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PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 1 CENTRO UNIVERSITÁRIO NEWTON PAIVA FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO: ODONTOLOGIA DISCIPLINA: CITOLOGIA E HISTOLOGIA GERAL - CHG ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS. Nome: ____________________________________________ Curso: ____________________________________________ Turno: ____________________________________________ Turma: ____________________________________________ PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 2 A escola é... O lugar onde se faz amigos. Não se trata só de prédios, salas, quadros, Programas, horários, conceitos... Escola é, sobretudo, gente, Gente que trabalha, que estuda, Que se alegra, se conhece, se estima. O diretor é gente, O coordenador é gente, o professor é gente, O aluno é gente. Cada funcionário é gente. A escola será cada vez melhor, Na medida em que cada um, Se comporte como colega, amigo, irmão. Nada de “ilha cercada de gente por todos os lados”. Nada de conviver com as pessoas e depois descobrir Que não tem amizade a ninguém. Nada de ser como o tijolo que forma a parede, Indiferente, frio, só. O importante na escola não é só estudar, não é só Trabalhar, É também criar laços de amizade, É criar um ambiente de camaradagem, É conviver, é se “amarrar nela”! Ora, é lógico... Numa escola assim vai ser fácil Estudar, trabalhar, crescer, Fazer amigo, educar-se, Ser feliz. A escola – Paulo Freire. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 3 ÍNDICE PÁGINA Normas gerais e de Biossegurança ....................................................... 04 Material para aulas práticas ................................................................. 05 Introdução à microscopia ..................................................................... 06 AULA PRÁTICA I: Microscopia óptica I ................................................. 08 AULA PRÁTICA II: Microscopia óptica II ............................................... 18 AULA PRÁTICA III: Núcleo interfásico e em divisão .............................. 24 INTRODUÇÃO A HISTOLOGIA ............................................................ 26 AULA PRÁTICA IV: Epitélio de revestimento simples ........................... 29 AULA PRÁTICA V: Epitélio de revestimento estratificado .................... 34 AULA PRÁTICA VI: Glândulas exócrinas .............................................. 38 AULA PRÁTICA VII: Glândulas endócrinas e anfícrinas ....................... 44 AULA PRÁTICA VIII: Células do tecido conjuntivo ................................ 48 AULA PRÁTICA IX: Tecido conjuntivo próprio ...................................... 50 AULA PRÁTICA X: Tecido adiposo: ...................................................... 55 AULA PRÁTICA XI: Tecido cartilaginoso .............................................. 57 AULA PRÁTICA XII: Tecido ósseo ........................................................ 60 AULA PRÁTICA XIII: Tecido nervoso .................................................... 62 AULA PRÁTICA XIV: Tecido muscular .................................................. 65 PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 4 Normas gerais e de biossegurança Não será permitida em nenhuma hipótese a alimentação dentro dos laboratórios. Se você estiver lanchando, termine primeiro o seu lanche e depois se dirija para os laboratórios; Não será permitida em nenhuma hipótese a permanência do aluno (durante as aulas e ou monitoria) que esteja trajando short, bermuda, minissaia. Bem como o uso de chinelos ou qualquer tipo de sapato aberto. Portanto, utilizar preferencialmente calças compridas de sapatos fechados. Não será permitida em nenhuma hipótese a permanência do aluno (durante as aulas e ou monitoria) sem o uso do guarda-pó (jaleco) nos laboratórios; Os roteiros das aulas práticas deverão acompanhar o aluno em todas as aulas práticas. Cada aluno deverá trazer para as aulas práticas um caixa de lápis de cor (12 cores); Dentro dos laboratórios e nas suas dependências não serão permitidas em nenhuma hipótese brincadeiras ou comportamentos que possam trazer riscos às pessoas e aos materiais e equipamentos utilizados nos laboratórios; Todo o material utilizado durante as aulas (microscópio, lâminas histológicas e modelos de gesso) são de responsabilidade dos alunos. Qualquer dano, alteração ou duvidas deverão ser comunicados imediatamente ao professor, técnico ou ao monitor; Os microscópios e as caixas de laminas não deverão em nenhuma hipótese ser transportados de uma banca para outra pelos alunos; Nenhum material do laboratório deverá ser levado para casa; Sempre que iniciar sua aula prática verifique se o seu microscópio e as suas lâminas estão em perfeitas condições, caso contrário comunique imediatamente ao professor ou a pessoa responsável que estiver presente (técnico ou monitor); Ao terminar a sua aula prática você deverá deixar a bancada, bem como todo o material, exatamente como encontrou no início da aula; PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 5 Material para as aulas práticas: Jaleco (Guarda-pó /avental) – De uso Obrigatório em todas as aulas práticas. Não será permitido o uso de jalecos descartáveis ou de cores diferentes da cor branca. Não será permitida a permanência do aluno no laboratório sem o uso do jaleco. Caixa de lápis de cor – Obrigatório. Lápis preto. Caneta esferográfica. Roteiro de aulas práticas – Obrigatório. Não imprimir mais de uma página por folha. Pode ser impresso frente e verso. O roteiro deverá ser encadernado e conter a identificação do aluno. Caderno de aulas teóricas – Opcional. USAR VESTIMENTA ADEQUADA ÀS NORMAS DE BIOSSEGURANÇA DO LABORATÓRIO: SAPATO FECHADO. CALÇA COMPRIDA. JALECO. NÃO É PERMITIDO AOS USUÁRIOS SE ALIMENTAREM NO INTERIOR DO LABORATÓRIO. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 6 INTRODUÇÃO À MICROSCOPIA O estudo da citologia e da histologia depende da utilização da microscopia. Na realidade para se conhecer a “anatomia microscópica” dos tecidos e órgãos é necessário fazer uso do microscópio. Portanto, o aluno de histologia deve necessariamente conhecer os fundamentos básicos da microscopia. Assim sendo, passaremos à descrição mais detalhada de um microscópio óptico, depois citaremos alguns conceitos ligados à microscopia óptica e finalizando descreveremos outros tipos de microscópicos, além do microscópio óptico. 1. Microscópio Óptico Um microscópio óptico pode ser simples ou composto: o microscópio simples possui uma única lente e só fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se está estudando; o microscópio composto consiste de uma série de lentes e fornece um aumento muito maior. Partes de um microscópio óptico composto Um microscópio composto consiste de partes mecânicas e ópticas. A parte mecânica tem uma base que estabiliza o microscópio e também contém uma lâmpada (fonte de luz) e os controles de iluminação – um interruptor (liga/desliga) e um potenciômetro (regula a intensidade de luz). Uma estativa ou braço que se estende da base para cima, onde se fixam os parafusos macro e micrométrico, um tubo ou canhão e um revolver que sustentam componentes ópticos (lentes oculares e objetivas, respectivamente) e uma platina na qual é colocado o objeto a ser examinado. As partes ópticas estão presas à coluna acima e abaixo da platina e são elas: oculares, objetivas, condensador, diafragma e filtro. A ocular consiste de uma combinação de lentes que estão embutidas na extremidade superior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 10x indica o aumento da ocular. As objetivas (pode haver três, quatro ou cinco) são uma combinação de lentes presas à extremidade inferior do tubo do microscópio(revolver). O valor gravado tal como 10x, indica o aumento da objetiva. Uma objetiva 10x usada em combinação com uma ocular 10x dá um aumento total de 100x. As diferentes objetivas atarraxam-se ao revólver, que por sua vez está preso à extremidade inferior do tubo do microscópio. Troca-se uma objetiva por outra pela rotação do revólver, de modo que quando uma objetiva é substituída outra entra em seu lugar. O condensador é uma combinação de lentes situada abaixo da platina. Ele projeta um cone de luz sobre o objeto que está sendo observado. O condensador pode ser levantado ou abaixado por um mecanismo de cremalheira, de sorte que a luz pode ser focalizada no objeto. A passagem de raios marginais no condensador é impedida pelo diafragma – íris. Situado abaixo do condensador existe um porta-filtro móvel. Como Funciona o Microscópio Óptico? O objeto a ser estudado é montado em uma lâmina de vidro, que é colocada na platina do microscópio. O objeto é posto em posição sob a objetiva seja manualmente ou usando a PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 7 platina mecânica. Faz-se o foco correto do objeto levantando ou abaixando a platina e levantando ou abaixando o tubo do microscópio, ao qual estão atarraxados a ocular e as objetivas. Os raios luminosos aqui são defletidos e convergem para o objeto. Então passam através das lentes da ocular e são novamente defletidos. Emergindo da ocular, os raios luminosos são dirigidos para a pupila do olho, após o que eles incidem sobre a retina. Se o olho está em repouso, como na visão a longa distância, deve-se obter uma clara imagem do objeto quando a objetiva estiver no foco exato. A posição das lentes do microscópio em relação ao objeto pode ser mudada ajustando os focos fino e grosso. A focalização grossa produz movimentos amplos, enquanto que a fina é um mecanismo delicado que se faz com pequenos movimentos (pequenos e grandes aumentos). Um microscópio óptico composto é, assim, um sistema de aumento em dois estágios. Primeiro o objeto é aumentado pelas lentes da objetiva e depois novamente pelo segundo conjunto de lentes da ocular. O aumento total é o produto dos aumentos da objetiva pelo da ocular. Um microscópio composto produz uma imagem de cabeça para baixo e invertida lateralmente. A inversão é facilmente demonstrada: se o espécime é movido para um lado, a imagem move- se no sentido contrário. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 8 Aula prática I: Microscopia óptica I 1 – Microscopia óptica Os microscópios ópticos possuem lentes ópticas, existindo vários tipos, nomeadamente: (1) microscopia luminosa, (2) de campo escuro, (3) de ultravioleta, (4) de fluorescência e (5) de contraste de fase. Na microscopia óptica de campo luminoso, da qual se falará com maior detalhe, o campo do microscópio aparece brilhantemente iluminado e os objetos estudados apresentam-se mais escuros. 1.1 – Partes constituintes do microscópio óptico O microscópio óptico (fig. 1) é constituído por um sistema óptico e um sistema mecânico. O sistema óptico compõe-se de três sistemas de lentes (ocular, objetivas e condensador) e uma fonte de luz. O sistema mecânico é constituído pela estrutura que suporta os elementos do sistema óptico, e inclui os elementos de focagem. 1.2 – Condensador A finalidade do condensador é a de projetar um cone de luz uniforme sobre o objeto. Após a passagem pelo objeto, o feixe penetra na objetiva. A objetiva projeta uma imagem aumentada, no plano focal da ocular, que novamente a amplia. O olho vê uma imagem virtual, ampliada e invertida do objeto. 1.3 – Ampliação A ampliação total é dada pela combinação de lentes do microscópio; é igual ao produto das ampliações individuais das objetivas e da ocular. Assim, por exemplo, se a ampliação da objetiva é 100x e a ampliação da ocular 10x, a ampliação total será 1000x. Os valores das ampliações individuais são normalmente indicados nas lentes, pelo fabricante (fig. 2). Fig. 2: Aspecto de algumas informações existentes nas lentes objetivas. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 9 Fig. 1: Partes constituintes do microscópio óptico. A - elementos do sistema óptico; B – elementos do sistema mecânico. Ajustar a distância entre as lentes oculares de acordo com a distância inter-pupilar do observador e da dioptria. (Fig. 3); OBS: NENHUM COMPONENTE DO MICROSCÓPIO DEVERÁ SER REMOVIDO SEM O AUXILIO E A ORIENTAÇÃO DO PROFESSOR. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 10 Utilizando como referência a figura 01 identifique e localize no seu microscópio os seguintes componentes: 1 – Cabo de energia: ligado á parte de traz do microscópio e conectado a tomada debaixo da bancada. 2 – Base ou pé do microscópio. 3 – Na base do microscópio localizar o interruptor de liga/desliga (on/off). 4 – Na base localizar do microscópio localizar o controle do potenciômetro que tem com função controlar a intensidade de luz. 5 – Na parte superior da base identificar a fonte de luz. (a lâmpada está localizada na parte interna da base e não é acessível). 6 – Identificar o braço ou estativa (coluna) do microscópio. 7 – Na porção inferior do braço identificar os parafusos macrométricos e micrométricos. Movimente estes parafusos nos sentidos: horário e anti-horário e observe o que acontece. 8 – Na porção anterior do braço identifique a mesa ou platina do microscópio. (placa, normalmente de cor preta apresentando no seu centro uma abertura) 9 – Identificar sobre a platina a presilha (cor prata) – lado esquerdo – e o carrinho. 10 – Na parte inferior da platina – lado direito e na vertical – identificar os parafusos que movimento o carrinho. Movimentar os dois parafusos e observar o que acontece. 11 – Na parte inferior da platina identificar os seguintes componentes: A – Filtro: azul B – Controlador do diafragma. C – Condensador. D – Parafuso que permite afastar ou aproximar o condensador da platina. Movimentar este parafuso e observar o que acontece. 12 – Na extremidade superior do braço do microscópio identificar o tubo. 13 – Na porção inferior do tubo identificar o revolver: disco contento quatro lentes objetivas. Girar o disco e observar o que acontece. 14 – Localizar em cada objetiva o número indicativo da sua capacidade de aumento (amplificação da imagem). Anotar aqui o valor de cada objetiva: 1: ___________ ; 2: _____________ ; 3: ______________ ; 4: ________________ . 15 – Identificar na extremidade superior do braço do microscópio as duas lentes oculares. Localizar nestas lentes o valor da sua capacidade de aumento – as duas lentes têm a mesma capacidade de aumento. Anotar aqui o valor de aumento das lentes oculares: 1: ___________ ; 2: _____________ . PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 11 16 – Movimentar as oculares aproximando e afastando uma da outra. 17 – Calcular o aumento final da imagem para cada uma das lentes objetivas do microscópio. 1: ______________________________ ; 2: ______________________________ ; 3: ______________________________ ; 4: ______________________________ ; 18 – Ligar o estabilizador localizado debaixo da bancada à tomada na parede. 19 – Ligar o interruptor de liga/desliga do estabilizador. 20 – Ligar o interruptor de liga/desliga do microscópio. 21 – Girar o botão do potenciômetro para frente e para traz, observando o que acontece com a luz do microscópio. 22 – Com a lâmpada totalmente acessa movimentar a alavanca do diafragma de um lado para o outro e observar o que acontece com a luz que passa pelo condensador. 23 – Com a lâmpada acessa em intensidade mínima observar através das oculares para visualização do campo do microscópio. 24 – Usando as duas oculares simultaneamente observar se você consegue ver apenas uma imagem. 25– Caso esteja vendo duas imagens aproximar as duas oculares e observando através delas afastá-las lentamente até conseguir ver apenas uma imagem. 26 – Observando através das oculares, identificar a “seta”, traço preto presente em uma das oculares. 26 – Diminuir toda a luz utilizando o potenciômetro. 27 – Desligar o microscópio. 28 – Abaixar toda a platina. 29 – Deixar a menor objetiva voltada para a platina. 30 – Cobrir o microscópio com a capa. 31 – Estabilizador. 32 – Desligar o estabilizador da tomada. Seta PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 12 MÉTODOS DE ESTUDOS HISTOLÓGICOS Vários são os métodos de estudos dos tecidos, variando do estudo dos tecidos in vivo até aqueles que utilizam os tecidos mortos. O método mais utilizado em Histologia é o preparado histológico permanente (lâmina histológica) estudado em microscópio óptico. A seguir descrevemos as etapas de produção de uma lâmina histológica: 1ª Etapa: Coleta da Amostra. A primeira etapa de todo o processo de preparação de uma lâmina histológica consiste em coletar a amostra, ou seja, obtê-la e isto pode ser feito de cinco diferentes maneiras: a) Biópsia cirúrgica – obtenção da amostra de tecido ou órgão através de uma incisão cirúrgica; b) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc) através de endoscopia; c) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade natural; d) Cirurgias amplas (radicais) – a amostra corresponde a peças grandes (ex. tumores) ou órgãos (ex. mama, útero); e) Necropsia – procedimento utilizado para estudo anatômico de todos os órgãos ou tecidos, no animal morto. As peças cirúrgicas grandes ou de autópsia devem ser clivadas previamente para reduzir sua espessura permitindo a penetração fácil do fixador. O princípio fundamental de clivagem é que o fragmento possua em torno de 4 mm de espessura. 2ª Etapa: Fixação A base de uma boa preparação histológica é a fixação que deve ser completa e adequada. Para tanto é preciso tomar algumas precauções que são obrigatórias: a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no fixador; b) O volume de fixador deve ser no mínimo dez vezes (10 X) maior que o volume da peça coletada. Os principais objetivos da fixação são: a) Inibir ou parar a autólise tecidual; b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as substâncias insolúveis; c) Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos técnicos posteriores; d) Preservar os vários componentes celulares e tissulares; e) Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos; f) Facilitar a subseqüente coloração. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 13 A fixação pode ser física (utilizando-se o calor ou o frio) ou química. A fixação em Histologia é quase exclusivamente química, onde substâncias (fixadores) são utilizadas com a principal função de insolubilizar as proteínas dos tecidos. Os fixadores podem agir precipitando as proteínas ou as coagulando, assim temos como principais fixadores: a) Que precipitam as proteínas: cloreto de mercúrio e ácido pícrico; b) Que coagulam as proteínas: aldeído fórmico (o mais utilizado, conhecido como fixador universal), tetróxido de ósmio e o aldeído glutárico. Com o intuito de se conseguir o fixador ideal, os histologistas elaboraram diversas misturas fixadoras como, por exemplo, o líquido de BOUIN e o líquido de HELLY. O formol a 10% para microscopia óptica e o aldeído glutárico em solução de 2 a 6% para microscopia eletrônica são os fixadores simples mais comumente utilizados. O tempo de fixação varia de acordo com o tamanho da peça, constituição do tecido, poder de fixação do fixador, objetivos a pesquisar e temperatura ambiente. No entanto, de forma geral, tendo o fragmento, a ser fixado, uma espessura de 4 mm o tempo mínimo de fixação é de doze (12) horas. Observação: Para que se possa examinar o tecido ósseo ou tecido com áreas de calcificação, deve-se antes de processá-lo, incluí-lo e cortá-lo, proceder à descalcificação que consiste na remoção dos sais de cálcio que se encontram depositados nos tecidos orgânicos sem alteração da sua estrutura celular. Os ossos ou outros materiais calcificados devem ser cortados em pequenos pedaços (cerca de 4 mm) com serra adequada, antes da fixação. Depois de completada a fixação, coloca-se o material na solução descalcificadora. Geralmente são empregados como agentes descalcificadores os seguintes ácidos: nítrico, fórmico, tricloacético, clorídrico, pícrico, EDTA, sulfossalicílico. Não existe uma solução descalcificadora ideal. A única diferença entre as várias soluções é que umas agem mais rapidamente do que as outras. O ácido usado deve ser completamente removido do tecido depois de terminada a descalcificação. Isto é feito pela lavagem abundante e cuidadosa em água corrente ou álcool, conforme o descalcificador empregado. Esta lavagem deve ser no mínimo por quatro horas. 3ª etapa: Processamento Após a preservação do tecido, a etapa seguinte consiste em prepará-lo para o exame microscópico. Com a finalidade de permitir que a luz o atravesse, cortes muito delgados de tecido têm que ser feitos. Infelizmente, embora o processo de fixação endureça o tecido, o material não se torna suficientemente firme ou coeso para permitir cortes delgados perfeitos. Para que esse grau de firmeza seja atingido, o tecido deve ser completamente impregnado PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 14 com algum meio de sustentação que manterá juntas as células e as estruturas intercelulares. Os materiais de sustentação usados são denominados materiais de inclusão. Certos materiais de inclusão, tais como “Carbowax” e a gelatina são solúveis em água e os tecidos não precisam ser desidratados antes do uso. Os materiais mais comumente usados são substâncias semelhantes à parafina que não são miscíveis com água. Quando estas substâncias forem utilizadas os tecidos terão que ser desidratados antes da inclusão. 4ª Etapa: Desidratação Antes que um material de inclusão, tal como a parafina, possa penetrar no tecido seu conteúdo em água deve ser removido. A desidratação é levada a efeito imergindo o bloco de tecido em concentrações crescentes de álcool etílico. O álcool é o agente mais comumente utilizado neste processo, sendo empregado numa série crescente (70% - 80% - 90% - 100%) para se evitar a retração pronunciada do tecido ocasionando lesões estruturais da célula de caráter irreversível. O álcool tem a vantagem de endurecer mais o tecido. O volume de álcool deverá ser 10 a 20 vezes maior que o volume da peça. Várias são as substâncias utilizadas como agentes de desidratação: alcoóis etílico, butílico, metílico e isopropílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido propileno. O álcool etílico é o mais utilizado em técnica de rotina. 5ª Etapa: Diafanização (Clarificação) A impregnação do tecido com meio de inclusão é impossível nesse estágio porque as substâncias semelhantes à parafina usadas para a inclusão não se misturam com o álcool. O tecido deve, portanto, ser imerso em um produto químico e que o álcool e a parafina sejam solúveis. Assim a diafanização consiste na infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante. A parafina não se mistura com água e nem com álcool. Ambos devem ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido. O xilol é comumente utilizado. Tal produto químico é muitas vezes chamado de agente clarificador porque torna o tecido semi-translúcido, quase transparente. Entre os reagentes mais utilizados na fase de diafanização podemos citar ainda: toluol, clorofórmio, óleo de cedro, benzol e salicilato de metila. A quantidadede xilol (substância mais empregada) utilizada deve ser 10 a 20 vezes o volume da peça. A duração da clarificação varia com as dimensões, a constituição do material e a temperatura. 6ª etapa: Inclusão (Impregnação) A finalidade da impregnação é eliminar completamente o xilol contido no material e a total penetração da parafina nos vazios deixados pela água e gordura, antes existentes no tecido. Este processo serve também para preparar o material para os cortes, removendo o clarificante PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 15 e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistência adequada para que possa ser cortado. O tecido é passado em duas trocas de parafina para assegurar a substituição de todo o agente clarificador pela parafina. Emprega-se a parafina a uma temperatura de 56 a 60º C (parafina fundida). O bloco de tecido permanecerá imerso na parafina fundida (em estufa) durante o tempo necessário para a completa impregnação. Posteriormente serão retirados da estufa e deixados à temperatura ambiente até que a parafina endureça, após isto o bloco de parafina com o tecido será retirado da fôrma e conduzido ao corte. Pode-se citar ainda como agentes de impregnação: celoidina, goma arábica, parafina plástica, polietileno glicol e parafina esterificada. 7ª etapa: Microtomia Para se obter cortes de material incluído em parafina ou por congelação é necessário um instrumento especial: o micrótomo. Os micrótomos variam de acordo com os fabricantes e tem como fundamento duas peças principais: o suporte ou mandril (onde é fixada a peça a cortar) e a navalha. O suporte é sempre encaixado a um parafuso micrométrico ou a uma espiral metálica que o faz adiantar segundo seu eixo, em medida conhecida e que pode ser regulada à vontade. Esta medida tem como unidade o micrômetro que corresponde à milésima parte do milímetro. Normalmente um micrótomo faz cortes cuja espessura varia de 1 a 50 micrômetros, mas a espessura mais utilizada em microscopia óptica é de 4 a 6 micrômetros. Há vários tipos de micrótomos: rotativo, tipo Minot, de congelação e o destinado a trabalhos de microscopia eletrônica. 8ª etapa: Colagem do Corte à Lâmina As fitas de cortes de parafina são estiradas cuidadosamente e os cortes individuais são separados por um bisturi. Na superfície de uma lâmina de vidro é feito um ponto de aderência (normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina é colocado em banho-maria (água morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no tecido desapareçam. Após o que o corte é “pescado” com a lâmina, preparada com albumina, na qual se adere. 9ª etapa: Coloração É a técnica tintorial empregada para facilitar o estudo dos tecidos sob microscopia. A coloração é de importância fundamental em histologia, pois os tecidos não tratados têm pouca diferenciação óptica. As colorações de um modo geral se efetuam por processos físico- químicos ou puramente físicos e podem ser consideradas, segundo a modalidade, a ação, o caráter, o grau de ação, o tempo, o número de corantes e a cromatização. Quanto à cromatização, ou seja, de acordo com o número de cores conferidas às estruturas pelas colorações simples ou combinadas, estas tomam a denominação de colorações PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 16 monocrômicas (uma cor), bicrômicas (duas cores), tricrômicas (três cores) e policrômicas (mais de três cores). Para se corar convenientemente a célula, deve-se recorrer a um método de coloração sucessiva do núcleo e do citoplasma. A combinação mais comum de corantes usada em Histologia e Histopatologia é a Hematoxilina e Eosina (HE). A hematoxilina é um corante natural obtido da casca de pau campeche. Ela não é realmente um corante e deve ser oxidada em hemateína a fim de tornar- se um corante. Ademais, o corante que resulta (hematoxilina-hemateína) não tem afinidade para os tecidos. Deve ser usado um mordente, como o alumínio ou o ferro, juntamente com a mistura de hematoxilina antes que ela possa corar os tecidos. A mistura cora em azul- púrpura. A eosina é um corante sintético e produz uma coloração vermelha. Nas células coradas com HE os ácidos nucléicos presentes no núcleo são corados pela hematoxilina, dando ao núcleo um tom azul-púrpura. A eosina é atraída pelos elementos básicos da proteína do citoplasma da célula, corando-o de róseo a vermelho. Os componentes dos tecidos que se coram prontamente com os corantes básicos são chamados basófilos; os que têm afinidade pelos corantes ácidos são chamados acidófilos. A hematoxilina comporta- se como um corante básico e, portanto, cora o núcleo de modo basófilo. A eosina é um corante ácido e cora os elementos básicos da proteína do citoplasma de maneira acidófila. Certos corantes reagem com os componentes do tecido e os coram com uma cor diferente da cor da solução corante. A mudança de cor do corante chama-se metacromasia. O azul-de- metileno, o azul-de-toluidina e a tionina são exemplos de corantes simples que exibem metacromasia. Com os corantes azuis a cor muda para vermelho. A coloração dos mastócitos com o azul-de-metileno constitui um bom exemplo. Os grânulos do citoplasma coram-se em vermelho-púrpura, enquanto que o resto do tecido fica azul. A causa da metacromasia não é totalmente compreendida, porém tem sido sugerido que é devido à polimerização das moléculas do corante. Julga-se que a presença de macromoléculas com radicais eletronegativos no tecido facilita a polimerização e provoca a mudança de cor. Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi incluído deve ser removida. O corte, que já foi aderido à lâmina de vidro (pescado em banho-maria), é banhado no xilol para dissolver a parafina. Devido ao fato de muitos corantes serem solúveis em água, torna-se necessário remover o xilol do tecido e substituí-lo por água (hidratação). O corte é imerso em uma série de concentrações decrescentes de álcool etílico até que esteja hidratado. Depois que o corte estiver hidratado procede-se à coloração propriamente dita. No caso da HE, o tecido é imerso primeiramente em hematoxilina, lavado com água para retirada de excedente, depois imerso em eosina e, após isto também se faz lavagem do tecido. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 17 10ª etapa: Montagem Depois que o corte tiver sido corado com a solução apropriada, ele é passado através de concentrações crescentes de álcool para remover, de novo, a água (desidratação). Objetiva- se com esta desidratação aumentar a sobrevida do preparado histológico. Finalmente, o corte é banhado em xilol antes de ser montado em um meio solúvel em xilol, que é o meio de montagem (para os cortes de parafina é usado o Bálsamo de Canadá). Uma gota do meio de montagem é colocada sobre o corte e a lamínula é posicionada sobre o corte de forma delicada, de uma forma tal que o meio de montagem cubra completamente o corte. Depois a lamínula é comprimida com firmeza sobre o corte e o meio de montagem se espalha formando uma delgada película entre a lâmina e a lamínula que posteriormente vão estar firmemente aderidas uma à outra pela estabilização do meio de montagem. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 18 Aula prática II: Microscopia óptica II Para observar as lâminas ao microscópio observe sempre as seguintes etapas: 1. Abaixe a platina usando o parafuso macrométrico, ao perceber que chegou ao final não force mais o parafuso, pois isto poderá travar o sistema; 2. Utilize primeiro, sempre a objetiva de menor aumento (X); 3. Limpe a lâmina a ser examinada e coloque-a sobre a platina com a lamínula voltada para cima; 4. Usando o parafuso macrométrico levante a platina, até atingir o ponto máximo, porém, sem forçar o parafuso para evitar que o sistema trave; 5. Ligue o microscópio eregule a intensidade de luz; 6. Utilizando o carrinho (charriot) centralize o corte na abertura existente na platina; 7. Agora, olhando através das oculares abaixe lentamente a platina utilizando o parafuso macrométrico até conseguir o primeiro foco; 8. Para melhorar a qualidade do foco utilize o parafuso micrométrico (foco fino); 9. Utilizando o carrinho, escolha a área ou a estrutura a ser observada e centralize-a no campo. 10. Gire o disco de objetivas (revolver) e passe e passe para o médio aumento (objetiva de 10X). Ao fazer esta troca de objetivas, certifique-se que esta girando para o lado certo e que a objetiva não irá tocar a lâmina olhando lateralmente; 11. Utilizando o parafuso micrométrico faça a correção foco; 12. Utilizando o carrinho, escolha a área ou a estrutura a ser observada e centralize-a no campo. 13. Gire o disco de objetivas (revolver) e passe e passe para o grande aumento (objetiva de 40X). Ao fazer esta troca de objetivas, certifique-se que está girando para o lado certo e que a objetiva não irá tocar a lâmina olhando lateralmente; 14. Utilizando o parafuso micrométrico faça a correção foco 15. Utilizando o carrinho, escolha a área ou a estrutura a ser observada e centralize-a no campo. 16. Faça a regulagem da intensidade luz utilizando o potenciômetro e/ou o condensador de modo que o material observado fique com uma boa iluminação; 17. Ao mudar de lâmina reinicie todo o processo de focalização. 18. Ao guardar o microscópio abaixe a platina, volte para a objetiva de menor aumento, volte o potenciômetro para posição de intensidade mínima de luz, desligue o microscópio, certifique-se de ter retirado a lâmina do microscópio e cubra-o com a capa. 19. Guarde todas as lâminas utilizadas novamente na caixa, nunca deixe lâminas sobre a bancada. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 19 LEMBRE-SE: Para observar uma lâmina histológica ao microscópio óptico, focalize inicialmente o corte em pequeno aumento (objetiva de 4X), em seguida, passe para o aumento médio (objetiva de 10X) e depois para o grande aumento (objetiva de 40X); * Ampliação: aumento da objetiva X aumento da ocular Ex: objetiva de 10X . ocular de 10X = 100X Utilize sempre as objetivas de pequeno e de médio aumentos para ter uma visão geral do tecido; Utilize o charriot para escolher uma boa área do tecido para estudo; Faça desenhos esquemáticos de cada lâmina observada sempre evidenciando as estruturas em estudo. Geralmente utiliza-se o grande aumento. Anote tudo que possa facilitar o seu estudo posterior deste material; As lâminas geralmente apresentam defeitos (artefatos de técnica) como, por exemplo, dobras no corte, sujeira e retração do tecido. DURANTE AS AULAS PRÁTICAS TODOS OS CRITÉRIOS DE TRABALHO E DE SEGURANÇA DEVERÃO SER CUMPRIDOS. NUNCA TRABALHE COM DÚVIDAS, CASO ELAS EXISTAM, ESCLAREÇA-AS COM O PROFESSOR; NUNCA DEIXE DE TRABALHAR COM O MICROSCÓPIO POR MEDO OU POR INSEGURANÇA, VOCÊ VAI PRECISAR SABER UTILIZADO DURANTE TODO O SEU CURSO E ÀS VEZES NA SUA VIDA PROFISSIONAL; “PREZADO ALUNO: O MICROSCÓPIO está aqui para ajudá-lo”. “Ajude-o conservando sempre limpo e seguindo com atenção as instruções para o seu uso”. NÃO DESMONTE AS OBJETIVAS, OCULARES OU QUALQUER OUTRA PARTE DO MICROSCÓPIO. LEMBRE-SE ELE É O SEU MATERIAL DE TRABALHO E ESTÁ SOB SUA RESPONSABILIDADE. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 20 Objetivo: 1. Conhecer os constituintes de um microscópio óptico e suas funções; 2. Manipular adequadamente o microscópio, obtendo desta forma bons resultados durante as aulas práticas; Material: 1. Lâmina 69. Corte de fígado. Corado com os corantes hematoxilina (roxo) e eosina (róseo) Procedimento: Limpar a lâmina utilizando um guardanapo de papel, sem fazer força para não deslocar a lamínula; Descer a platina do microscópio o máximo possível utilizando o parafuso macrométrico; Colocar a objetiva de menor aumento (4X) em posição de uso, ou seja, voltada para o orifício existente no centro da platina; Levar a lâmina até a platina e fixá-la usando a presilha e verificar se a lâmina está na posição correta; Ligar a luz do microscópio utilizando a chave de liga/desliga (on/off) localizada do lado direito na base do microscópio; Utilizando o controle de variação da intensidade da luz localizado do lado direito na base do microscópio, regule a intensidade de luz. Isto deverá ser feito olhando nas oculares, se o campo estiver escuro aumente a intensidade de luz e se estiver claro demais diminua. Este tipo de regulagem vai depender do tipo de material observado e da sensibilidade à luz de cada pessoa; Existem outros mecanismos para regular a intensidade da luz e a qualidade da imagem que chega aos seus olhos que podem e deverão ser utilizados, falaremos sobre cada um no momento adequado; Utilizando o carrinho movimente a lâmina sobre a mesa até que o material a ser observado fique sobre a luz no centro do orifício da platina; Olhando pelo lado de fora e utilizando o parafuso macrométrico suba a platina do microscópio aproximando a lâmina da objetiva o máximo possível. Certifique-se de que a objetiva jamais toque a lâmina. Se você aproximar a lâmina da objetiva olhando pela ocular, a objetiva poderá tocar a lâmina e quebrá-la. OBS.: AO UTILIZAR O PARAFUSO MACROMÉTRICO: NUNCA FORCE-O, PARA CIMA OU PARA BAIXO, POIS ISTO IRÁ TRAVAR TODO O SISTEMA DO MICROSCÓPIO E ATRASAR A SUA PRÁTICA; SE ISTO ACONTECER CHAME O PROFESSOR OU RESPONSÁVEL PRESENTE, NUNCA TENTE RESOLVER O PROBLEMA VOCÊ MESMO Agora olhando pelas oculares e utilizando o parafuso macrométrico desça a platina devagar, até conseguir uma imagem do objeto a ser observado. Esta imagem com certeza estará fora de foco, então, utilizando o parafuso micrométrico faça a correção do foco PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 21 girando o parafuso micrométrico um pouco para frente, caso você observe que a imagem está ficando mais fora de foco gire o micrométrico no sentido contrário até conseguir o foco correto. Obs.: NUNCA gire o parafuso micrométrico demais num mesmo sentido, se você gira-lo para um lado ou outro e não conseguir corrigir o foco alguma coisa está errada, pare e inicie o processo novamente. Se você girar o micrométrico indefinidamente e a mesa estiver subindo a lâmina será comprimida contra a objetiva se partirá ao meio; Caso a imagem não apresente uma boa qualidade você pode controlar a quantidade luz aumentando ou diminuindo a sua intensidade com o potenciômetro, abrindo ou fechando o diafragma ou mesmo aproximando ou afastando-o da lâmina, ou ainda, utilizando ou não o filtro azul que se localiza abaixo do diafragma. Experimente utilizar todos estes recursos ao observar as lâminas para se acostumar com estes controles e obter imagens de boa qualidade; Agora você vai, olhando pelo lado de fora, passar para uma objetiva de maior aumento, girando o conjunto de objetivas localizadas no “revolver” do microscópio; Obs.: Antes de girar o revolver, certificar-se de que a próxima objetiva a ser utilizada é a de 10X. NUNCA GIRE O REVOLVER PARA A OBJETIVA DE 100X, ELA É A MAIOR E Com CERTEZA IRÁ TOCAR NA LÂMINA E POSSIVELMENTE QUEBRÁ-LA; Gire então o revolver até a objetiva de 10X se encaixe na sua posição correta; Certifique-se de que a objetiva não tocará a lâmina, se você perceber a ela tocou a lâmina, não force, volte para a de menor aumento 4X e recomece todo o processo novamente; Observe o que aconteceu com o objeto observado e anote; Passe agora para a objetiva de maior aumento 40X. TOMANDO SEMPRE OS MESMOS CUIDADOS CITADOS ACIMA; Durante todo o curso proceda sempre desta forma para a visualização das lâminas. O que são corantes? A maioria dos tecidos é incolor por isso são utilizados corantes para oestudo microscópicos dos tecidos. Grande parte dos corantes usados em histologia comportam-se como ácidos ou bases formando reações salinas com radicais ionizáveis dos tecidos. Os componentes teciduais corados com corantes básicos são denominados basófilos; aqueles corados com corantes ácidos são acidófilos. Eosina é um corante ácido róseo que cora o citoplasma e a hematoxilina é um corante básico de coloração roxa-azulada que cora o núcleo. Núcleo é basófilo - apresenta DNA que é ácido, portanto cora-se com corantes básicos. Corantes: Básicos e Ácidos. Estrutura basófila: estruturas que têm afinidade por corantes básicos. Estruturas acidófilas: estruturas que têm afinidade por corantes ácidos. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 22 Lâmina 69: Corte de fígado. Coloração histológica: HE. Hematoxilina: corante básico (cor arroxeada). Eosina: corante ácido (cor rósea). Em pequeno e médio aumentos e utilizando o charriot, observe que o fígado tem aspecto esponjoso apresentando cavidades de tamanhos variados. Algumas destas cavidades podem conter sangue no seu interior. Passe para o grande aumento e observe a organização dos hepatócitos no fígado, conforme esquema a seguir: 1. Células hepáticas ou hepatócitos: formando fileiras; 2. Capilares sinusóides, em imagem negativa, entre as fileiras de hepatócitos. Estes capilares convergem para um vaso sanguíneo maior, que geralmente apresenta-se em corte transversal. Observe em grande aumento a morfologia dos hepatócitos: 1. Núcleo: arredondado, corado pela hematoxilina, corante básico, sendo, portanto, basófilo, devido a presença de ácidos nucleicos (DNA e RNA) em sua cromatina. O hepatócito geralmente apresenta 1 núcleo; 2. Nucléolo: granulação basófila, grosseira e bem definida no interior do núcleo, sendo um ou dois por núcleo; 3. Citoplasma: cora-se pela eosina, corante ácido (acidofilia) por conter predominância de substâncias básicas; 4. Limite celular: não é visível, pois a espessura da membrana plasmática está abaixo do limite de resolução do microscópio óptico. No entanto, considerando-se a maioria dos hepatócitos apresentam apenas 1 núcleo, pode-se determinar arbitrariamente um limite celular para os hepatócitos; Além dos hepatócitos, o fígado possui outras células, por exemplo: células endoteliais encontradas no epitélio dos vasos sanguíneos e células do tecido conjuntivo com núcleos alongados e fortemente basófilos. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 23 Faça um desenho esquemático, em grande aumento, indicando os componentes estruturais dos hepatócitos. DESENHO: LÂMINA 69. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 24 Aula prática III: Núcleo interfásico e em divisão Lâmina 06: Corte de raiz de cebola. Coloração histológica: HE. Hematoxilina: corante básico (cor arroxeada). Eosina: corante ácido (cor rósea) Observe macroscopicamente e utilizando pequeno aumento, que a lâmina contém vários cortes de raiz de cebola. Em médio aumento, escolha um corte bem preservado, focalize a ponta da raiz onde se encontram os núcleos em divisão. Passe para o grande aumento e observe: 1. Núcleos interfásicos da célula vegetal: ovoides e centrais. A cromatina apresenta-se como grânulos basófilos muito finos. O nucléolo, 1 ou 2 por célula, apresenta-se como grão maior e bem definido no núcleo. 2. Núcleos em divisão mitótica: apresentam cromatina condensada formando cromossomos também basófilos e organizados em diferentes fases: a. PRÓFASE: núcleo de forma arredondada, cromatina em grânulos ou filamentos grosseiros devido à sua condensação gradativa nesta fase. O nucléolo pode às vezes ser localizado. b. METÁFASE: cromossomos muito condensados formando filamentos curtos e espessos dispostos na placa equatorial da célula. c. ANÁFASE: cromátides separadas migram para os polos da célula. d. TELÓFASE: os cromossomos, nos polos, começam a descondensar-se e o material nuclear volta à forma arredondada. A parede da célula vegetal, encontra-se em formação (fragmoplasto) dividindo o citoplasma das células filhas, no final desta fase. OBS.: As fases da mitose também podem ser observadas em lâmina de raiz de cebola corada pela reação de Feulgen (lâmina 7). PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 25 DESENHO: LÂMINA 06/07. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 26 INTRODUÇÃO À HISTOLOGIA Histologia É definida como sendo a ciência, parte da biologia, que estuda os tecidos. O termo histologia foi usado pela primeira vez em 1819 por Mayer, que aproveitou o termo “tecido” que Bichat (anatomista francês) instituiu, muito tempo antes (por volta de 1800), para descrever macroscopicamente as diferentes texturas encontradas por ele no corpo animal. Mayer fez a conjunção do termo histos = tecido e logos = estudo. E o que é tecido? Tecido Há vários conceitos para tecido. É possível encontrar alguns autores que definem tecido como sendo um conjunto de células que apresentam mesma forma, mesma função e mesma origem embrionária. Mas, este conceito não possui muita sustentação histológica. Se analisarmos, por exemplo, o sangue, veremos que a forma de uma hemácia (disco bicôncavo, anucleado na maioria dos animais domésticos) é totalmente diferente de um neutrófilo (ovoide, quando no sangue, com núcleo lobulado). Quanto à função destas células: a hemácia transporta oxigênio e gás carbono, enquanto o neutrófilo é uma célula fagocitadora. Portanto, vemos que apesar de pertencerem ao mesmo tecido elas não têm a mesma forma e tão pouco a mesma função. Ainda outro exemplo nos remete a raciocinar: no tecido ósseo os osteócitos são células arredondadas cuja função é contribuir na manutenção da matriz óssea, enquanto os osteoclastos são células cuja forma varia muito, pois se movem através da emissão de “pseudópodes” e são responsáveis pela reabsorção óssea. Portanto, nem possuem a mesma forma e muito menos a mesma função. Poderíamos discorrer muito mais, mostrando inúmeros exemplos em que se constata que a grande maioria dos tecidos é constituída por células que têm funções e forma diferentes. Já quanto à afirmação de que as células de um tecido apresentam mesma origem embrionária, de fato esta afirmação é aplicável. As células que compõem um tecido normalmente apresentam mesma origem embrionária. Assim, como conceituar tecido? Tecido é um conjunto de células que apresentam a mesma função geral e a mesma origem embrionária. Diríamos a mesma função geral, pois um tecido apresenta uma ou mais funções gerais. Por exemplo: os epitélios de forma geral apresentam como função principal revestir as superfícies corpóreas, assim sua função geral é revestir uma superfície. No epitélio, como, por exemplo, o da traqueia, tem-se a células ciliadas e as células caliciformes. Ambas apresentam formas e funções diferentes, mas as duas realizam a função geral de revestir. Origem Embrionária dos Tecidos Neste ponto devemos começar do início: quando o espermatozoide (gameta masculino) e o óvulo (gameta feminino), ambas as células apresentando a metade do número de cromossomos (portanto haploides) de uma célula somática da espécie, encontram-se em PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 27 ambiente propício – que pode ser o útero ou em meio de cultura – ocorre a fecundação. As duas células após a fecundação formam uma célula, o zigoto, que é uma célula diploide (como o mesmo número de cromossomos de qualquer célula somática da espécie). Formado o zigoto ele passa a sofrer sucessivas mitoses, processo denominado de clivagem. Uma célula forma duas, as duas formam quatro, as quatro formam oito e assim sucessivamente. Por volta do sétimo dia pós-fecundação o que se vê é um amontoadode células envoltas por uma membrana translúcida. Cada célula é chamada de blastômero, sendo células totipotentes (ainda não diferenciadas e com a potencialidade de originar qualquer uma das células do corpo animal), e a membrana envoltória é chamada de zona pelúcida. Este estágio do embrião por se assemelhar muito a uma amora é chamado de mórula. Por volta do oitavo/nono dia forma-se uma pequena cavidade no interior do embrião, a blastocele. Neste momento o embrião passa a se chamar de blástula ou blastocisto. Na fase seguinte, a gástrula é possível identificar os dois primeiros tecidos embrionários – ectoderma, o mesoderma e o endoderma. O ectoderma é folheto embrionário externo e o endoderma o folheto embrionário interno. O mesoderma é o folheto médio. A partir daí começa haver diferenciação celular e formação dos tecidos animais. Por exemplo: do ectoderma forma-se o tecido nervoso e alguns epitélios de revestimento; já do mesoderma origina-se a maioria dos tecidos conjuntivos e musculares; do endoderma alguns epitélios de revestimento. Os tecidos embrionários são três (ectoderma, mesoderma e endoderma) e deles se formam todos os tecidos do corpo animal, mas a propósito quantos e quais são os tecidos encontrados no corpo animal? Tecidos Fundamentais Macroscopicamente Bichat (Marie François Xavier Bichat), por volta de 1800, conseguiu identificar 21 diferentes tipos de tecidos. Mas com o advento do microscópio foi possível identificar muitos outros tecidos (aproximadamente 41). Mas todos estes tipos podem ser agrupados em quatro diferentes tecidos, chamados de tecidos fundamentais: os tecidos epiteliais, os tecidos conjuntivos, os tecidos musculares e o tecido nervoso. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 28 PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 29 Aula prática IV: Tecido epitelial de revestimento: Epitélio simples Ao observar as lâminas lembre-se que: 1. O limite das células epiteliais não é visível ao microscópio óptico, pois a espessura da membrana plasmática está abaixo do seu limite de resolução. 2. Consequentemente a forma das células epiteliais é determinada observando-se o formato dos seus núcleos. 3. A cada núcleo corresponde uma célula epitelial. 4. O limite inferior do epitélio é marcado pelo tecido conjuntivo uma vez que a membrana basal não é visualizada ao microscópio óptico, principalmente quando se utilizam técnicas de rotina. 5. O número de camadas do epitélio é determinando observando-se a posição dos núcleos das células epiteliais. Lâmina 59: Corte transversal de estômago (região fúndica). Coloração: HE Em pequeno aumento, localize o epitélio que reveste a superfície cavitária do órgão na região arroxeada do corte a qual pode ser identificada macroscopicamente. Em grande aumento (400X), observe a morfologia deste epitélio de revestimento: 1. Camada única de células justapostas. Este aspecto é observado localizando-se o limite inferior do epitélio em contato com o tecido conjuntivo (corado pela eosina). 2. Células epiteliais prismáticas ou colunares: Cada célula possui um núcleo alongado localizado na região basal próximo ao tecido conjuntivo e citoplasma eosinófilo, também alongado. Este epitélio não apresenta especializações, no entanto, as células prismáticas do estômago são produtoras de muco sendo as vezes, referido como epitélio mucíparo. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 30 CLASSIFICAÇÃO: E.R. simples prismático. DESENHO: LÂMINA 59. Lâmina 62: Corte de intestino delgado (jejuno-íleo). Coloração: HE O intestino delgado apresenta elevações digitiformes (vilosidades intestinais) na sua superfície cavitária (região arroxeada do corte) abaixo. Em pequeno aumento (40X), identifique as vilosidades intestinais em corte longitudinal, obliquo ou transversal. Localize o epitélio que reveste as vilosidades intestinais em corte longitudinal. Em grande aumento (400X), observe a morfologia deste epitélio: 1. camada única de células: localize o limite inferior do epitélio em contato com o tecido conjuntivo; 2. células epiteliais prismáticas: possuem núcleos alongados localizados na base do epitélio, próximo ao tecido conjuntivo do eixo das vilosidades. O citoplasma das células epiteliais é acidófilo e também alongado. 3. especializações: a. Borda estriada: aparece como linha mais corada na superfície apical do epitélio. Ao microscópio eletrônico, a borda estriada corresponde as microvilosidades das células prismáticas (célula absortiva intestinal). b. Células caliciformes: Ficam entremeadas no epitélio entre as células prismáticas. São células globosas, pouco coradas ou em imagem negativa e com núcleos basais. As células caliciformes, células secretoras de muco, possuem citoplasma em forma de cálice (base afilada e ápice dilatado). PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 31 CLASSIFICAÇÃO: E. R. simples prismático com borda estriada e células caliciformes. DESENHO: LÂMINA 62. Lâmina 43: Corte de feixe vásculo-nervoso. Coloração HE Feixe vásculo-nervoso é o conjunto de vasos sanguíneos e fibras nervosas envolvidos por tecido conjuntivo. Em pequeno aumento (40X) e médio (100X) aumentos, identifique os vasos sanguíneos em cortes transversais que se caracterizam por conter lume (CAVIDADE) às vezes com restos de sangue em seu interior e parede formada por diferentes tecidos. Em grande aumento (400X), procure identificar o epitélio que reveste o lume destes vasos (endotélio) e observe sua morfologia. É constituído de camada única de células As células epiteliais são pavimentosas. Possuem núcleo alongado e denso fazendo saliência na luz do vaso e citoplasma escasso, de difícil visualização. A forma alongada pavimentosa é indicada pelo distanciamento entre os núcleos. Em determinadas regiões, o endotélio pode estar desgarrado da parede do vaso, facilitando a visualização da célula. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 32 Na parede dos vasos sanguíneos existem outros tecidos, abaixo das células endoteliais. CLASSIFICAÇÃO: E. R. simples pavimentoso. DESENHO: LÂMINA 43. Lâmina 73: Corte transversal de traqueia. Coloração HE. Localize o epitélio de revestimento na superfície cavitária da traqueia, em pequeno (40X) e médio (100X) aumento. Em grande aumento (400X) localize o limite inferior do epitélio, em contato com o tecido conjuntivo (corado pela eosina e com muitos núcleos) e observe a morfologia deste epitélio. 1) Apresenta núcleos em várias alturas dando falsa impressão de epitélio estratificado sendo denominado pseudo-estratificado. 2) Suas células são prismáticas. Pelo formato dos núcleos, observam-se dois tipos de celulares: PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 33 a. Célula prismática alta: com núcleo vesiculoso, alongado acompanhando o formato da célula e cílios na superfície apical. b. Célula prismática baixa: possui núcleo ovoide localizado na base do epitélio. Esta célula não atinge a superfície sendo também chamada de célula basal. 3) Apresenta especializações: Cílios e células caliciformes. 4) Como todas as células tocam a membrana basal (esquema abaixo) é classificado como epitélio simples. CLASSIFICAÇÃO: E. R. prismático pseudo-estratificado ciliado e com células caliciformes. DESENHO: LÂMINA 73. http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=rDzRAp7yaF-KkM&tbnid=tEMxQS1Bz4hmyM:&ved=0CAUQjRw&url=http://minerva.ufpel.edu.br/~mgrheing/cd_histologia/geral/pseudoestratificado.htm&ei=eU32UvKcAofLkQfF74CYBg&bvm=bv.60983673,d.eW0&psig=AFQjCNHEQy34wLcj2coUNd8R7JaXbcn8EA&ust=1391959721498261 PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 34 Aula prática V: Tecido epitelial de revestimento: Epitélios estratificados Lâmina 51: Corte de pele espessa.Coloração HE. Identifique o epitélio de revestimento na superfície do corte, em pequeno aumento (40X). Em médio (100X) e grande (400X) aumento, observe sua morfologia: 1. É constituído por várias camadas de células como pode ser observado pela posição dos núcleos das células epiteliais. Identifique o limite inferior do epitélio em contato com o tecido conjuntivo. 2. As células da camada basal (camada germinativa), próxima ao tecido conjuntivo, são prismáticas como pode ser observado pela forma de seus núcleos. Nas camadas intermediárias, as células epiteliais possuem núcleos ovoides sendo, portanto cuboidais. Na última camada, as células são pavimentosas com grânulos basófilos citoplasmáticos. As células pavimentosas são as mais diferenciadas deste epitélio, sendo, referidas na classificação. 3. Acima das camadas pavimentosas, observa-se espessa camada de queratina, menos corada, sem núcleos e constituída de células mortas totalmente queratinizadas. Na superfície, a queratina sofre descamação e na base, as células prismáticas dividem-se por mitose (camada germinativa) e diferenciam-se para recompor o epitélio. Este epitélio é característico de superfície seca, sujeita a atrito e ressecamento. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 35 CLASSIFICAÇÃO: E. R. estratificado pavimentoso queratinizado. DESENHO: LÂMINA 51. Lâmina 57: Corte transversal de esôfago. Coloração HE. Em pequeno e médio aumento, observe que o esôfago tem cavidade irregular com dobras ou pregas. Identifique o epitélio de revestimento na superfície cavitária do órgão. Em grande aumento, observe sua morfologia: 1. É constituído de várias camadas de células, semelhante ao epitélio da pele: camada basal de células prismáticas próximas ao tecido conjuntivo. Várias camadas de células cúbicas e a 2. Última camada (camada superficial) de células pavimentosas com núcleos densos. Estas células sofrem descamação enquanto as células basais dividem-se por mitoses para recompor o epitélio. 3. Não apresenta queratina. 4. http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=DMTPyulQaUVCGM&tbnid=bz17EkWxRbAVLM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.ufrgs.br/atlasbiocel/jogos/tecidos/epitelia/quiz/epitelial2.htm&ei=bE72Up7CApLNkAf_9IA4&bvm=bv.60983673,d.eW0&psig=AFQjCNER5Q2LwC5RHY2QMa1Ih2imrxOoWA&ust=1391960011120550 PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 36 CLASSIFICAÇÃO: E. R. estratificado pavimentoso não queratinizado. DESENHO: LÂMINA 57. Lâmina 77: Corte de bexiga Coloração: HE Identifique o epitélio de revestimento da bexiga na superfície cavitária que apresenta-se irregular e pregueada. Este epitélio apresenta adaptações que permitem a dilatação do órgão. Em grande aumento, observe a morfologia deste epitélio: Apresenta núcleos em diferentes posições: células basais prismáticas próximas ao tecido conjuntivo, células intermediárias cúbicas semelhante à epitélios estratificados. A camada superficial possui células grandes de superfície globosa com núcleos ovoides. É a principal característica morfológica deste epitélio. No tecido de distensão, o epitélio de revestimento, o epitélio de revestimento da bexiga sofre modificações no número de camadas e na forma das células epiteliais (esquema abaixo) sendo classificado como epitélio de transição. Alguns autores consideram a classificação deste epitélio como estratificado baseados em seu aspecto ao MO. Outros consideram a classificação quanto ao número de camadas inadequada para este epitélio, pois a microscopia eletrônica mostrou que as células superficiais têm forma de cogumelo com longo prolongamento citoplasmático que toca a membrana basal. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 37 CLASSIFICAÇÃO: Epitélio estratificado de transição ou epitélio de transição. DESENHO: LÂMINA 77. http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=0GGPGvJZrVoBeM&tbnid=L4dmzZ3wg1lW4M:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.pucrs.br/fabio/histologia/atlasvirtual/maxim/04u1leg.htm&ei=yoP3UvPWGNK0kQfFiIGwAw&bvm=bv.60983673,d.eW0&psig=AFQjCNEOKBJ-PSAX5r-e--kvi7YHE-gLRg&ust=1392039152268251 PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 38 Aula prática VI: Glândulas exócrinas Lâmina 57: Corte transversal de esôfago. Coloração HE. Localize e classifique o epitélio de revestimento na superfície cavitária do órgão. Abaixo do epitélio, localiza-se o tecido conjuntivo corado pela eosina e mais profundamente, observam-se as glândulas esofágicas no meio do tecido conjuntivo. Em médio aumento, identifique os adenômeros corados palidamente e mais superficialmente, ductos em cortes transversais ou oblíquos. Em médio e grande aumentos, observe: 1. Ducto: único, simples e não ramificado. Apresenta-se em corte transversal ou obliquo. É constituído de células cúbicas (E.R. estratificado cúbico) revestindo uma cavidade (lume). A presença do ducto indica que a glândula é exócrina. Procure outros cortes de ductos e observe que eles não se ramificam. Cada ducto corresponde a uma glândula exócrina simples. 2. Forma dos adenômeros: túbulo-acinosos. Em corte, os adenômeros apresentam forma arredondada, alongada ou com parte alongada e parte arredondada. Estudos com cortes seriados concluíram que cada glândula esofágica é constituída de um único adenômero túbulo-acinoso longo e ramificado (esquema a baixo). 3. Aspecto histológico dos adenômeros: coram-se fracamente por técnicas histológicas de rotina. Suas células apresentam-se vacuoladas com núcleos densos, achatados na região basal dos adenômeros. Possuem lume amplo, irregular e facilmente visualizado. Um adenômero com estas características histológicas é classificado como mucoso. Técnicas histoquímicas para carboidratos como PAS e Alcian Blue coram fortemente os adenômeros mucosos. Características histológicas e histoquímicas indicam que a secreção do adenômero mucoso é rica em carboidratos e pobre em proteínas. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 39 CLASSIFICAÇÃO: Glândula exócrina simples túbulo acinosa mucosa. DESENHO: LÂMINA 57. Lâmina 65: Corte de parótida. Coloração HE A parótida é uma glândula salivar que constitui um órgão. Em pequeno e médio aumentos, observe que a glândula é dividida em lóbulos separados por conjuntivo. Os lóbulos são constituídos de adenômeros e ductos menores que convergem para ductos maiores localizados no tecido conjuntivo entre os lóbulos e finalmente para o ducto principal que desemboca na cavidade bucal. Em grande aumento, observe: 1. Ductos intralobulares: aparecem em cortes transversais ou oblíquos no interior dos lóbulos. São formados por células prismáticas ou cúbicas acidófilas (eosinofílicas) constituindo epitélio simples em torno de lume arredondado e amplo. 2. Ductos interlobulares: localizam-se nos septos de tecido conjuntivo entre os lóbulos. Utilize médio aumento para localizá-los. Possuem lume amplo revestido por epitélio com número PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 40 variável de camadas dependendo do diâmetro do ducto. A ocorrência de ductos com lumes de diferentes diâmetros e presença de ramificações indicam que a glândula é composta. 3. Forma dos adenômeros: arredondada ou acinosa. 4. Aspecto histológico dos adenômeros: as células secretoras apresentam-se bem coradas devido ao ergastoplasma basal e aos grãos de secreção apicais. Os núcleos são ovoides e localizam-se no terço médio das células. O lume do adenômero é estreito e de difícil visualização ao microscópio óptico. Um adenômero com estas características é denominado seroso. O adenômero seroso reage negativamente as técnicas histoquímicas para detecção de carboidratos: PAS e AB, indicando que a secreção do adenômero seroso é pobre em carboidratos. No entanto, sua secreção é rica em proteínas.CLASSIFICAÇÃO: Glândula exócrina composta acinosa serosa. DESENHO: LÂMINA 65. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 41 Lâmina 66: Corte de submandibular. Coloração: Tricrômico de Gomeri. Como a parótida, a submandibular é um órgão e também possui extensa árvore de ductos e inúmeros adenômeros. Em médio e grande aumentos, identifique: Ductos: são encontrados no interior dos lóbulos (intralobulares) e entre os lóbulos da glândula (interlobulares). Apresentam coloração clara (rósea) e são constituídos por células cúbicas ou prismáticas, dependendo do calibre do ducto. Possuem lume amplo, regular e podem conter secreção acidófila em seu interior. Observe que os ductos possuem diferentes calibres indicando que a glândula é composta. Forma dos adenômeros: acinosos e túbulo-acinosos. Aspecto histológico dos adenômeros: serosos corados em vermelho pelo cromotropo 2R e sero-mucosos com uma semi-lua serosa (vermelha) e parte mucosa fracamente corada (verde luz). Utilizando-se cortes seriados, verificou-se que os adenômeros desta glândula podem ser de 2 tipos apenas: acinosos serosos e túbulo-acinosos sero-mucosos (esquema abaixo). PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 42 CLASSIFICAÇÃO: Glândula exócrina composta túbulo-acinosa sero-mucosa. DESENHO: LÂMINA 66. Lâmina 63: Corte de intestino grosso. Coloração: HE. Em pequeno aumento, localize a superfície do corte voltada para a luz intestinal (região mais arroxeada do corte) Em médio aumento, observe que o epitélio de revestimento sofre invaginações tubulares formando glândulas alongadas onde localizam-se muitas células caliciformes. As glândulas podem apresentar-se em corte longitudinal, obliquo ou transversal (esquema abaixo). Em grande aumento, identifique o epitélio de revestimento do órgão e classifique-o. Procure uma área onde as glândulas estejam em corte longitudinal e obaserve: 1. cada glândula é um túbulo constituído de células prismáticas entremeadas de células caliciformes, dispostas em torno de uma cavidade alongada (lume da glândula). A célula caliciforme lança sua secreção no lume da glândula que desemboca na luz do intestino onde a secreção mucosa vai lubrificar as células epiteliais. As glândulas são atípicas pois não possuem adenômeros e ductos distintos como a maioria das glândulas exócrinas. A porção secretora é constituída por células caliciformes e a porção condutora é o lume do túbulo. Deste modo, a classificação quanto ao aspecto histológico não se aplica a esta glândula. Observe o aspecto das glândulas tubulosas e das células caliciformes do intestino grosso submetidas às técnicas histoquímicas para carboidratos (lâminas 4 e 5). PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 43 CLASSIFICAÇÃO: Glândula exócrina simples tubulosa. DESENHO: LÂMINA 63. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 44 Aula prática VII: Glândulas endócrinas e anfícrinas (mistas) Lâmina 79: corte de adrenal (supra-renal). Coloração: HE. Em pequeno aumento, observe que a adrenal é constituída de 2 regiões: cortical (região periférica) e medular (região central). Em médio e grande aumentos, observe a morfologia glandular na região cortical: 1. Ausência de ductos: Glândula endócrina 2. Células glandulares dispostas em fileiras ou cordões (Glândula endócrina cordonal) separados por capilares sinusóides colabados, os quais podem ser reconhecidos pela presença de núcleos densos e alongados (células endoteliais) entre as células cordonais. 3. Células glandulares com núcleos ovóides e citoplasma claro de aspecto vacuolado (imagem negativa de lipídios). São células secretoras de hormônios esteróides. Na região medular, os cordões são enovelados dificultando a visualização das fileiras de células. CLASSIFICAÇÃO: Glândula endócrina cordonal. DESENHO: LÂMINA 79. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 45 Lâmina 80: Corte de tireoide. Coloração: HE Em pequeno e médio aumentos, observe que a tireoide é uma glândula constituída por várias vesículas ou folículos contendo secreção acidófila. Em médio e grande aumentos, observe: 1. Ausência de ductos. 2. Cada folículo é constituído por camada única de células cuboidais (tireócitos) revestindo uma cavidade ampla (lume do folículo) repleta de secreção acidófila homogênea. Em alguns folículos observam-se áreas vacuolizadas que indicam reabsorção do coloide (tireoglobulina) pelos tireócitos. Capilares sanguíneos são encontrados no conjuntivo entre os folículos (não é necessário identificá-los). CLASSIFICAÇÃO: Glândula endócrina folicular. DESENHO: LÂMINA 80. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 46 Lâmina 68: Corte de pâncreas. Coloração: Hematoxilina (com alumen de cromo) e floxina. Em pequeno e médio aumentos, observe que o pâncreas é constituído de 2 regiões distintas: parte exócrina, basófila, fortemente corada, que representa a maior parte da glândula e parte endócrina, de coloração mais clara, constituída de aglomerados de células, as ilhotas de Langerhans (ilhotas pancreáticas), conforme esquema abaixo. Em grande aumento, observe a morfologia da porção exócrina da glândula: 1. Ductos: são ramificados e possuem diferentes calibres (glândula exócrina composta). Os ductos maiores localizados nos septos de tecido conjuntivo (interlobulares) são facilmente identificados, sendo constituídos de células prismáticas altas podendo apresentar células caliciformes. Ductos intralobulares constituídos de epitélio simples cúbico são pouco numerosos (Não é necessário identificá-los). 2. Adenômeros: acinosos serosos, com ergastoplasma na região basal e grãos de zimogênio na região apical. CLASSIFICAÇÃO: Glândula exócrina composta acinosa serosa. Em médio aumento, identifique a porção endócrina do pâncreas e, em grande aumento, observe sua morfologia: 1. É constituída de vários aglomerados de células endócrinas entremeadas na porção exócrina da glândula. Cada aglomerado de células é uma ilhota pancreática ou ilhota de Langerhans. 2. As células glandulares dispõem-se formando cordões enovelados separados por capilares sanguíneos. São facilmente reconhecidas: células acidófilas (célula alfa; secretora de glucagon) e células basófilas (célula beta: secretora de insulina). CLASSIFICAÇÃO DA ILHOTA: Glândula endócrina cordonal CLASSIFICAÇÃO COMPLETA DO PÂNCREAS: Glândula anfícrina (mista). PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 47 DESENHO: LÂMINA 68. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 48 Aula prática VIII - Células do tecido conjuntivo Lâmina 11: Corte de pele e fígado. Coloração vital: Azul de Tripan. Corante histológico: safranina (corante básico, vermelho) CORTE DE PELE: Identifique-o macroscopicamente por apresentar-se pouco corado pois as fibras colágenas não se coram nesta técnica. Em médio e grande aumentos, identifique: 1. macrófagos livres: que pinocitam gotículas de azul de tripan, in vivo (granulopexia). Possuem forma variada sendo a maioria arredondada, citoplasma com grãos grosseiros de tamanhos variados e heterogeneamente corados em azul. O núcleo dos macrófagos, corado pela safranina, pode ser identificado em algumas células. 2. mastócitos corados em vermelho pela safranina (corante básico). Possuem forma ovóide, tamanho semelhante ao de macrófagos e citoplasma repleto de grânulos finos que contem glicosaminoglicanos ácidos sulfatados. A lâmina pode conter outros elementos corados em vermelho que não devem ser confundidos com mastócitos: núcleos de outras células conjuntivas e fibras musculares, em corte transversal. DESENHO: LÂMINA 11. CORTE DE FÍGADO: Em médio e grande aumentos, observe: 1. hepatócitos em fileiras coradosem róseo 2. macrófagos fixos do fígado (células de Kupffer) que pinocitam gotículas de azul de tripan, in vivo (granulopexia). Tem forma alongada, fusiforme, coram-se em azul e localizam-se na parede dos capilares sinusóides entre as fileiras de hepatócitos. DESENHO: LÂMINA 11. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 49 Lâmina 12: corte de lábio (pele pilosa). Coloração: azul de toluidina. Esta lâmina foi corada com azul de toluidina para identificação de mastócitos pela metacromasia. Não há coloração para o epitélio, fibras do tecido conjuntivo, nem para outras células. Folículos pilosos, em corte transversal ou obliquo coram-se em cor azul claro. Em médio e grande aumentos, observe: 1. mastócitos: células ovóides coradas em azul escuro (arroxeado) 2. grânulos dos mastócitos: finos, preenchendo todo o citoplasma. Estes grânulos são metacromáticos quando corados pelo azul de toluidina pois contém glicosaminoglicanos sulfatados que mudam a cor do corante para vermelho-arroxeado. No entanto, a luz fluorescente impede a transmissão correta do espectro e por isso estas granulações aparecem em azul escuro (arroxeado) 3. núcleos dos mastócitos: em imagem negativa e localizados centralmente. DESENHO: LÂMINA 12. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 50 Aula prática IX: Tecido conjuntivo – Variedades de Tecido Conjuntivo Próprio MATERIAL INTERCELULAR E FIBROBLASTO/FIBRÓCITO Lâmina 51: Corte de pele espessa. Coloração: HE Identifique e classifique o epitélio de revestimento da pele. Abaixo deste epitélio, localiza-se o tecido conjuntivo que é constituído de células (núcleos basófilos) separadas por abundante material intercelular acidófilo. Próximo ao epitélio, observe as papilas do conjuntivo, evaginações que facilitam a nutrição das células epiteliais. Em médio e grande aumentos, observe: 1. Os componentes do tecido conjuntivo: fibras colágenas: acidófilas, coradas pela eosina e constituídas de colágeno do tipo I. 2. Conjuntivo frouxo: Logo abaixo do epitélio de revestimento, principalmente nas papilas. Caracteriza-se por apresentar numerosas fibras colágenas finas (acidófilas), abundante SFA (imagem negativa) e muitas células. 3. Conjuntivo denso desordenado: Abaixo do conjuntivo frouxo e ocupa a maior parte do corte. Caracteriza-se por apresentar predominância de fibras colágenas espessas desordenadas (em corte transversal, obliquo ou longitudinal), SFA escassa e células pouco numerosas, sendo fibrócitos as células mais comuns deste tecido. Estas duas variedades de tecido conjuntivo possuem, também, fibras reticulares e elásticas as quais não são identificadas nesta lâmina. a. Fibras colágenas finas: localizadas logo abaixo do epitélio, principalmente nas papilas do conjuntivo. Tem coloração mais clara. b. Fibras colágenas espessas: localizam-se abaixo das fibras colágenas finas e correspondem à maior parte do corte. São mais fortemente coradas pela eosina e dispõem- se desordenadamente aparecendo em corte transversal, obliquo e longitudinal. 4. Células do tecido conjuntivo: somente seus núcleos podem ser visualizados na lâmina. a. Núcleo de fibrócito: alongado e fusiforme acompanhando o formato da célula e fortemente basófilo, pois possui cromatina densa. Fibrócitos são mais numerosos entre as fibras colágenas espessas, onde são facilmente identificados. b. Núcleos de outras células: ovóides, com cromatina frouxa, localizados principalmente entre as fibras colágenas finas. 5. Substância fundamental amorfa (SFA): em imagem negativa (espaços claros entre as fibras colágenas), pois é de difícil preservação devido a sua riqueza em glicosaminoglicanos. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 51 DESENHO: LÂMINA 51. Lâmina 14: Corte de pele. Coloração: Tricrômico de Mallory Observe: 1. Epitélio de revestimento 2. Fibras colágenas finas: coradas pelo azul de anilina, corante ácido 3. Fibras colágenas espessas: coloração azul mais forte do que as fibras colágenas finas 4. Núcleos corados em vermelho 5. SFA em imagem negativa Identifique e classifique o tecido epitelial. __________________________________________________________________________ Identifique e classifique as variedades de tecido conjuntivo. __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ DESENHO: LÂMINA 14. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 52 Lâmina 16: Corte de fígado, rim e baço. Técnica: impregnação pela prata para fibras reticulares. NÃO É PRECISO IDENTIFICAR OS ÓRGÃOS. Em médio e grande aumentos, observe: 1. Fibras reticulares, em negro, devido a impregnação pela prata sendo denominadas fibras argirófilas do tecido conjuntivo. São constituídas de colágeno do tipo III. 2. Organização em rede: fibras reticulares finas organizam-se em rede formando a trama de sustentação (estroma) das células em órgãos epiteliais como fígado, rim e órgãos hemocitopoéticos (baço, linfonodos, medula óssea). NÃO HÁ COLORAÇÃO PARA AS CÉLULAS. DESENHO: LÂMINA 16. Lâmina 15: Corte de artéria de grande calibre e epiglote. Técnica de Verhoeff para fibras elásticas, contra-coloração: eosina CORTE TRANSVERSAL DE ARTÉRIA: Identifique-o macroscopicamente por apresentar parede escura e lume amplo. Em médio e grande aumentos, observe o conjuntivo elástico na parede deste vaso PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 53 sanguíneo: 1. Possui predominância de fibras elásticas, coradas em negro, formando lâminas elásticas dispostas de forma concêntrica na parede do vaso. As lâminas elásticas têm aspecto ondulado facilitando a distensão da parede do vaso e controle do fluxo e pressão sangüínea. O conjuntivo elástico possui outros componentes: fibras colágenas, células musculares lisas, fibrócitos e SFA escassa. DESENHO: LÂMINA 15. Lâmina 21: Corte longitudinal de tendão. Coloração: HE Em médio e grande aumentos, observe as características do tecido conjuntivo denso ordenado: 1. Predominância de fibras colágenas (acidófilas) espessas e paralelas 2. Fibrócitos com núcleos extremamente alongados e muito afilados dispostos em fileiras entre as fibras colágenas espessas. 3. SFA escassa (imagem negativa) e localizada próxima aos fibrócitos. 4. Septos de tecido conjuntivo frouxo contendo capilares e células podem ser visualizadas unindo os feixes de fibras colágenas do tendão. A Lâmina pode conter músculo esquelético que não deve ser confundido com o conjuntivo denso ordenado de tendão. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 54 DESENHO: LÂMINA 21. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 55 Aula prática X – Tecido adiposo Lâmina 17: Corte de tecido adiposo unilocular. Coloração: HE. Nesta lâmina o tecido adiposo pode estar associado a músculo esquelético. Observe a morfologia do tecido adiposo: 1. Adipócito unilocular: possui grande e única gota de lipídio que preenche quase todo o seu citoplasma (imagem negativa da gordura extraída durante a preparação da lâmina). Possui citoplasma periférico muito fino (linha corada) e núcleo achatado na periferia. 2. Septos de tecido conjuntivo frouxo dividem o tecido adiposo em lóbulos. Os adipócitos são sustentados por fibras reticulares que não são visualizadas nesta coloração. DESENHO: LÂMINA 17. Lâmina 18: Corte de tecido adiposo multilocular. Coloração: HE O corte possui tecido adiposo multilocular associado a tecido adiposo unilocular e pode conter também músculo esquelético. Em grande aumento, observe a morfologia dos adipócitos multiloculares: 1. Possuem várias gotas lipidicas, em imagem negativa, em seu citoplasma.2. Núcleo ovóide, central ou ligeiramente excêntrico 3. Os adipócitos multiloculares são menores do que os uniloculares Fibras reticulares (não visualizadas na lâmina) também formam o estroma de sustentação das células neste tecido. Septos de tecido conjuntivo frouxo contendo vasos sanguíneos podem ser encontrados entre grupos de adipócitos multiloculares. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 56 DESENHO: LÂMINA 18. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 57 Aula prática XI – Tecido Cartilaginoso Lâmina 22: Corte transversal de traqueia. Coloração: HE Algumas lâminas podem apresentar cortes de esôfago e traqueia juntos. Identifique o corte de traqueia, macroscopicamente, por apresentar cavidade ampla, arredondada e intensa basofilia em sua parede devido aos anéis de cartilagem hialina. Em médio e grande aumentos, identifique os tecidos já estudados: 1. Epitélio de revestimento 2. Epitélio glandular (não é necessário classifica-lo) 3. Tecido conjuntivo Em médio e grande aumentos, identifique, abaixo do tecido conjuntivo, a cartilagem hialina pela sua basofilia. Observe que o tecido cartilaginoso é revestido por bainha conjuntiva, o pericôndrio. Em grande aumento, observe os componentes da cartilagem hialina (esquema abaixo): 1. Matriz cartilaginosa: basófila e de aspecto homogêneo. Esta matriz possui predominância de SFA, com glicosaminoglicanos sulfatados e ácido hialurônico que são responsáveis pela sua basofilia. Contém também fibras colágenas muito finas (colágeno do tipo II) que não são visualizados na lâmina. 2. Condrócitos: células arredondadas localizadas em lacunas e que sintetizam os componentes da matriz cartilaginosa. A lacuna é considerada artefato de microscopia óptica, pois, in vivo o condrócito preenche toda a lacuna. 3. Grupos isógenos: são ninhos de condrócitos que se originam por divisão mitótica de uma única célula e que representam o crescimento intersticial da cartilagem. 4. Matriz territorial: intensamente basófila, localizada ao redor dos condrócitos. Representa a matriz recém-sintetizada pelos condrócitos e que contém pouco colágeno e abundante SFA. 5. Matriz interterritorial: é a matriz mais afastada dos condrócitos que apresenta basofilia menos intensa. 6. Condroblastos: células cartilaginosas jovens e imaturas localizadas na periferia da cartilagem, próximas ao pericôndrio. Possuem forma elíptica, com núcleo vesiculoso. Os condroblastos originam-se de células indiferenciadas que se localizam no pericôndrio e representam o crescimento aposicional da cartilagem. 7. Pericôndrio: bainha de tecido conjuntivo denso ordenado que reveste a cartilagem. A matriz da cartilagem hialina é também: PAS-positiva devido a glicoproteínas neutras e metacromática devido aos glicosaminoglicanos ácidos sulfatados e carboxilados. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 58 DESENHO: LÂMINA 22. Lâmina 23: Corte de epiglote. Técnica de Verhoeff/contra-coloração: eosina. Identifique a cartilagem elástica por conter células em lacunas (condrócitos) envolvidas por matriz, em negro. Em médio e grande aumentos, observe: 1. Matriz cartilaginosa: em negro, devido à grande quantidade de fibras elásticas que foram coradas pelo método de Verhoeff. Contém também fibrilas colágenas finas (colágeno tipo II) e abundante SFA. 2. Condrócitos: retraídos no interior de lacunas e corados pela eosina. Grupos isógenos com poucos condrócitos podem, às vezes, ser visualizados. 3. Condroblastos: elípticos, com núcleo vesiculoso, na periferia da cartilagem. 4. Pericôndrio: tecido conjuntivo denso ordenado que reveste a cartilagem. Possui fibras colágenas espessas coradas pela eosina. Além de cartilagem elástica, o corte contém outros tecidos. Procure identificar e classificar os tecidos já estudados. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 59 DESENHO: LÂMINA 23. Lâmina 24: Corte de cartilagem fibrosa. Coloração: Tricrômico de Gomori. Este corte contém cartilagem fibrosa associada a tecido conjuntivo. A diferenciação entre os 2 tecidos é feita pela identificação de suas células: cartilagem fibrosa apresentando células arredondadas em lacunas (condrócitos) e tecido conjuntivo apresentando células de núcleos alongados (fibrócitos). Em médio e grande aumentos, observe os componentes da cartilagem fibrosa: 1. Condrócitos em lacunas com núcleos corados em vermelho dispondo-se em fileiras entre as fibras colágenas espessas da matriz. 2. Matriz cartilaginosa acidófila, corada pelo verde luz, contendo grande quantidade de fibras colágenas espessas (colágeno tipo I e tipo II), com disposição paralela. A SFA é escassa e se restringe às áreas ao redor dos condrócitos. A lâmina pode conter fibras colágenas coradas em vermelho ou mal coradas (artefato da técnica). A fibrocartilagem não contém condroblastos nem pericôndrio, mas está sempre associada ao tecido conjuntivo que a originou e que a nutre. Desta forma não há crescimento aposicional neste tecido, mas somente crescimento intersticial. Identifique e classifique o tecido conjuntivo associado a cartilagem fibrosa. DESENHO: LÂMINA 24. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 60 Aula prática XII – Tecido ósseo Lembretes: 1. Para estudo histológico o tecido ósseo é descalcificado por soluções ácidas diluídas ou por quelantes (EDTA) após fixação. 2. Deste modo, nas lâminas, observa-se somente parte orgânica da matriz e células do tecido ósseo. Lâmina 27: Corte longitudinal de osso chato (cabeça de feto). Coloração: HE. Em pequeno e médio aumentos, observe o tecido ósseo constituído de trabéculas ósseas onde se localizam osteócito envolvidos por material intercelular, a matriz óssea. Em grande aumento, observe os componentes do tecido ósseo (esquema abaixo): 1. Matriz óssea orgânica: acidófila devido a predominância de fibras colágenas espessas constituídas de colágeno tipo I. A matriz orgânica contém também outros elementos em menor quantidade e não visualizados na lâmina: glicosaminoglicanos, glicoproteínas neutras e proteínas. 2. Osteócitos: localizam-se em lacunas no interior da matriz óssea. 3. Osteoblastos: células cúbicas ou prismáticas baixas, em forma de chama, núcleo excêntrico e citoplasma basófilo que se dispõem nas superfícies em que está havendo formação óssea (osteoblastos ativos). Nas superfícies ósseas em repouso, os osteoblastos adquirem forma achatada com núcleo alongado (osteoblastos em repouso). Estes podem tornar-se novamente ativos e voltarem a sintetizar o osteóide (matriz orgânica recém-sintetizada). 4. Osteoclastos: células gigantes, multinucleadas, forma irregular e citoplasma acidófilo. Encontram-se nas superfícies ósseas onde esta havendo reabsorção óssea e na camada mais interna do periósteo próximo ao tecido ósseo. 5. Células osteogênicas: células mesenquimais pouco diferenciadas que originam os osteoblastos. Na microscopia óptica, as células osteogênicas têm características semelhantes às dos fibrócitos, com núcleo alongado e citoplasma escasso. São encontradas afastadas da superfície das trabéculas ósseas. Observe ainda: 1. endósteo: revestimento interno do tecido ósseo. É constituído de tecido conjuntivo frouxo contendo fibras colágenas finas associadas a osteoblastos ativos, osteoblastos em repouso, osteoclastos e células osteogênicas que envolvem as trabéculas ósseas. 2. periósteo: reveste externamente o tecido ósseo. É constituído de tecido conjuntivo denso ordenado rico em fibras colágenas na sua face mais externa. Na face interna voltada para o tecido ósseo, o periósteo é muito celular, contendo células que se diferenciam em osteoblastos. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 61 3. tecido mesenquimal: tecido pouco corado que preencheo espaço entre as trabéculas do tecido ósseo. Possui capilares sanguíneos, ás vezes com hemácias em seu interior, células mesenquimatosas e poucos elementos intercelulares fibrosos. 4. Tecido ósseo primário: o osso imaturo possui trabéculas ósseas com numerosos osteócitos dispostos irregularmente na matriz, muitos osteoblastos ativos, osteoclastos e tecido mesenquimal entre as trabéculas. DESENHO: LÂMINA 27. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 62 Aula prática XIII – Tecido nervoso – Neurônios Lâmina 33: Corte de medula e gânglio espinhal. Coloração T. Gomori. Corte de medula espinhal: Localize-o, macroscopicamente, pela forma de H (ou borboleta) da substância cinzenta (veja esquema abaixo). Em pequeno aumento, identifique (esquema, a seguir): 1. Substância cinzenta (central) em forma de H, apresentando corno anterior (mais globoso) e corno posterior (mais afilado) 2. Substância branca (por fora da substância cinzenta) 3. Canal medular ou epêndima, no centro da medula espinhal. Em médio e grande aumentos, identifique os componentes da substância cinzenta da medula espinhal: 1. Neurônio multipolar estrelado (esquemas abaixo): é mais evidente no corno anterior. Possui corpo celular de forma estrelada; núcleo grande, claro, vesiculoso, nucléolo bem desenvolvido e citoplasma com granulações basófilas devido a abundância de corpúsculos de Nissl. Em corte, não se observam todos os seus prolongamentos, mas somente a ramificação inicial de alguns dendritos. 2. Células da neuróglia: podem ser reconhecidas pelo aspecto de seus núcleos, conforme esquema abaixo: a. Núcleo de astrócito: é o maior entre as células da neuroglia, sendo, no entanto, bem menores que os núcleos dos neurônios. É arredondado, vesiculoso com cromatina fina. b. Núcleo de oligodendrócito: arredondado, vesiculoso, semelhante ao núcleo de astrócito sendo, no entanto, ligeiramente menor e com cromatina em grânulos mais grosseiros (mais corados) c. Núcleo de microgliócito: são pequenos, alongados e com cromatina densa. 3. Prolongamentos de neurônios (a maioria dendritos) e de células da glia: formam a trama que preenche o espaço entre os corpos celulares de neurônios e de células da neuroglia. 4. Células ependimárias: revestem o canal ependimário (ou raquidiano) formando um epitélio simples cúbico (neuroglia epitelial de revestimento). A substância branca é constituída de fibras nervosas mielínicas e de células da glia. Em grande aumento, identifique os componentes da fibra nervosa mielínica, em corte transversal: 1. Axônio: ponto corado central ou ligeiramente excêntrico 2. Bainha de mielina: em imagem negativa circundando o axônio, é de natureza lipoproteica, com predominância de lipídeos que são extraídos na preparação da lâmina. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 63 OBSERVE ainda os revestimentos de tecido conjuntivo (meninges) que envolvem a medula espinhal: 1. Pia-máter: revestimento mais interno aderido à medula, constituída por tecido conjuntivo frouxo que emite septos com vasos sanguíneos que penetram na substância branca. É a meninge mais preservada na lâmina. 2. Dura-máter: revestimento mais externo da medula espinhal, constituída de tecido conjuntivo denso ordenado. Não aparece em todas as laminas. 3. Aracnoide: localiza-se entre a pia-máter e a dura-máter, mas não é preservada nas lâminas. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 64 DESENHO: LÂMINA 33. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 65 Aula prática XIV – Tecido Muscular Lâmina 31: Corte de músculo estriado esquelético. Coloração: HE O músculo esquelético é constituído de células cilíndricas, multinucleadas (miônios) e envoltórios de tecido conjuntivo. No corte longitudinal, observe: 1. Fibras musculares esqueléticas: citoplasma acidófilo com grande quantidade de miofibrilas (feixes de filamentos finos e espessos). Cada fibra é constituída de única célula cilíndrica denominada miônio. 2. Núcleos dos miônios: numerosos, ovoides e periféricos (sincício) 3. Estriação transversal devido à organização dos filamentos finos e espessos DESENHO: LÂMINA 31. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 66 Lâmina 32: Corte de coração. Coloração: HE A parede do coração (miocárdio) é constituída por tecido muscular estriado cardíaco envolvido por tecido conjuntivo internamente e externamente. No corte longitudinal, observe (esquema abaixo): 1. Fibras musculares cardíacas (cardiomiócitos) acidófilas e ramificadas formando plexos 2. Estriação transversal 3. Estrias escalariformes (discos intercalares) unindo os cardiomiócitos (célula muscular cardíaca). Cada cardiomiócito possui 1 ou 2 núcleos centrais ou ligeiramente excêntricos. 4. Núcleos dos cardiomiócitos (1 - 2 por célula): são ovoides e com localização centrais ou ligeiramente excêntricos. DESENHO: LÂMINA 32. PROFESSOR: RONALDO PERES COSTA – 02/2016. 67 Lâmina 30: Corte de músculo liso. Coloração: HE No corte longitudinal, observe: 1. Fibras musculares lisas acidófilas. Cada fibra é formada por apenas uma célula pequena, fusiforme (leiomiócito) 2. Núcleo dos leiomiócitos: central e alongado 3. Ausência de estriação transversal DESENHO: LÂMINA 30.