das membranas;
perda da seletividade nas trocas iônicas, alterações de permeabilidade, formação de produtos citotóxicos como o malondialdeído (MDA), expansão de líquido intracelular, risco de liberação do conteúdo das organelas culminando com a morte celular
Peroxidação de membranas biológicas e lipoproteínas
danos ao DNA: ocorrem de forma direta pela oxidação dos ácidos nucléicos, com ataque das bases púricas e pirimídicas, preferencialmente à guanina; 
podem ocorrer quebras nas cadeias do DNA, o que resulta em ligações cruzadas entre as fitas modificando suas bases e levando a mutações e apoptose; 
Proteínas: funções celulares - transdução de sinal, mitose celular e sistemas de transporte; 
oxidação de proteínas decorre da ação dos RL sobre os grupos tióis, causando também agregação e fragmentação de aminoácidos
produzem modificações levando à perda de função e aumentando a taxa de degradação;
levam à oxidação posterior do DNA pelos peróxidos formados;
incluindo ligações cruzadas DNA-proteína e mutações. 
Vasconcelos, S.M.L. et al. ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E DE NITROGÊNIO, ANTIOXIDANTES E MARCADORES DE DANO OXIDATIVO EM SANGUE HUMANO: PRINCIPAIS MÉTODOS ANALÍTICOS PARA SUA DETERMINAÇÃO. Química Nova, 30(5), 1323-1338, 2007.
fração lipídica dos alimentos está relacionada a diversas propriedades organolépticas, como aroma, coloração, textura, suculência, estabilidade das proteínas, vida de prateleira sob congelamento e conteúdo calórico. 
oxidação lipídica: fontes de elevada energia ou radiação ionizante – radiação ultravioleta: usada em sanitização; microondas: cozimento; degradação térmica de material orgânico: cocção
consequências nutricionais da oxidação lipídica: 
destruição parcial dos ácidos graxos insaturados essenciais linoleico e linolênico; 
destruição parcial de outros lipídios insaturados como as vitaminas A, carotenoides e tocoferóis; 
destruição parcial da vitamina C (co-oxidação); 
formação de produtos secundários da oxidação lipídica (malonaldeído e outros compostos) e compostos de Maillard, capazes de reagir com biomoléculas (especialmente proteínas), diminuindo a absorção destas; 
irritação da mucosa intestinal por peróxidos, que provoca diarreia e diminui a capacidade de absorção; 
formação de lipídios oxidados que são antagonistas de diversos nutrientes, como tiamina, pantotenato de cálcio, riboflavina, ácido ascórbico, vitamina B12, tocoferóis, vitamina A, proteínas, lisina e aminoácidos sulfurados
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