Manual Uso do Fluorometro OS-30P

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MANUAL DE USO DO MEDIDOR PORTÁTIL DE 
FLUORESCENCIA MODELO CHLOROPHYLL 
FLUOROMETER 0S-30P1 
 
 
PROF. DR. CARLOS A. MARTINEZ Y HUAMAN 
Departamento de Biologia, FFCLRP 
Universidade de São Paulo 
14040-901, Ribeirão Preto, SP 
carlosamh@ffclrp.usp.br 
 
 
_________________________________________________ 
 
 
 
 
 
 
MANUAL DE USO DO MEDIDOR PORTÁTIL DE FLUORESCENCIA MODELO OS-30P 
 
 
 
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ÍNDICE 
Pag. 
I. CONCEITOS BÁSICOS DE FLUORESCÊNCIA 3 
II. CARACTERÍSTICAS DO APARELHO OS-30P 7 
III. OPERAÇÃO DO APARELHO OS-30P 11 
 3.1. Determinação dos Parâmetros da Fluorescência: 
Teste Screening Fv/Fm 
12 
 3.2. Determinação da Curva de Fluorescência: Fast 
 Kinetics Test 
15 
IV. MANEJO DOS DADOS 19 
 4.1. Abrir arquivo novo 19 
 4.2. Visualizar os dados 19 
 4.3. Apagar arquivos 21 
V. TRANSFERENCIA DE DADOS 22 
 5.1. Uso do programa Data Capture 24 
VI. AJUSTE DO SISTEMA DO APARELHO 26 
VII. DIAGNOSTICO DO SISTEMA 27 
VIII. REFERENCIAS 27 
 
 
 
 
 
MANUAL DE USO DO MEDIDOR PORTÁTIL DE 
FLUORESCENCIA MODELO CHLOROPHYLL 
FLUOROMETER 0S-30P 
MANUAL DE USO DO MEDIDOR PORTÁTIL DE FLUORESCENCIA MODELO OS-30P 
 
 
 
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I. CONCEITOS BÁSICOS DE FLUORESCÊNCIA 
 
A luz solar é a fonte primária de toda a energia que mantém a biosfera 
de nosso planeta. Por meio da fotossíntese, as plantas convertem a energia 
física da luz solar em energia química, e esse processo é essencial para a 
manutenção de todas a formas de vida aqui existentes. 
A fotossíntese pode ser definida como um processo físico-químico, 
mediante o qual os organismos fotossintéticos sintetizam compostos orgânicos 
a partir de matéria-prima inorgânica, na presença de luz solar. O processo 
fotossintético das plantas ocorre nos cloroplastos e resulta na liberação de 
oxigênio molecular e na captura de dióxido de carbono da atmosfera, que é 
utilizado para sintetizar açúcares que logo são convertidos em amido ou 
celulose. 
A fotossíntese é possível nas plantas devido à sensibilidade das 
moléculas de clorofila à luz. Quando as clorofilas absorvem luz (fótons) 
passam de um estado basal (Chl a) para um estado excitado de nível de 
energia mais alto denominado singlet 1 (Chl a*). O estado excitado é muito 
instável de vida muito curta (~10-8 s). Assim, os pigmentos fotossintéticos, após 
ser excitados pelos fótons de luz, dissipam a energia absorvida por meio de 
três vias de dissipação (desexcitação) (figura 1): 
 
1. Dissipação fotoquímica, pela qual a energia absorvida é utilizada 
para processos fotoquímicos da fotossíntese que envolve a formação de poder 
redutor (NADPH) e de ATP, que serão utilizados posteriormente na fase de 
redução do CO2 da fotossíntese, para a produção final de carboidratos. 
 
2. Fluorescência, que é a re-emissão da energia absorvida pelas 
clorofilas, na forma de luz. 
 
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3. Calor, que é a dissipação não-fotoquímica na forma de radiação 
infravermelha. 
 
Sob condições ambientais normais, a dissipação da energia para 
eventos fotoquímicos da fotossíntese é maior que a dissipação da energia 
como fluorescência ou como calor (Figura 1). 
 
 
 
 
 
 
 
No entanto, sob situações de estresse, a dissipação fotoquímica da 
energia diminui e a dissipação não fotoquímica e fluorescência aumentam 
(Figura 2). 
Figura 1. Absorção de energia radiante pelas clorofilas (Chl a) e 
as três formas de dissipação da energia da clorofila excitada (Chl 
a*) sob condições ótimas de meio ambiente. Observe-se que 
maior quantidade de energia é utilizada para a fotossíntese e 
pouca energia é dissipada como luz (fluorescência) e calor 
Fotossíntese 
(fotoquímica) 
 
fluorescência 
 
calor 
energia 
Chl a 
Chl a* 
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Os três processos de dissipação da energia luminosa pelas moléculas 
de clorofila (dissipação fotoquímica, fluorescência e calor) são competitivos e 
dependem das condições de crescimento das plantas. Por tanto, a avaliação 
da fluorescência da clorofila pode servir para determinar a eficiência ou 
ineficiência da utilização da energia absorvida através da fotossíntese e, ao 
mesmo tempo, se constituir num parâmetro de avaliação importante para 
monitorar o estresse em plantas (Corney et al, 2003; Frachebout, 2006, Roden 
& Ball, 1996). 
Através dos aparelhos para medir a fluorescência podem ser estimados 
vários parâmetros. Na condição de ausência de luz (folha no escuro) e antes 
Figura 1. Absorção de energia radiante pelas clorofilas (Chl a) e 
as três formas de dissipação da energia da clorofila excitada 
(Chl a*) sob condições de estresse abiótico. Observe-se que 
maior quantidade de energia é dissipada como luz 
(fluorescência) e calor 
Fotossíntese 
(fotoquímica) 
 
 
fluorescência 
 
calor 
energia 
Chl a 
Chl a* 
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da aplicação do pulso saturante de luz, a emissão da fluorescência é mínima, e 
é denominada F0 ou fluorescência inicial (Figura 3). 
Durante a aplicação do pulso saturante de luz, a emissão da 
fluorescência é máxima, e é definida como FM (fluorescência máxima). A 
diferença entre FM e F0 é denominada FV (fluorescência variável). 
Assim, o Rendimento Fotoquímico Máximo do Fotossistema II (φ PSII) 
pode ser avaliado através da relação: 
 
φ PSII = (FM –F0 )/FM = FV/FM 
 
 
Figura 3 Curva de Indução da fluorescência em folhas adaptadas a escuro 
pelo período de 15 minutos. 
 
 
 
II. CARACTERÍSTICAS DO APARELHO OS-30P 
 
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O Aparelho OS-30P (Figura 4) é um fluorômetro básico, porém muito 
prático que permite medir de forma rápida e automática os seguintes 
parâmetros da fluorescência (Opti-Sciences, 2004): 
 
F0 = Fluorescência inicial (mínima) 
FM = Fluorescência máxima 
Ftr = Fluorescência terminal 
T1/2 = Tempo médio entre F0 e FM 
FV/FM = razão entre Fluorescência variável (FM-F0) e FM 
 
 FV/FM = (FM-F0) / FM 
 
Como indicado anteriormente, o parâmetro FV/FM é um bom indicar do 
Rendimento Fotoquímico Máximo do Fotossistema II (φ PSII). 
 
 
 
Figura 4. Fluorômetro modelo OS-30P 
 
Tela de leitura 
de dados e 
configuração 
Teclado de 
funções 
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O fluorômetro OS-30P (Figura 4) apresenta um teclado de diversas funções 
e uma tela onde é possível visualizar as leituras realizadas, bem como realizar a 
configuração do aparelho. 
Os parâmetros da fluorescência resultam de uma curva de indução da 
fluorescência (Figura 3), logo de um período escuro ao qual são submetidas as 
amostras, e que pode variar de 10 a 15 minutos. 
Os dados coletados são armazenados na memória do aparelho e logo 
transferidos para computador através da porta serial localizada na base do 
aparelho (Figura 5). 
Na base do aparelho também esta localizada a conexão para carga da 
bateria e a luz para observar o estado de carga da bateria (Figura 5). 
 
 
 
Figura 5. Parte inferior do aparelho OS-30P mostrando: 1. O indicador de 
status – Status Indicator (vermelho quando a bateria esta descarregada e 
verde quando esta com carga completa), 2. A conexão para carga da bateria 
(Charger Port) e 3. A porta serial (Serial Port) para transferência de dados a 
computador. 
 
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Na parte posterior do aparelho encontra-se o sensor de amostragem da 
fluorescência (Figura 6). É através de este sensor que se induz e se detecta a 
fluorescência. 
 
 
 
Figura 6. Parte posterior do aparelho mostrando o sensor de amostragem 
(Sample Probe) através do qual se induz e se detecta a fluorescência. 
 
 Para a medição dafluorescência em folhas, é necessária a utilização de 
pinças clipes específicas, as quais são colocadas nas folhas (Figura 7). 
 Logo de colocadas nas folhas, as janelas das pinças devem ser fechadas, a 
fim de manter o tecido foliar a ser medido, sob condições de escuridão pelo 
período mínimo de 10 a 15 minutos. 
 Após esse período, o sensor do aparelho é colocado na abertura da pinça, 
se abre a janela e se procede a fazer a leitura da fluorescência (Figura 8). 
 Todos os parâmetros de fluorescência lidos aparecem na tela. Por tanto, é 
possível conferir imediatamente a qualidade dos dados coletados. 
 
 
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Figura 7. Pinças clipes colocadas nas folhas antes da leitura da 
fluorescência. 
 
 
 
Figura 8. Colocação do sensor de fluorescência na pinça clipe para fazer a 
leitura da fluorescência, logo de um período de 10 a 5 minutos no escuro. 
 
 
 
 
Pinça 
clipe 
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III. OPERAÇÃO DO APARELHO OS-30P 
 
Para ligar o aparelho apertar a tecla POWER. Na tela aparecerá o texto: 
 
 
 
Com essa tela, as funções do aparelho controladas pelo teclado em 
amarelo estão em operação. 
Essas funções são: 
Ø File management (manejo dos arquivos); 
Ø Diagnostic (Diagnostico); 
Ø System management (manejo do sistema) e 
Ø Test selection (seleção de teste). 
 
TESTE DE OPERAÇÃO 
 
Ø Seleção do Modo de Teste (TEST MODE). No Modo Teste, as teclas 
com letras vermelhas permanecem ativas. 
 
Ø Para iniciar o teste apertar a tecla: 
 
 
Ø Aparecem na tela duas opções: Screening Fvm e Fast Kinetics 
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Ø Com o aparelho podem ser determinados: 
o Os parâmetros da fluorescência através da opção 
“Screening Fv/Fm” (mais utilizado para medições rápidas 
e em grande volume). 
o As curvas de fluorescência através da opção “Fast 
Kinetics” (opção que utiliza muita memória do aparelho para 
a construção das curvas) 
 
 
 
Ø Selecionar a opção desejada com as setas ∆ ou ∇ logo aperte 
ENTER 
 
3.1. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS DA FLUORESCÊNCIA: 
TESTE FV/FM (SCRENNING FVM) 
 
Quando Selecionada a opção Screening Fvm se procede com o teste 
FV/FM para determinar todos os parâmetros da fluorescência. Logo de apertada a 
tecla ENTER aparece a seguinte tela: 
 
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 A partir dessa tela é possível selecionar as seguintes funções e parâmetros: 
 
3.1.1. Ajuste de modo de captura de dados: (Data logging mode) 
Ø Apertar a tecla 
 
 
Ø Aparecem duas alternativas para L (logging – coleta de dados): (A) e 
(M) 
A: Designa o modo automático de salvamento dos dados 
(recomendado) 
M: Designa o modo manual para o salvamento dos dados 
 
3.1.2. Ajuste da intensidade de modulação (MOD) 
 
A intensidade da modulação (MOD: #) pode ser ajustada de 1 a 9 
(unidades arbitrárias) 
A intensidade de modulação pode ser mudada com as teclas ∆ ou ∇. 
Ø Um ajuste de MOD: 2 é normalmente utilizado. 
Ø Um bom ajuste é alcançado quando o valor de Ft é 
aproximadamente 30 e fica estabilizado. 
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Ø Quando Ft continua aumentando, o valor de intensidade de 
modulação está muito alto. Por tanto, MOD deve ser abaixado. 
Ø Para realizar medições, o valor mínimo de Ft é de 20. 
 
3.1.3. Realizando as Medições 
 
Para iniciar as medições aperta a tecla: 
 
 
 
Ø Quando o aparelho está realizando medições aparece na tela “Busy” 
(ocupado) 
Ø Quando a leitura esta completa é ouvido um “BiP” e logo aparecem os 
dados de fluorescência na tela. 
Visualizar os dados da tela e conferir: 
1. A leitura tem sido automaticamente salva quando aparece a letra S 
depois do L:A (L:AS) na tela. 
2. Se não aparece a letra S depois de L:A, a leitura não foi salva. 
3. Para salvar a leitura apertar a tecla: 
 
 
 
 Depois do teste aparece a seguinte tela: 
 
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Nesta tela: 
Ft = é o valor da fluorescência atual 
Fo = é o valor da Fluorescência Mínima 
Fm = é o valor da Fluorescência máxima 
Fv/Fm = razão Fv/Fm, indica a eficiência quântica máxima do 
fotossistema II. 
 
Parâmetros de teste: 
F : Número do arquivo (File) 
L: Indicador do manejo das leituras: A (modo automático); M (modo 
manual); S após A ou M (a leitura tem sido salvada). Branco ( a leitura não 
tem sido salvada ou deletada) 
 S: Número da amostra que tem sido armazenada. 
Mod: Intensidade da modulação. 
 
3.2. DETERMINAÇÃO DA CURVA DA FLUORESCENCIA: TESTE 
CINÉTICA RÁPIDA (FAST KINETICS TEST) 
 No teste de cinética rápida é construída uma curva de indução da 
fluorescência como mostrada da figura 3. 
 A seleção deste teste (Fast Kinetics) é realizada na tela 
 
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 Aparece a seguinte tela: 
 
 
 
Ø A partir de esta tela as teclas em vermelho estão ativas: 
Ø Test Setup: Ajustes através da tecla: 
 
 
 
 
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 Nesta tela: 
Ø Test length: Duração da leitura (ajustar entre 2 a 255 
segundos). 
Ø Actinic Intensity: Intensidade da luz actínica (entre 100 a 
1.100 uE). 
Ø Actinic calibration: calibrado em fabrica. 
 
Para o ajuste do modo de captura de dados, apertar a tecla: 
 
 
 
Ajuste em A (automático), M (manual) igual que o teste Fv/Fm 
Ajuste da intensidade de modulação (Mod) igual que no teste Fv/Fm 
Para iniciar o teste apertar: 
 
 
 
 
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Ao final da leitura aparece uma tela: 
 
 
Nesta tela: 
Dados de fluorescência: 
Ft: Valor da fluorescência atual. 
Fo: Fluorescência mínima 
Fm: Fluorescência máxima 
Fv/Fm: razão entre fluorescência variável e máxima. 
Ftr: Fluorescência terminal 
T1/2: tempo médio entre Fo e Fm 
Para ver os dados de fluorescência apertar 
 
 
Para sair da tela, aperte ESC 
 
Parâmetros do teste 
Trace # : Número da curva 
Log: A (automatico), M (manual), S (leitura salva) igual que no 
teste anterior. 
ActI: Intensidade da luz actínica 
Tlen: duração da leitura (segundos) 
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Mod: intensidade da modulação. 
 
IV. MANEJO DOS DADOS 
 
4.1. PARA ABRIR UM NOVO ARQUIVO APERTAR A TECLA : 
 
 
Ø AJUSTAR O NUMERO DO ARQUIVO (1 A 60) COM AS TECLAS ∆ 
ou ∇. 
 
4.2. VISUALIZAR OS DADOS 
Ø APERTAR A TECLA 
 
 
 
Ø SELECIONAR: 
Screening Fvm 
ou 
Fast Kinetics 
 
APARECE UMA TELA: 
 
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Para a busca do arquivo, utilizar as teclas: ∆ ou ∇. 
 
Aparece a SEGUINTE TELA: 
 
 
 
 
 
Onde: 
F: Número do arquivo 
S: Número da amostra 
On: xx/xx: data da coleta 
Fo, Fm, Fv/Fm: dados coletados. 
M: Intensidade da modulação 
 
Ø PARA VISUALIZAR O TRAÇO DA FLUORESCÊNCIA APERTAR: 
 
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4.3. APAGAR ARQUIVOS 
 
Ø APERTAR A TECLA 
 
 
Ø SELECCIONAR: 
SCREENING FVM 
OU 
FAST KINETICS 
 
Ø APARECE NA TELA 
 
 
 
Ø Selecionar o arquivo a ser apagado e logo ENTER. 
Ø Para sair sem deletar apertar ESC 
 
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ATENÇÃO: SE SELECIONADO O NUMERO 00 SE APAGAM TODOS OS 
ARQUIVOS DA MEMORIA! 
 
Ø PARA APAGAR UM TRAÇO (CURVA DA FLUORESCÊNCIA), 
SELECIONAR DELETE FILE: FAST KINETICS E PROCEDER DA 
MESMA FORMA QUE NO CASO ANTERIOR. 
 
 
 
 
V. TRANSFERENCIA DE DADOS 
 
Ø OS DADOS SÃO TRANSFERIDOS UTILIZANDO O PROGRAMA 
DATA CAPTURE. 
Ø TAMBEM PODE SER UTILIZADOO HYPERTEMINAL DO 
WINDOWS. 
 
NO APARELHO, PARA A TRANSFERENCIA DE DADOS, UTILIZAR A TECLA: 
 
 
 
OS DADOS SÃO TRANSFERIDOS NO FORMATO ASCII. 
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NA TELA APARECEM TRES OPÇÕES: 
 
Ø ENVIO DE SCREENING FVM (ENVIO DE PARAMETROS) 
Ø ENVIO DE FAST KINETICS (ENVIO DE CURVAS) 
Ø ENVIO DE INVENTORY (TRANSFERENCIA DE TODOS OS ARQUIVOS 
DO APARELHO). 
 
 
CASO ESPECIAL: QUANDO SELECIONADO O FILE 0 (ZERO) SÃO 
TRANSFERIDOS TODOS OS ARQUIVOS DA MEMÓRIA DO APARELHO. 
 
Os dados transferidos de Screening Fvm (somente parâmetros da 
fluorescência) aparecem no seguinte formato: 
 
 
Os dados transferidos de Fast Kinetics (curvas de fluorescência), 
aparecem no seguinte formato: 
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5.1. USO DO PROGRAMA DATA CAPTURE. 
 O programa Data Capture é um software da Opti-Sciences que permite 
transferir os dados para computador de vários aparelhos fabricados por essa 
firma. 
 Logo de instalado o programa aparece a seguinte tela: 
 
 
Quando o programa reconhece um determinado aparelho conectado, 
aparece na parte inferior esquerda o nome do aparelho encontrado (OS1-FL, no 
exemplo). 
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 Neste momento, o aparelho e o programa estão prontos para a 
transferência dos dados. 
 A transferência dos dados pode ser realizada diretamente do programa ou 
do aparelho. 
 Para a transferência dos dados a partir do aparelho OS-30P, iniciar a 
transferência clicando em Download Data do programa. Neste ponto, iniciar a 
transferência de dados do aparelho. 
 Quando o programa detecta o envio de dados, aparece a mensagem: 
“Receiving data....”. 
 Quando termina a transferência de dados, aparece a mensagem: “Transfer 
completed successfully” 
 Os dados aparecerão na tela Fluorescence Data: 
 
 
 
 A seguir os dados devem ser salvos clicando Save Data 
 
 Para a transferência de dados a partir do programa, verificar em OPTIONS 
a existência do menu: “Use remote control download command set” 
 Neste caso é necessário acessar aos dados do aparelho através do 
comando Get Inventory 
 
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 Em File Inventory aparecerão os arquivos de dados do aparelho que 
podem ser transferidos. 
 Para transferir os dados clicar duas vezes no arquivo desejado e logo clicar 
em Download Data. 
 A seguir salvar os dados como indicado acima. 
 
VI. AJUSTE DO SISTEMA DO APARELHO (SYSTEM SETUP) 
 
O System Setup é acessado por meio da tecla: 
 
 
 
 
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Permite ajustar: 
Ø FORMAT: selecionar o formato da data 
Ø DATE: AJUSTAR A DATA DE ACORDO AO FORMATO 
Ø TIME: AJUSTE DA HORA 
Ø BACKLIGHT: AUTO 
Ø BRIGHTNESS: AJUSTE DO BRILHO EM % 
Ø AUTO-OFF: 
o ON: O APARELHO SE DESLIGA 
AUTOMATICAMENTE APÓS 4 MINUTOS SEM USO. 
o OFF: O APARELHO SE DESLIGA SOMENTE COM A 
TECLA POWER 
 
VII. DIAGNOSTICO DO SISTEMA (Systems Diagnostics) 
 O diagnóstico é utilizado pelo fabricante para teste e calibração do 
aparelho. 
 
 
VIII. REFERENCIAS 
Corney, H., J. Sasse, P. Ades. 2003. Assessment of salt tolerance in eucalyptus 
using chlorophyll fluorescence attributes. New Forests 26: 233-246. 
Fracheboud, Y. 2006. Using Chlorophyll Fluorescence to Study Photosynthesis. 
http://www.ab.ipw.agrl.ethz.ch/~yfracheb/flex.pdf (aceso em 09/2006). 
Opti-Sciences. 2004. OS-30P Chlorophyll Meter. Operation Manual. 49 p. 
Roden, J., M. Ball. 1996. The effect of elevated CO2 on growth and photosynthesis 
of two Eucalyptus species exposed to high temperature and water stress. 
Plant Physiol. 111: 909-919. 
 
 
 
 
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NOTA IMPORTANTE 
 
O MANUAL DE USO descrito deve ser complementado com a leitura completa 
do Manual Original do Aparelho. 
 
Para qualquer dúvida sobre o presente manual de uso ou sobre o manual do 
aparelho, por gentileza, entrar em contato com o autor deste documento: 
 
PROF. DR. CARLOS A. MARTINEZ Y HUAMAN 
Departamento de Biologia, FFCLRP 
Universidade de São Paulo 
14040-901, Ribeirão Preto, SP 
carlosamh@ffclrp.usp.br 
Telefono: 016 3602 3648