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TÍTULO DA AULA COLETA DE SWAB – CULTIVO DE BACTÉRIAS Bruno Dierk Charnik Kleberson Camargo Marcos Ludo Mateus Vieira Stephany G Santos 1. INTRODUÇÃO As bactérias podem ser cultivadas em meio de cultura líquido e em meio de cultura sólido. As culturas obtidas em meio líquido são empregadas em procedimentos de análise de crescimento, isolamento de proteínas, isolamento de DNA, e de demais substâncias produzidas por bactérias. Quando as bactérias são cultivadas em meio de cultura sólido distribuído em placa de Petri, podem ser observadas colônias onde uma única bactéria foi semeada, o que permite fazer o isolamento, identificação e contagem desses microrganismos. As bactérias podem apresentam colônias arredondadas que podem ter ou não coloração, ser ou não brilhantes, mas a maioria, quando cultivadas em meio solido, apresenta colônias que não permitem distinção entre as bactérias. Por esta razão veremos logo a seguir que os bacteriologistas empregam meios de cultura que contêm corantes, os chamados meios de cultura diferenciais, que permitem o desenvolvimento de colônias bacterianas coloridas e, assim, por simples observação visual é possível uma parcial identificação previa da bactéria. Nessa aula não realizaremos identificação de espécies bacterianas, apenas analisaremos as colônias num contexto geral. Para isso, será utilizado o meio Ágar Nutriente que é composto por triptona e extrato PREENCHIDO PELO LAB LAB BLC Bruno Dierk PREENCHIDO PELO PROFESSOR DATA AULAS DOBRADA ESP. SEM MATERIAIS DIA MÊS ANO 1 2 3 4 SIM NÃO SIM NÃO 12 03 24 X X x 13 03 24 x x 15 03 24 x x PROFESSOR CURSO PERIODO TURNO ALUNOS QTIDADE Jaqueline vaz Med Vet 3 Noite 25 de carne, fonte de carboidratos, proteínas e lipídios, um meio não seletivo onde crescem diversas bactérias e microrganismos não fastidiosos e fastidiosos, muito utilizado para para avaliar contaminações microbiológicas do ar, superfícies e fluídos. 2. OBJETIVOS ● Conhecer os materiais utilizados para um processo de inoculação e cultivo de microrganismos: Placa de Petri, alças de inoculação de platina e descartáveis, alça de Drigalski, câmara de fluxo, bico de Bunsen e meios de cultivo. ● Primeiro contato para semeadura de placa com tinta em placa, testando o método de semeadura por estrias continuas e descontínuas. ● Fazer o cultivo de bactérias em placa de Petri, através da coleta com Swab, fazendo inoculação pelo método de esgotamento por estrias. ● Após 7 dias visualizar o crescimento de bactérias, e possíveis fungos, sobre a placa, analisando a morfologia macroscópica bacteriana. 2. REAGENTES E SOLUÇÕES. (Caso não seja necessário deixar em branco). ● Lista de Reagentes e Soluções (TOTAL NECESSÁRIO PARA 1 GRUPO UTILIZAR). ● Para reagentes químicos as unidades N, mmol, M, devem SEMPRE estar em mol/L. REAGENTE VOLUME (ml) 3. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS ● Lista de Equipamentos, materiais e vidrarias (TOTAL NECESSÁRIO PARA 1 GRUPO UTILIZAR). EQUIPAMENTO/MATERIAL/VIDRARIA QTIDADE 1 swabs para coleta 4 por grupo* Flaconete soro fisiológico estéril 10ml 1 por grup Placas de Petri descartáveis com meio Ágar nutriente** 3 por grupo* Alcool 70% 1 frasco por grupo Alças de Drigalski descartáveis (formato L) 1 por grupo (total 10) Pipetas Pasteur Descartéveis 3 mL 2 por grupo Béqueres 50 mL 1 Bico de Bunsen 1 BOD/ estufa 25ºC 1 Alça de inoculação esteril 1 por grupo Alça de inoculação de platina 1 por grupo (ou o que tiver) 1 pote de tinta guache Pra sala 1 pote do meio de ágar nutriente 1 pra sala para mostrar a embalagem Bico de bunsen Caixa de fosforo *10 grupos ** caso não tenha o meio ágar nutriente preciso de algum outro meio não seletivo que permta o crescimento de bactérias. 4. TÉCNICA / PROCEDIMENTO ● 4.1. DIVISÃO EM GRUPOS Os alunos deverão se organizar em trios nas bancadas, com o roteiro e caneta em mãos ● 4.2. ASSEPSIA e ORGANIZAÇÃO DE MATERIAIS Os alunos deverão fazer assepsia das mãos com álcool 70%. Após, cada grupo deverá checar se todos os materiais aqui listados. ● 4.3. OBSERVAR SEMEADURA EM SUPERFÍCIE Após explicação, a professora demonstrará como deverá ser feita a coleta com o Swab, fazendo semeadura da amostra em superfície na placa, com auxílio de pipeta e alça de Drigalski. - 1 mL da solução salina do frasco com o Swab será coletado com auxílio da pipeta Pasteur Estéril e será adicionada sobre a placa contendo o meio. - com auxilio da alça de Drigalski, essa solução será espalhada por toda a superfície da placa. - essa placa será incubada pelo período de 7 dias na temperatura de 25º C. - após esse período será visualizado o crescimento microbiano. ● 4.4. COLETA DE SWAB E ESGOTAMENTO POR ESTRIAS - com as mãos higienizadas e o swab e a solução estéril fechados em mãos, irão se deslocar pela faculdade até o local que desejarem fazer a coleta do material. - no local escolhido, será aberta as embalagens. Segurando o swab pela extremidade, será primeiro umedecido a ponta do swab na solução salina. Após, deverá ser feita a coleta do material. Para isso o swab deverá ser passada algumas vezes sobre a superfície escolhida. - O swab deverá ser colocado dentro do tubo e a ponta que foi utilizada para segura-lo será quebrada, para que assim o tubo possa ser fechado com o swab dentro. - Os alunos deverão voltar ao laboratório e fazer novamente a assepsia das mãos com álcool 70%. Nesse momento deverá ser anotado as iniciais, símbolo, ou algo que faça referência ao grupo, data e o local que foi coletado, na extremidade e face inferior da placa, conforme a professora demonstrará. - o béquer poderá ser usado para apoiar o tubo com o swab e facilitar no momento da inoculação ao manter esse de pé. - A placa deverá ser aberta com o uso de apenas uma mão, para que a tampa não tenha contato com bancadas, e o tubo do swab também será aberto. Assim será feita a semeadura pela técnica de esgotamento por estrias contínuas. Para isso repita os movimentos descritos a baixo com o swab sobre a placa: - Feita as estrias, a placa deverá ser rapidamente fechada, assim como o swab devovido para dentro do tubo e este fechado. - essa placa será incubada na temperatura de 25º C em estufa. - Ao final de 7 dias será observado o crescimento das bactérias, e possíveis fungos, sobre a placa. O resultado do crescimento deverá ser fotografado e adicionado ao item 4 que deverá ser entregue para avaliação. - Os swabs, soros e luvas deverão ser descartados no LIXO CONTAMINANTE 5. CONFECÇÃO DE RELATÓRIO Na primeira parte do relatório insira as fotos de todos os utensílios e materiais observados e utilizados nessa primeira aula prática, indicando seus nomes e suas respetivas funções para o trabalho do microbiologista. Em seguida adicione as fotos dos estriamentos realizados com tinta sobre as placas de petri, escreva o nome de cada uma dessas técnicas e as diferencie com relação a eficiência de esgotamento do material coletado sobre cada uma. Após uma semana iremos realizar a observação dos microrganismos crescidos sobre a placa. Após isso faça um relatório incluindo fotos tiradas desse crescimento, descrevendo o local de coleta da amostra e indicado na imagem onde estão localizadas as colônias bacterianas, e fúngicas, caso houver. Descreva o que é uma colônia e cite a importância dessa prática envolvendo o cultivo de bactérias dentro da profissão do Médico Veterinário. Esse relatório deverá ser anexao no class juntamente na atividade onde foi anexada esse relatório, apenas por 1 aluno do grupo, no prazo de uma semana após a visualização do crescimentobacteriano em aula prática, como parte da nota dos alunos do grupo. Lembre-se de colocar em ordem alfabética o nome dos alunos do grupo! 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CRUZ, L. C. H. Micologia veterinária. Rio de Janeiro: Revinter, 2010. HIRSH, D. C.; ZEE, Y. C. Microbiologia veterinária. Tradução de Adriana de Souza Coutinho. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2012. OPLUSTIL CP, ZOCCOLI CM, TOBOUTI NR, SINTO SI. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 2ª edição. São Paulo - SP: Editora Sarvier, 2004 SILVA N, JUNQUEIRA V, SILVEIRA NFA, TANIWAKI MH, SANTOS RFS, GOMES RAR. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. 4ª ed. São Paulo: Varela; 2010. TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. Alça de inoculação: Ela é usada para manipular as amostras bacterianas e outros microrganismos em meio liquido ou gelificado, sem que haja contato direto com o microbiologista, podendo a alça ser reutilizável e esterilizada na chama azul ou descartável Soro fisiológico: umidificar o swabs para melhor fixação do material Swabs: coleta de material Alça de Drigalski: Usada para espalhar suspensões de microrganismos na Placa de Petri contendo meio de cultura sólido. São utilizadas para exame dos microrganismos em microscópio óptico. Placa de Petri: As placas de Petri são usadas para um amplo range de aplicações em microbiologia, incluindo o cultivo bacteriano, o teste de antibióticos e a detecção de micróbios em alimentos. Elas também são úteis na preparação de meios de cultura bacteriana, que são soluções nutritivas utilizadas para cultivar bactérias in vitro. Esgotamento por estrias continuas: Visa diminuir a população microbiana por meio do esgotamento do swab na placa de petri Esgotamento por estria descontinuas: Visa diminuir a população microbiana por meio do desgaste do material até seu isolamento, ou seja formação de colônias separadas A coleta foi realizada em um interruptor de luz da Campo Real Descreva o que é uma colônia e cite a importância dessa prática envolvendo o cultivo de bactérias dentro da profissão do Médico Veterinário. A colônia forma-se através da multiplicação do microorganismo seja em meio ambiente ou em meio de cultivo artificial, sendo ela uma unidade estrutural de bactérias ou fungos É de extrema importância seu cultivo, pois é através deles que é realizado o diagnostico do paciente e além disso, é essencial para desenvolver medicamentos que funcionem contra esses patógenos.