Interpretação de Eletroforese de Proteínas

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Universidade de Pernambuco (UPE)
Medicina FCM
Pedro Guilherme Gouveia de Oliveira
Jefferson Jaylton de Santana
Atividade de Eletroforese de Proteínas
Docente: Tereza Cartaxo
MMF 2 – Bioquímica
RECIFE, 2023
Observe os gráficos abaixo e descreva os resultados observados associando com os
prováveis diagnósticos.
1.
As proteínas são macromoléculas compostas por aminoácidos e podem ser
classificadas em apolares ou polares neutras, ácidas ou básicas conforme a carga elétrica das
suas cadeias laterais. A Eletroforese de Proteínas no Soro (EPS) é um método laboratorial
para separar proteínas do plasma humano de acordo com suas cargas elétricas, sendo
amplamente utilizado para investigar anomalias proteicas no sangue. Os médicos devem
saber interpretar uma EPS para obter informações diagnósticas valiosas, já que as proteínas
que compõem o soro, quase em totalidade, são conhecidas e participam de diversos processos
fisiológicos. Em síntese, em uma corrida eletroforética normal, é esperada a migração das
proteínas em direção ao ânodo de acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular de
modo a formar 5 bandas (ou faixas), que compreendem 5 frações protéicas do plasma: a
albumina, as alfa-1-globulinas, as alfa-2-globulinas, as beta-globulinas e as gama-globulinas.
No gráfico em questão percebe-se um padrão diferente do convencional para a EPS
que demonstra a redução da albumina sérica, isto é, uma hipoalbuminemia, concomitante ao
aumento das alfa-1 e alfa-2 globulinas, caracterizando um perfil eletroforético conhecido
como “perfil das proteínas de fase aguda”.
A albumina é a proteína mais abundante do soro humano, é produzida exclusivamente
pelo fígado e desempenha diversas funções que variam desde transporte de substâncias à
manutenção da pressão osmótico do sangue, garantindo que não haja acúmulo excessivo de
líquidos nos tecidos. A hipoalbuminemia, que ocorre no perfil de EPS em questão, é
altamente inespecífica, não indicando necessariamente um comprometimento na sua
produção hepática, tal qual ocorre em quadros de cirroses hepáticas e hepatites, já que esse
quadro pode instalar-se, também, devido à perda dessa proteína de forma excessiva ou por via
patológica, como ocorre em hemorragias, na síndrome nefrótica e nas enteropatias perdedoras
de proteínas.
O aumento nos níveis séricos de alfa-1 e alfa-2 globulinas também chamam atenção
no padrão de EPS aqui referenciado. As alfa-1-globulinas compreendem um conjunto de
proteínas das quais se destacam a alfa-1-antitripsina; que corresponde a 90% da banda alfa-1
em padrão eletroforético normal e tem por função inibir proteases, em especial a elastina; a
protrombina; fator II da hemostasia secundária, cuja forma ativa está diretamente ligada à
conversão de fibrinogênio em fibrina; a transcortina, a globulina ligadora de tiroxina e a
alfa-fetoproteína. O aumento da faixa alfa-1 no perfil eletroforético da questão é indicativo
inespecífico de processos inflamatórios, infecciosos ou imunes.
As alfa-2-globulinas, por sua vez, são outro grupo de proteínas, mas que se
comportam de maneira semelhante às alfa-1-globulinas no que diz respeito ao aumento da
concentração sérica diante processos infecciosos, inflamatórios ou imunes, de maneira
inespecífica, o que configura as proteínas de ambas as faixas como proteínas de fase aguda,
que dá nome ao perfil da EPS abordado pela questão. Dentre as proteínas que compõem a
faixa alfa-2 é possível destacar a haptoglobina e a alfa-2-macroglobulina, que correspondem
à maior parte das proteínas presentes nessa banda. Enquanto a alfa-2-macroglobulina atua
como inibidor de diversas proteases, regulando processos proteolíticos no sangue, a
haptoglobina liga-se à hemoglobina livre circulante no plasma, em geral decorrente da
hemólise, para que esse complexo possa ser retirado da circulação, evitando lesões teciduais e
perda de ferro. Compõem a faixa alfa-2, também, a ceruloplasmina, a eritropoetina, a
colinesterase e algumas outras.
O perfil da EPS evidenciado, ou seja, a hipoalbuminemia e o aumento das alfa-1 e
alfa-2 globulinas é um achado laboratorial inespecífico que sugere, basicamente, uma
inflamação, infecção e/ou resposta imune que afete a síntese, o metabolismo e/ou a excreção
da albumina. Essas alterações podem ser observadas em uma variedade de condições clínicas,
o que torna esse perfil bioquímico não diagnóstico por si só. Por isso, é essencial realizar uma
avaliação clínica abrangente para determinar a causa específica para o perfil eletroforético do
paciente. Algumas das condições sugestivas do quadro evidenciado por esse perfil são:
cirrose hepática, hepatite crônica, doenças autoimunes, infecções crônicas, neoplasias,
síndrome nefrótica, glomerulonefrite, queimaduras graves etc.
2.
A questão evidencia a comparação entre um perfil normal de eletroforese de proteínas
séricas e o perfil encontrado em um paciente com mieloma múltiplo, sendo destacado o pico
M na região das gama-globulinas, além de fornecer dados, também, sobre o perfil
eletroforético de urina de um paciente com referida patologia.
O mieloma múltiplo (MM) é uma gamopatia monoclonal que consiste, basicamente,
na proliferação anormal de plasmócitos neoplásicos, provocando a produção excessiva de
imunoglobulinas monoclonais e de fragmentos delas. As imunoglobulinas, também chamadas
de anticorpos, são glicoproteínas produzidas pelo sistema imunológico em resposta à
presença de antígenos, como bactérias, vírus, toxinas e outros agentes estranhos ao corpo.
Elas podem ser classificadas, dentre outras maneiras, em monoclonais ou policlonais de
acordo com a origem e a especificidade dessas proteínas. Os anticorpos monoclonais,
diferentemente dos policlonais, são produzidos por um único clone plasmocitário que se
divide muito rapidamente e produz grande quantidade dessas imunoglobulinas, que são
idênticas entre si e, portanto, são altamente específicas para a mesma região alvo (epítopo) do
mesmo antígeno.
Na eletroforese de proteínas, as imunoglobulinas monoclonais e seus fragmentos
aparecem como um pico anormal na fração gama, faixa para qual os anticorpos, em geral,
migram. Esse pico é conhecido como pico M, ou pico monoclonal, e é indicativo da presença
de uma imunoglobulina monoclonal específica e diferenciável, já que os diferentes tipos de
anticorpos (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE) migram diferencialmente na banda gama devido às
suas características físico-químicas. Nesse sentido, é importante perceber que a posição desse
pico no gráfico do densitômetro (que forma os perfis eletroforéticos) pode variar de acordo
com o tipo de imunoglobulina produzida em excesso, de forma que havendo produção
excessiva de IgA, o pico monoclonal estaria situado mais próximo à faixa beta da
eletroforese, que não seria o caso de um pico monoclonal de IgG, por exemplo. Esse pico,
entretanto, não é característica apenas do mieloma múltiplo, mas sim das gamopatias
monoclonais como um todo e se trata do aumento homogêneo e fusiforme da fração gama,
que gera, no perfil eletroforético, uma curva de base estreita devido ao fato de que todos os
anticorpos monoclonais - nessa condição, produzidos em excesso - possuem a mesma
mobilidade eletroforética.
Em algumas gamopatias monoclonais, principalmente nos casos em que as cadeias
leves das imunoglobulinas são produzidas em excesso, esses anticorpos e seus fragmentos
podem ser filtrados pelos glomérulos renais devido ao seu tamanho relativamente pequeno
em comparação com outras proteínas maiores, o que permite detecção deles não só no soro
sanguíneo, mas também na urina (como indicado na figura 2). Os glomérulos renais possuem
poros fenestrados que permitem a passagem de substâncias até certo tamanho, mas vale notar
que, em condições normais, os glomérulos filtram pequenas quantidades de proteínas,
incluindo anticorpos, que são então reabsorvidas pelos túbulos renais proximais. No entanto,
em condições em há uma produção aumentada de proteínas, que é o caso dos anticorpos
monoclonais no mieloma múltiplo, a filtraçãoe reabsorção podem ser afetadas, levando à
perda excessiva dessas proteínas na urina.
O perfil de eletroforese B evidenciado pela figura 1 é, assim como destacado pela
questão, de um paciente com mieloma múltiplo. Contudo, um pico M isolado não é
diagnóstico por si só e seu achado sugere a necessidade de investigação adicional para
determinar a causa subjacente. Outras condições em que o pico monoclonal costuma ser
encontrado na EPS são: a gamopatia monoclonal de significado indeterminado, a
macroglobulinemia de Waldenstrom, a amiloidose e a síndrome de POEMS. A
interpretação do pico M na eletroforese de proteínas séricas deve ser feita em conjunto com
outros resultados de exames clínicos e laboratoriais, além da avaliação clínica do paciente por
um médico especializado.
3.
A condição evidenciada por esse perfil de eletroforese de proteínas séricas é a
hipogamaglobulinemia ou agamaglobulinemia. Essa condição é caracterizada por uma
redução expressiva na concentração das gamaglobulinas (imunoglobulinas) séricas, sem
alteração importante nas outras faixas de eletroforese. Nesses casos, o paciente fica mais
suscetível a infecções, haja vista que essas proteínas desempenham papel crucial na resposta
imune humoral. Sob esse viés, vale reiterar que as imunoglobulinas são glicoproteínas de
origem plasmocitária que identificam e medeiam a neutralização e a destruição de patógenos,
além de serem essenciais para formação da memória imunológica, sendo o IgG, o IgA, o
IgM, o IgD e o IgE as principais imunoglobulinas.
A hipogamaglobulinemia pode ser primária ou secundária, a depender de sua causa,
de forma que a primária é a condição em que a deficiência das gamaglobulinas é causada por
distúrbios genéticos, herdados ou aleatórios, que comprometem a síntese dos anticorpos,
enquanto a secundária, como o nome sugere, decorre de uma causa subjacente, podendo essa
ser outra condição patológica ou mesmo um tratamento.
A imunodeficiência comum variável — caracterizada por níveis muito reduzidos de
anticorpos apesar do número normal de linfócitos B — e a agamaglobulinemia ligada ao
cromossomo X — condição em que uma mutação em um gene do cromossomo X resulta na
ausência de linfócitos B e, consequentemente, de anticorpos — são hipogamaglobulinemias
primárias.. Por outro lado, a hipogamaglobulinemia secundária pode decorrer de doenças
crônicas, como ocorre na leucemia linfocítica e no mieloma múltiplo, sendo que neste caso a
proliferação de plasmócitos neoplásicos, que produzem anticorpos monoclonais
indiscriminadamente, leva à redução das outras formas de imunoglobulina. Além disso, o
perfil de EPS em questão também é comum em pacientes submetidos a tratamentos
imunossupressores, que é o caso dos que realizam quimioterapia, e em algumas infecções,
por exemplo pelo vírus HIV.
Alguns sintomas são comuns aos diversos tipos de hipogamaglobulinemias e
frequentemente são infecções frequentes e recorrentes, pouca ou nenhuma resposta à
vacinação e, em casos mais severos, desenvolvimento de doenças autoimunes. Para realizar o
diagnóstico de hipogamaglobulinemia, além do estabelecimento da história clínica e da
realização de um exame físico de qualidade, a eletroforese e outros exames laboratoriais, em
especial os que avaliam a concentração plasmática de anticorpos e células de defesa podem
ser feitos e, havendo suspeita de causa hereditária, testes genéticos podem ser solicitadas. O
tratamento, de forma geral, é a reposição de gamaglobulinas e o tratamento das causas dessa
condição, quando ela é secundária. Pode haver ainda a administração de antibióticos para
tratar as infecções bacterianas decorrentes da imunidade prejudicada.
4. Cite e explique pelo menos duas aplicações da eletroforese capilar com identificação
de bases no DNA.
A eletroforese capilar é uma técnica analítica que separa espécies carregadas com
base em suas diferentes mobilidades eletroforéticas. Ela é realizada em um pequeno capilar
preenchido com uma solução de eletrólitos, permitindo a separação de moléculas de DNA,
RNA ou proteínas de acordo com seu tamanho e carga elétrica. Essa técnica é amplamente
utilizada em diagnósticos clínicos, pesquisa científica e desenvolvimento de tratamentos
personalizados. Por meio da eletroforese capilar, é possível identificar doenças genéticas,
sequenciar o DNA e obter informações valiosas para a área da genética molecular. A seguir
será explicado de maneira mais detalhada como essa técnica pode ser aplicada.
Sequenciamento de DNA
O sequenciamento de DNA desempenha um papel fundamental na biologia molecular,
permitindo a análise precisa da ordem dos nucleotídeos em um fragmento de DNA. Essa
informação é essencial para compreender genes, mutações e variações genéticas associadas a
doenças, características hereditárias e evolução. Um método amplamente utilizado para
sequenciar DNA é a eletroforese capilar, especialmente no método de sequenciamento de
Sanger, que é conhecido por sua precisão e confiabilidade.
Para realizar a técnica, primeiro o DNA de interesse é isolado e fragmentado. Cada
fragmento é então amplificado utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). Durante a
amplificação, são adicionados didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com corantes
fluorescentes. Esses ddNTPs terminam a extensão do DNA quando incorporados, criando
uma série de fragmentos de diferentes comprimentos, cada um terminando com um
nucleotídeo específico marcado com fluorescência (A, T, C ou G). Os fragmentos resultantes
são inseridos em um capilar cheio de um gel polimérico e separados por eletroforese. Uma
corrente elétrica é aplicada, fazendo com que os fragmentos migrem pelo capilar de acordo
com seu tamanho – fragmentos menores se movem mais rápido que os maiores. À medida
que os fragmentos passam por um detector no final do capilar, os corantes fluorescentes são
excitados por um laser, e a emissão de luz é detectada e registrada. Isso gera um
eletroferograma, um gráfico que mostra picos correspondentes a cada nucleotídeo terminal
dos fragmentos de DNA. A sequência de DNA é determinada pela ordem dos picos no
eletroferograma. Programas de computador convertem os dados do eletroferograma na
sequência de nucleotídeos, permitindo a leitura precisa do DNA.
Em síntese, o sequenciamento de DNA é um processo bioquímico que determina a
ordem dos nucleotídeos (adenina, guanina, citosina e timina) em uma amostra de DNA. Essa
técnica é essencial para identificar novos genes, estudar variações genéticas e compreender
funções genéticas. Além disso, no diagnóstico clínico, o sequenciamento de DNA ajuda a
identificar mutações responsáveis por doenças genéticas, permitindo tratamento
personalizado. Na biotecnologia, ele é usado para modificar organismos, produzindo
proteínas recombinantes e outros produtos biotecnológicos.
Detecção de Doenças Genéticas
A detecção de doenças genéticas é fundamental para diagnósticos precisos,
aconselhamento genético e criação de tratamentos personalizados. Muitas dessas doenças
surgem de mutações específicas que podem ser identificadas por meio de variações no DNA.
A técnica de eletroforese capilar possibilita a detecção dessas mutações, incluindo
substituições de nucleotídeos, inserções, deleções e expansões de repetições.
A extração de DNA é um procedimento realizado a partir de amostras biológicas do
paciente, como sangue ou saliva. Durante esse processo, os genes ou regiões específicas de
interesse no DNA são amplificados usando primers específicos. Em alguns casos,
concentramos nossa atenção em regiões conhecidas por abrigar mutações patogênicas. Após a
amplificação, os produtos da reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) são
carregados em um capilar de eletroforese. Nesse ponto, os fragmentos de DNA são separados
com base no tamanho e na carga, migrando pelo capilar a diferentes velocidades. À medida
que os fragmentos de DNA, marcados com fluorescência, passam pelo detector, um laser os
excita e a emissão é registrada, gerando um eletroferograma. Essas variações nos fragmentosde DNA são então analisadas para identificar mutações genéticas, como inserções, deleções
ou repetições expandidas. A presença, ausência ou alteração no tamanho dos fragmentos pode
indicar essas mutações.
A eletroforese capilar é uma técnica laboratorial que possibilita o diagnóstico de
doenças hereditárias ao identificar mutações associadas a condições como fibrose cística,
doença de Huntington e síndrome do X frágil. No aconselhamento genético, a detecção de
portadores de mutações recessivas fornece informações cruciais sobre os riscos genéticos
para as futuras gerações. Além disso, na medicina personalizada, a identificação dessas
mutações pode orientar tratamentos específicos, permitindo terapias mais eficazes e
adaptadas a cada paciente.
REFERÊNCIAS
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