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MICROBIOLOGIA AULA 4 ProfªStephanie Von Stein Cubas Warnavin 2 CONVERSA INICIAL Nesta aula, daremos início ao estudo dos únicos unicelulares procariontes, mestres da adaptação (Reece et al., 2015), as bactérias e Archeas. Abordaremos a variedade morfológica e estrutural bacteriana, os mecanismos fisiológicos, reprodutivos e de crescimento, os principais grupos e classificações e as formas de cultivo bacteriano. O objetivo principal será aprofundar os estudos sobre os microrganismos bacterianos. Os temas abordados são: • Tema 1 – Morfologia e ultraestrutura das bactérias; • Tema 2 – Fisiologia genética bacteriana; • Tema 3 – Reprodução e crescimento bacteriano; • Tema 4 – Principais grupos de bactérias; • Tema 5 – Cultivo de bactérias. TEMA 1 – MORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURA DAS BACTÉRIAS As bactérias são seres procariotos, unicelulares, com tamanho entre 0,5 e 5μm (menores do que células eucarióticas), com uma grande diversidade morfológica. As formas mais comuns são cocos (esféricos), bacilos (forma de bastão) e espirilos (forma espiralada). Quanto às estruturas externas destacam- se a parede celular, os flagelos, as fimbrias e a cápsula. Quanto às estruturas internas (Figura 1), os procariotos possuem uma organização bem mais simples em relação aos eucariotos. Não possuem organelas citoplasmáticas, com exceção dos ribossomos (síntese proteica). Seu citoplasma é rico em água, sais minerais, íons, enzimas etc., e é nele que ocorre grande parte das reações químicas da célula. O material genético fica mergulhado no citoplasma, em uma região específica denominada de nucleoide, sem formação de um envoltório nuclear, além dos plasmídeos que são pequenas moléculas circulares de DNA contendo, na maioria das vezes, poucos genes. De maneira geral, os procariontes possuem um único cromossomo circular. 3 Figura 1 – Morfologias mais comuns de procariotos Crédito: OSweet Nature/Shutterstock. A parede celular dos procariotos (Figura 2) é formada de peptidioglicano, sendo responsável por dar forma à célula e protegê-la em ambientes hipotônicos. A depender de sua estrutura, as bactérias podem ser agrupadas em gram- positivas e gram-negativas (Figura 3): nas gram-positivas, a parede celular é mais simples, mais espessa e com grande quantidade de peptideoglicano, corando-se de violeta sob efeito da coloração de Gram; já as gram-negativas possuem parede celular mais complexa, com menos peptideoglicanas e uma camada externa que contém lipopolissacarídeos, corando-se de vermelho ou rosa sob coloração de Gram. A conformação da parede celular das gram- negativas confere uma maior proteção e, com isso, uma tendência maior à resistência contra medicamentos. 4 Figura 2 – Estrutura da parede celular em procariotos Crédito: Designua/Shutterstock. Figura 3 – Exemplos de bactérias gram-positivas e gram-negativas Crédito: Olga Bolbot/Shutterstock. A cápsula e a camada mucosa são estruturas que envolvem a parede celular e são compostas de polissacarídeos ou proteínas. Possuem função de adesão a substratos ou a outros indivíduos e de proteção contra a desidratação ou o ataque do sistema imune de possíveis hospedeiros (no caso de bactérias patógenas). A diferença entre as duas se dá na sua estrutura: as cápsulas são densas e bem definidas e a camada mucosa não é bem organizada. A estrutura 5 que auxilia na adesão de alguns procariotos são as fímbrias, apêndices curtos e numerosos semelhantes a pelos. Sob estresse ambiental, alguns procariotos conseguem produzir o que chamamos de endósporo (Figura 4), que consiste em uma estrutura de resistência formada por múltiplas camadas que abrigam uma cópia dos cromossomos bacterianos e se mantêm em latência por um longo tempo. Em ambientes mais viáveis, esse endósporo pode se reidratar e retomar seu metabolismo. Figura 4 – Estágio da formação do endósporo Crédito: Olga Bolbot/Shutterstock. Figura 5 – Endósporo formado na célula de Bacillus anthracis 6 Crédito: OSweetNature/Shutterstock. Os flagelos se configuram com uma das estruturas de locomoção mais comuns nesses seres, possibilitando e auxiliando os procariotos que são capazes de realizar a taxia – movimentação em resposta a um estímulo, seja de aproximação ou de afastamento. Os flagelos dos procariotos e eucariontes são estruturas análogas e cujas composições moleculares e mecanismos de propulsão são distintos, além de os primeiros serem bem menores. TEMA 2 – FISIOLOGIA E GENÉTICA BACTERIANA Para as bactérias, as mutações, mesmo raras, podem ser grandes aliadas na capacidade adaptativa, já que garantem variabilidade genética em espécies com tempos de geração curtos e grandes populações. Logo, tendem a sobreviver e reproduzir a taxas mais elevadas que outras espécies (Reece et al., 2015). Algumas cepas não patogênicas, por exemplo, podem se tornar patogênicas caso sejam expostas ao material genético de cepas mais perigosas, por exemplo o Escherichia coli, que é uma espécie bacteriana que inclui tanto isolados patogênicos quanto não patogênicos para o homem. Os isolados não patogênicos são parte da microbiota intestinal humana, junto com os anaeróbios, numa proteção à adesão de patógenos, pois competem por sítios de ligação aos enterócitos, entretanto podem se tornar patogênicos por meio de processos genéticos. 7 Visto a grande variabilidade genética dos procariotos, é de se esperar vasta diversidade adaptativa até mesmo por sua existência há bilhões de anos. Para os mecanismos metabólicos e fisiológicos não seria diferente. A Tabela 1 resume os principais modos nutricionais dos procariotos. Tabela 1 – Principais modos nutricionais bacterianos Modo Fonte de energia Fonte de carbono Tipos de organismos Autótrofos Fotoautótrofos Luz CO2, HCO3 - ou compostos relacionados Cianobactérias Quimioautótrofo Químicos inorgânicos CO2, HCO3 - ou compostos relacionados ex.: Sulfolobus Heterótrofos Foto-heterótrofo Luz Compostos orgânicos Certos procariotos aquáticos e halófilos (Rhodobacter, chloroflexus) Quimioautótrofo Compostos orgânicos Compostos orgânicos Muitos procariontes (Clostridium) Fonte: Reece et al., 2015 O metabolismo dos procariotos também será variado no que diz respeito ao uso de O2 para a respiração celular. Eles poderão ser aeróbios obrigatórios (dependerão obrigatoriamente do oxigênio), aeróbios facultativos (conseguem sobreviver na presença ou ausência de oxigênio) ou anaeróbios obrigatórios (o oxigênio é tóxico para esses seres). Os anaeróbios obrigatórios conseguem sua energia por meio da fermentação, alcoólica ou lática, ou da respiração anaeróbia (usam íons nitrato ou sulfato como carreadores de elétrons). Muitos procariotos, como as cianobactérias e indivíduos do gênero Rhizobium, metabolizam N2 atmosférico e convertem em amônia (NH3) num 8 processo chamado de fixação de nitrogênio. Esse processo é essencial para a produção de aminoácidos, na ciclagem do nitrogênio e para algumas plantas potencializa a absorção de compostos nitrogenados (mutualismo que ocorre entre leguminosas e bactérias do gênero Rhizobium). TEMA 3 – REPRODUÇÃO E CRESCIMENTO BACTERIANO Os procariontes são seres pequenos, reproduzem-se de maneira rápida e podem produzir novas gerações em questões de minutos. Essas características conferem a eles uma capacidade de crescimento e taxa populacional na base de trilhões de indivíduos. Todos se reproduzirão por fissão binária (Figura 6), ou seja, reprodução assexuada que, a princípio, gerará clones da bactéria parental. Porém unidos às mutações, recombinação genética e à rápida reprodução, os procariotos garantem sua variabilidade genética. Figura 6 – Esquema de fissãobinária em uma célula procariótica Crédito: VectorMine/Shutterstock. Já que nos procariontes não ocorrem a meiose e a fecundação, a recombinação genética se dá por mecanismos específicos: a transformação, a transdução e a conjugação (Figura 7). 9 Na transformação, o genótipo e fenótipo bacteriano podem ser alterados pela captação de DNA externo e sua assimilação no DNA original. Receptores na superfície da célula conseguem identificar e transportar para dentro da célula fragmentos de DNA de espécies muito próximas e, por permuta, incorporá-los ao genoma (Reece et al., 2015). Na transdução, bacteriófagos serão responsáveis pela recombinação genética de bactérias: eles levarão fragmentos de DNA procariótico de um indivíduo doador para outro receptor. Se esse fragmento for incorporado ao DNA da bactéria receptora, por crossing over, teremos uma célula recombinante. Por fim, na conjugação a transferência de DNA acontece entre procariontes através do pilus, uma ponte entre as células, de maneira unidirecional. Essa capacidade é determinada por uma porção específica de DNA denominada fator F presente no plasmídeo ou no cromossomo que é transferida. Figura 7 – Representação de transformação, conjugação e transdução bacteriana Crédito: Designua/Shutterstock. Para o crescimento populacional e formação de colônias, as bactérias estarão suscetíveis a influências de ordem física (pH, temperatura e pressão osmótica) e química (fonte e concentração de carbono, fósforo, enxofre, 10 nitrogênio, oxigênio etc.), variando de espécie para espécie e suas especificidades metabólicas e fisiológicas. Quando cultivadas em laboratório, a melhor maneira de se representar o crescimento é utilizando-se de uma curva logarítmica chamada de curva de crescimento bacteriana (Figura 8). Figura 8 – Curva de crescimento bacteriana Crédito: Peter Hermes Furian/Shutterstock. TEMA 4 – PRINCIPAIS GRUPOS DE BACTÉRIAS Habitando o planeta Terra há 3,5 bilhões de anos, as populações bacterianas acumularam uma infinidade de adaptações estruturais e metabólicas e uma imensa variabilidade genética que acabou resultando na sua imensa irradiação pela natureza em diversos ambientes. A seguir, é apresentado um resumo dos principais filos de bactérias. 4.1 Proteobactéria Um dos maiores e mais diversos grupos é formado por bactérias gram- negativas, fotoautótrofas, quimioautótrofas e heterótrofas, anaeróbias ou aeróbias. É definido pelo gene 16S rDNA e formado por cinco grupos. Tabela 2 – Principais modos nutricionais bacterianos 11 Proteobactérias Subgrupo Características Exemplos Alfa São bactérias estreitamente associadas com hospedeiros eucarióticos. Rhizobium, Agrobacterium Beta Hábitos nutricionais diversos, mas destacam-se entre bactérias que auxiliam na ciclagem do nitrogênio do solo, espécies aquáticas e alguns patógenos. Nitrosomonas, Rubrivivax, Neisseria gonorrhoeae Gama Inclui bactérias autotróficas sulforosas e outras heterótrofas que são patógenas. Thiomargarita namibiensis, Legionella, Salmonella (Figura 10), Vibrio cholerae, Escherichia coli Delta Nesse grupo estão inclusas as mixobactérias secretoras de muco (em situações de estresse ambiental essas bactérias formam colônias de resistência) e as bdellovíbrios (bactérias que atacam outras bactérias) Chondromyces crocatus Épsilon A maioria é patogênica aos humanos e outros animais Campylobacter, Helicobacter pilori. Fonte: Reece et al, 2015 12 Figura 9 – Ilustração 3D de Salmonella Crédito: Urfin/Shutterstock. 4.2 Chlamydias Grupo de bactérias gram-negativas que vivem obrigatoriamente dentro de células animais como parasitas e não possuem peptideoglicano em suas paredes celulares. Um exemplo é a Chlamydia trachomatis (Figura 10) causadora de cegueira e uretrite não gonocócica. Figura 10 – Ilustração 3D de Chlamydia trachomatis Crédito: Tatiana Shepeleva/Shutterstock. 13 4.3 Spirochetes Espécies desse grupo possuem vida livre ou são parasitas patogênicos, heterótrofos, gram-negativos e possuem uma movimentação peculiar em forma de espiral dado por um filamento interno similar a um flagelo. Triponema pallidum (Figura 12), causador da sífilis, e Borrelia burgdorferi, causador da doença de Lyme, são exemplos de espécies desse grupo. Figura 11 – Ilustração 3D de Treponema pallidum Crédito: Milos Pauline/Shutterstock. 4.4 Cyanobacteria Grandes representantes do fitoplâncton, as cianobactérias são gram- negativas, fotoautótrofas e um dos únicos seres procariotos a realizar fotossíntese. Podem ser solitárias ou filamentosas e algumas delas realizam o processo de fixação de nitrogênio. Um bom exemplo de cianobactéria são as Oscillatoria (Figura 12). 14 Figura 12 – Imagem microscópica de Oscillatoria Crédito: Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock. 4.5 Bactérias gram-positivas São bactérias caracterizadas pela parede celular rica em peptideoglicana. Os actinomicetos (Figura 13) formam colônias contendo cadeias ramificadas de células e podem ser patógenos (causadores da tuberculose e hanseníase) e de vida livre no solo (auxiliam na decomposição), sendo algumas espécies utilizadas na indústria farmacêutica (caso do gênero Streptomyces, fonte de antibióticos). As micoplasmas não formam parede celular, são de vida livre ou patógenos e uma das menores células conhecidas. Mycoplasma genitalium (Figura 14) é um exemplo desse grupo, causador de inflamações em órgãos sexuais femininos e masculinos. 15 Figura 13 – Ilustração 3D de uma actinomiceta Crédito: CI Photos/Shutterstock. Figura 14 – Ilustração 3D de uma actinomiceta Crédito: CI Photos/Shutterstock. 16 4.6 Archaea O grupo das arqueias formam, filogeneticamente, um domínio à parte do domínio Bactéria, porém compartilham muitas características estruturais e metabólicas, tanto que há pouco tempo estavam dentro de um único táxon. Como grupo, as arqueias compartilham características que são exclusivas devido ao processo próprio processo evolutivo separado das bactérias. As extremófilas e os metanogênicas são as principais representantes desse domínio. As extremófilas são arqueias que vivem em condições ambientais extremas de salinidade (halófilos extremos), suportando ou necessitando de um ambiente com níveis altíssimos concentração de sais (ex.: Halobacterium), e de temperatura (termófilos extremos), resistindo e prosperando em temperaturas altíssimas (ex.: Sulfolobus e Pyrococcus furiosus). As metanogênicas são arqueias anaeróbias que liberam metano como subproduto do seu processo de produção de energia. Podem ser encontradas em grandes profundidades de gelo, pântanos, brejos, vísceras de herbívoros e instalações de tratamento de esgotos, lugares onde a concentração de O2 é praticamente nula, já que esse gás é venenoso para elas. TEMA 5 – CULTIVO DE BACTÉRIAS As bactérias se reproduzem de fissão binária e possuem um tempo de geração (tempo para uma célula se dividir e sua população dobrar) curto. Logo, o cultivo de bactérias torna-se, a princípio, fácil, porém dependente de vários outros fatores. O cultivo em laboratório se dá também pelo controle dos fatores de ordem física e química. Seu crescimento pode ser verificado e expresso de maneira matemática pela curva de crescimento bacteriana, onde são demonstradas as fases lag, log, estacionária e fase de morte. Os métodos de contagem são diversos e podem ser medidos em função do número de células ou da massa total da população. Os principais métodos são a contagem em placas, filtração, método do número mais provável, contagem microscópica direta, turbidez, atividade metabólica e pelo seco. Em meios de cultura, populaçõesde bactérias podem ser isoladas pelo método de esgotamento em placa e, posteriormente, formar colônias. Os meios de cultura para as bactérias variam de acordo com a 17 atividade metabólica da espécie escolhida. Quando prontas, as culturas podem ser conservadas sob refrigeração em ultracongelamento ou liofilização. NA PRÁTICA Falar sobre os procariotos e suas aplicações é pensar também em toda a sua diversidade metabólica, desde seres essenciais para a ciclagem de nutrientes na natureza até outros que provocam prejuízos e problemas sociais gravíssimos. Do ponto de vista ecológico e ambiental, muitos procariotos, juntamente com os fungos, atuarão na reciclagem química atuando na decomposição da matéria orgânica morta ou na conversão de algumas moléculas que possam ser assimiladas por outras espécies, como é o caso das bactérias fixadoras de nitrogênio. Essa função ecológica é de suma importância já que a natureza depende da ciclagem dos elementos químicos entre a matéria viva e a não viva até mesmo para a manutenção dos ecossistemas. No decorrer de sua evolução biológica, os procariotos convergiram em muitas interações ecológicas simbióticas, mutualísticas e parasitárias com outros seres vivos, exercendo impactos tanto benéficos quanto prejudiciais. As espécies patogênicas, em geral, causam doenças pela produção de toxinas que secretam (exotoxicinas), como é o caso da Vibrio cholerae, Clostridium botulinium e da Clostridium difficile, ou pela decomposição de suas paredes celulares (endotoxicinas), caso das espécies do gênero Salmonella. Outro problema em relação às patógenas são as super-resistentes aos antibióticos: graças à reprodução rápida e às mutações nos genes, a disseminação de cepas mais resistentes a medicamentos é, hoje, um dos principais problemas da comunidade médica. Na pesquisa e tecnologia, utilizamos os procariotos de diversas formas. A própria produção de queijos e iogurtes é devido a esses seres. E. coli e A. tumefaciens são amplamente utilizados na indústria de biotecnologia para clonagem de genes e criação de plantas transgênicas, respectivamente. Algumas bactérias que sintetizam um tipo de polímero chamado de PHA estão sendo estudadas para produzirem esse polímero em escala com o objetivo de substituir o plástico. São amplamente utilizados na biorremediação como removedores de poluentes da água, solo ou ar. 18 FINALIZANDO Nesta aula, compreendemos a diversidade metabólica, estrutural, filogenética e ecológicas dos procariotos. São seres unicelulares, sem organização nuclear e compartimentos envoltos por membranas, sendo os ribossomos as únicas organelas que compartilham com os eucariotos. Suas paredes celulares são compostas de peptideoglicanos e, dependendo de sua conformação, podem ser classificadas como gram-positivas e gram-negativas. Mesmo se reproduzindo de maneira assexuada, os procariotos garantem a variabilidade genética com tempo de geração curto, mutação e recombinação genética. Essa combinação é responsável até pela irradiação das espécies e adaptação a diferentes modos de vida e habitats. São de suma importância como recicladores químicos, tanto como decompositores quanto na conversão de moléculas. Muitas são de vida livre, simbióticas, mutualísticas ou parasitas, sendo estas últimas importantes para a saúde de animais e plantas. São utilizadas na pesquisa para fins moleculares e ecológicos. 19 REFERÊNCIAS LEVINSON, W. Microbiologia médica e imunologia. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. REECE, J. B. et al. Biologia de Campbell. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2015. ROCHA, A. Fundamentos da microbiologia. São Paulo: Rideel, 2016. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. 12. ed.. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2017.