Introdução à Bioquímica Clínica - TEMA 1 - MÓDULO 2

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Ao avaliar o gráfico apresentado, podemos ver que a partir do dia 13 todos os pontos estiveram abaixo
da média de referência, indicando uma perda de exatidão. A exatidão avalia o quão próximos da média
de referência os pontos estão, enquanto a precisão avalia o quão próximo um ponto está do outro,
desconsiderando o valor médio de referência.
MÓDULO 2
 Distinguir os diferentes métodos analíticos utilizados em bioquímica clínica, assim como a
função e a aplicabilidade dos métodos analíticos abordados na prática laboratorial
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ANALÍTICOS DE
BIOQUÍMICA CLÍNICA
Conforme vimos no módulo anterior, os laboratórios de análises clínicas (incluindo o setor de bioquímica
clínica) estão cada vez mais automatizados e tecnológicos. Apesar disso, o conhecimento dos princípios
básicos dos diferentes métodos empregados continua sendo fundamental, pois em alguns casos será o
alicerce para nortear a interpretação dos resultados de forma segura.
Foto: Shutterstock.com
 Automação nos laboratórios de bioquímica.
Com base nisso, vamos relembrar algumas questões físicas e químicas, explorar os métodos analíticos
e correlacioná-los com os testes mais utilizados dentro do laboratório de bioquímica clínica atualmente.
É importante ressaltar que os testes, de maneira geral, podem ser classificados em:
Classificação Característica Exemplos
Qualitativos
Definem se o resultado da amostra é
positivo ou negativo.
Detecção de glicose na
urina.
Quantitativos Têm como resultado valores/números.
Dosagem de ferro no
sangue.
Semiquantitativos
Quando a intensidade da positividade
reflete em uma grandeza.
Dosagem de anticorpos com
base na titulação.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Dentre as principais técnicas utilizadas nos laboratórios de bioquímica clínica, podemos destacar a
espectrofotometria, a colorimetria, a turbidimetria, a nefelometria e a eletroforese. Ao longo do módulo,
vamos ver cada uma dessas técnicas e suas aplicações.
MÉTODOS FOTOMÉTRICOS
Diversas técnicas utilizadas em métodos quantitativos possuem como princípio base a fotometria, que
consiste na medição de parâmetros da luz correlacionados à emissão, dispersão, absorção, transmissão
e reflexão.
Imagem: Shutterstock.com
 Fenômenos da luz.
Para começarmos a entender como funcionam as técnicas, precisamos relembrar alguns conceitos.
VOCÊ LEMBRA O QUE SÃO TRANSMITÂNCIA E
ABSORBÂNCIA?
Escreva aqui sua resposta
A luz, ao incidir no objeto, pode percorrer três caminhos diferentes: a absorção, a reflexão e a
transmissão.
Imagem: Shutterstock.com
Resumidamente, temos a seguinte fórmula:
Vamos imaginar duas situações: na primeira, há uma luz passando por uma cubeta com uma solução
incolor; e na segunda há a mesma luz, de igual intensidade, passando por uma cubeta igual, porém com
uma solução azul.
Será que a intensidade de luz transmitida detectada será igual à intensidade de luz incidente? Ou será
que a intensidade de luz transmitida que foi detectada no caso da solução incolor será a mesma
intensidade de luz transmitida detectada com a solução azul?
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
 Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes características.
Pelo esquema anterior, podemos observar que a intensidade de luz incidente é maior do que a
intensidade de luz transmitida detectada em ambos os casos. Além disso, a intensidade de luz detectada
após a cubeta com a solução incolor é maior do que a intensidade de luz detectada após a cubeta com a
solução azul.
Mas por que isso acontece?
Ao longo do caminho óptico, ao passar pela cubeta, há a absorção da radiação luminosa, diminuindo
progressivamente a sua intensidade. Logo, a intensidade de luz detectada (I) será menor que a
intensidade de luz incidente (Ii). A relação entre essas duas medidas é o que chamamos de
Transmitância (T).
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
A transmitância muitas vezes é apresentada em percentual, o que acaba gerando um resultado relativo.
Então, para facilitar a comparação dos resultados obtidos, utilizamos a Absorbância (A), que
matematicamente é o logaritmo negativo da transmitância:
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Além disso, podemos afirmar que a diferença encontrada entre as intensidades de luz que incide e a
intensidade de luz que é detectada após a cubeta se deve a três principais fatores:
T = I
Ii
A = −log T   =   − log    =   log  I
Ii
Ii
I
Absortividade constante que depende do comprimento de onda;
Espessura da solução atravessada pela luz (cubeta);
Concentração da solução.
Com isso, fica estabelecido que a quantidade de intensidade de luz detectada diminui exponencialmente
em algumas situações, como:
Ao aumentar a espessura da cubeta com a solução, constituindo o que conhecemos como Lei de
Lambert.
Ao aumentar a concentração ou intensidade de cor da solução, constituindo o que conhecemos
como Lei de Beer.
LEI DE LAMBERT
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
 Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes tamanhos de cubeta.
LEI DE BEER
javascript:void(0)
javascript:void(0)
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
 Comparação da intensidade de luz detectada em soluções com diferentes
concentrações/intensidade de cor.
Normalmente, o comprimento de onda é constante, a espessura da cubeta com a solução também é
considerada constante se utilizarmos a mesma cubeta (o que normalmente acontece nos laboratórios de
bioquímica clínica). Logo, o que muda de uma situação para a outra é a concentração da solução, que
justamente é o alvo dos nossos testes laboratoriais.
Com isso, a Lei de Lambert-Beer estabelece que a concentração da substância em solução é
diretamente proporcional à intensidade de luz absorvida, matematicamente representada por:
Em que:
a é a absortividade constante que depende do comprimento de onda;
b é a espessura da solução atravessada pela luz;
c é a concentração da solução.
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
A = abc
Entre a transmitância e a absorbância, acabamos utilizando mais a absorbância por possuir uma relação
linear com a concentração de uma substância absorvente em solução.
 Relação Absorbância e % Transmitância.
Fotometria e Padronização, José Carlos Basques, 2010, pág. 9.
IMPORTÂNCIA DA LEI DE LAMBERT-BEER
PARA AS DOSAGENS BIOQUÍMICAS.
Neste vídeo, a especialista Jéssica Ribeiro Lima fala sobre a importância da lei de Lambert-Beer e os
conceitos de absorbância e transmitância para as dosagens em bioquímica clínica.
Vamos a um exemplo prático?
Com base nesses conceitos apresentados, como você acha que poderíamos utilizá-los na prática
laboratorial?
Iniciamos com uma referência para que o teste possa ser quantitativo. Para isso, teríamos que partir de
soluções com concentrações conhecidas, para que pudéssemos montar uma curva padrão. Vamos
montar um experimento juntos?
Vamos supor que gostaríamos de dosar a substância “F” nas amostras de três pacientes.
CURVA PADRÃO
É o conjunto de valores utilizados como referência para o teste a ser realizado.
PASSO 1
Para começar, precisamos fazer uma diluição seriada da substância “F” padrão que temos em nosso
laboratório. No nosso caso, diluímos em 11 amostras padrão. Após a diluição, precisamos incubar as
amostras padrão diluídas com o reagente, que irá gerar uma mudança de cor ao reagir com a
substância “F”.
PASSO 2
Precisamos também fazer uma cubeta com o reagente e sem nenhuma amostra, esse será o nosso
branco, que serve para setar o aparelho; ou seja, indica ao aparelho quanto da intensidade de luz é
refletida pela cubeta e quanto é absorvida somente pelo reagente. O valor gerado deverá ser
descontado das medições das amostras padrão e das amostras de interesse. Na maioria dos aparelhos,
esse desconto do valor encontrado no brancoocorre pela setagem para as medições seguintes, não
sendo necessário fazer nenhum cálculo adicional nos resultados obtidos.
javascript:void(0)
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
 Esquema das amostras para realização da setagem do aparelho e curva padrão.
PASSO 3
Após o tempo necessário de incubação para a reação do teste, vamos realizar a leitura das amostras
padrão em um aparelho que emite uma intensidade de luz, que cruza a cubeta e detecta a intensidade
de luz que não foi absorvida nem dispersada.
PASSO 4
Para estabelecer uma correlação entre as concentrações conhecidas e a absorbância, montamos um
quadro conforme o exemplo a seguir:
Padrão Absorbância (595 nm) Concentração (µg/mL)
1 0,01 1
2 0,02 2
3 0,05 5
4 0,1 10
5 0,2 20
6 0,5 50
7 0,7 70
8 0,8 80
9 1,1 100
10 1,1 120
11 1,1 130
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
 Valores de absorbância comprimento de onda de 595 nm das soluções com concentrações
conhecidas.
Elaborado por Fabiana Vieira de Mello
PASSO 5
Com bases nas anotações, vamos plotar em um gráfico os resultados:
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
PASSO 6
Vamos calcular a equação da reta:
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
PASSO 7
Vamos incubar as amostras dos pacientes e realizar a leitura conforme fizemos com as amostras
padrão.
PASSO 8
Vamos anotar os valores de absorbância das amostras para calcularmos as concentrações da
substância “F” em cada uma das amostras.
Amostra Absorbância (595 nm) Concentração (µg/mL)
Paciente 1 0,6 ???
Paciente 2 0,35 ???
Paciente 3 0,72 ???
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
 Valores de absorbância comprimento de onda de 595 nm das soluções com concentrações
conhecidas.
Elaborado por Fabiana Vieira de Mello
PASSO 9
Com a equação da reta, calculamos as concentrações das amostras dos pacientes:
Equação:
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Em que: y = Absorbância; x = concentração da substância “F”.
Então:
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Vamos calcular por paciente?
Paciente 1: Absorbância: 0,6 nm a 595 nm
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Paciente 2: Absorbância: 0,35 nm a 595 nm
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Paciente 3: Absorbância: 0,72 nm a 595 nm
 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal
Amostra Absorbância (595 nm) Concentração (µg/mL)
Paciente 1 0,6 65,35
Paciente 2 0,35 35,47
Paciente 3 0,72 75,26
y = 0, 0093x + 0, 0201
Absorbância  =  0, 0093 (concentração)  +  0, 0201
0, 0093 (concentração)  =  Absorbância  −  0, 0201
Concentração  =   Absorbância−0,0201
0,0093
Concentração  =   0,6 − 0,0201
0,0093
Concentração  =  62, 35 µg/mL 
Concentração  =   0,35 − 0,0201
0,0093
Concentração = 35, 47 µg/mL
Concentração = 0,72 − 0,0201
0,0093
Concentração = 75, 26 µg/mL
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
PASSO 10
Plotamos no gráfico da curva padrão (pontos em vermelho):
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
PASSO 11
Conseguimos então calcular as concentrações da substância “F” nas amostras dos pacientes. E, ao
observar o gráfico, verificamos que tais dosagens estão dentro da margem segura da dosagem.
 ATENÇÃO
Você observou que as amostras padrão 9, 10 e 11 tiveram a mesma absorbância, mesmo tendo
concentrações diferentes da substância “F”? Pois é, isso se deve ao “platô” de saturação.
Independentemente da concentração, a partir da concentração da amostra padrão 9, o ponto máximo de
absorbância já foi detectado. Caso a dosagem da amostra do paciente caia próxima ao “platô”, é
importante repetir a dosagem diluindo a amostra do paciente, para que a dosagem caia no intervalo
seguro da curva padrão.
Com esse exemplo que construímos juntos ficou mais fácil de vermos a aplicação dessas propriedades,
não foi? E é assim que os exames que utilizam métodos fotométricos são realizados dentro do
laboratório clínico.
Claro que todos esses cálculos já são automatizados pelos softwares dos equipamentos e toda a
logística é facilitada, com utilização de kits em muitas situações. Mas se for necessário realizar um
exame de emergência e o software não estiver funcionando, você conseguirá realizar o cálculo da
concentração da substância com o nosso passo a passo, aplicando a Lei de Lambert-Beer.
ESPECTROFOTOMETRIA
A espectrofotometria (Espectrometria ou Espectroscopia) é uma das técnicas que utilizam a fotometria
como princípio.
Foto: Shutterstock.com
 Exemplo de espectrofotômetro.
Foto: Shutterstock.com
 Exemplo de espectrofotômetro.
A partir dela, é possível medir a absorção de luz visível e ultravioleta, associando-a com a técnica de
colorimetria, usando para isso os aparelhos espectrofotômetros.
Como mostrado no esquema a seguir, o espectrofotômetro apresenta uma fonte de luz, que será de
tungstênio para luz visível ou de deutério para luz ultravioleta. Essa luz emitida passa por um
monocromador, “transformando” essa luz em monocromática.
Imagem: Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
 Esquema simplificado dos componentes principais dos espectrofotômetros.
Atenção!
A luz visível compreende a luz com comprimento de onda de 400nm a 700nm.
Foto: Shutterstock.com
Ao passar pelo monocromador, o feixe passa por uma fenda (slit ) que determina qual intervalo de
comprimento de onda será permitido na avaliação. Se o monocromador for ajustado para 595nm e o
aparelho tiver uma fenda de 10nm, por exemplo, o feixe de luz formado terá comprimento de onda de
590nm a 600nm.
Mas você deve estar se perguntando como esse intervalo é obtido. Vamos entender?
Quando o intervalo é de 10nm, isso indica que a avaliação será 5nm além do valor atribuído (590nm) e
5nm pra baixo (600nm). Por isso que no exemplo anterior, na fenda de 10nm, ajustado para 595nm, o
feixe terá de 590nm a 600nm.
Depois do local para inserir a cubeta com a amostra, tem um detector do tipo fotomultiplicador, que
transforma a luz transmitida pela amostra em impulso elétrico, que é amplificado e reconhecido
eletronicamente. De acordo com o software do equipamento, esse resultado será fornecido em
absorbância, transmitância e/ou concentração.
 DICA
Quanto menor for o limite inferior de abertura do slit , melhor será o espectrofotômetro; e quanto menor
a abertura da fenda utilizada, maior terá que ser a sensibilidade do fotomultiplicador.
Até o momento, nós discutimos que na espectrofotometria a luz será absorvida de acordo com a
coloração da amostra avaliada, e que a concentração será proporcional ao valor da absorbância. Mas
nem toda amostra terá uma cor diretamente relacionada com a substância de nosso interesse; assim
como nem toda substância a ser investigada possui uma cor.
Então como devemos proceder para que o teste no espectrofotômetro seja substância (ou característica)
específica? Como determinar a concentração da substância de interesse em uma amostra heterogênea
e previamente colorida?
Essas perguntas são muito pertinentes, e vamos entender todo o passo a passo necessário para
compreendermos a aplicação da espectrofotometria na prática clínica.
1
Para termos uma amostra viável para ser utilizada na espectrofotometria, precisamos realizar reações
bioquímicas colorimétricas, nas quais utilizamos reagentes que em contato com as substâncias de
interesse geram alterações na cor da solução, seja por consumo de substrato ou por formação de novos
produtos.
Essa cor gerada será proporcional à concentração da substância corada na solução e, por conseguinte,
obtemos a concentração da substância de interesse, de acordo com a reação bioquímica.
2
3
A cor da solução resultante das reações bioquímicas será avaliada de acordo com o comprimento de
onda de luz que absorve; ou seja, se uma solução apresentacor azul, significa que ela transmite luz azul
e absorve a cor complementar, que é a luz amarela.
Logo, sua leitura deverá ser realizada com feixe no comprimento de onda de 580nm a 595nm, referente
à luz amarela. Clique e veja o esquema.
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 Correlação dos comprimentos de onda e as cores absorvidas e complementares.
Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
No laboratório de bioquímica clínica, grande parte dos exames realizados se baseia nos métodos que
acabamos de estudar – fotometria e colorimetria –, tendo como valores finais as concentrações das
substâncias de interesse que são expressas em mg/dL, U/L, mmol/L, entre outras escalas.
As reações podem ter características qualitativas ou quantitativas, sendo os testes mais comuns para
dosagem/identificação de:
Proteínas, glicose, colesterol e lipídeos;
javascript:void(0)
Íons: ferro, cálcio, magnésio;
Produtos nitrogenados: amônia, ureia e ácido úrico;
Enzimas: fosfatase alcalina, amilase;
Pigmentos endógenos: bilirrubina.
A seguir vamos conhecer algumas reações bioquímicas utilizadas na prática laboratorial. Lembrando
que hoje já são vendidos kits com todos os reagentes e parâmetros padronizados, facilitando a parte
operacional.
Analito Método Leitura
Glicose o -toluidina 600 nm a 650 nm
Creatinina sérica Cinético colorimétrico de tempo fixo 490 nm a 520 nm
Amilase Monitorização do tempo de hidrólise com iodo 660 nm
Fósforo Molibdato de amônio 650 nm
Ferro sérico Dissociação e redução do ferro 540 nm a 580 nm
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Vamos conhecer melhor os métodos de detecção desses analitos:
Glicose: A molécula de glicose reage com a o- toluidina em um meio ácido e aquecido. Dessa reação
resultam a glicosamina e a base de Schiff, que produz coloração azul e será proporcional à
concentração de glicose presente na amostra avaliada.
Creatinina sérica: A molécula de creatinina reage com o picrato alcalino (pH 12,4) em meio tamponado,
gerando a molécula de picrato de creatinina de coloração vermelha, que será proporcional à
concentração de creatinina na amostra avaliada.
Amilase: essa técnica é realizada de forma pareada à amostra com um padrão. Preparam-se dois tubos
com amido e iodo, que será de cor azul. Será adicionado em um dos tubos a amostra para quantificar a
amilase. A amilase presente na amostra irá degradar o amido a 37 °C, e a avaliação será pela perda da
coloração azul; comparativamente com o tubo controle, onde o amido não foi degradado e continua com
a coloração azul. A absorbância detectada será inversamente proporcional à atividade da amilase na
amostra.
Fósforo: os íons de fósforo reagem com o molibdato de amônio quando em presença de ácido sulfúrico,
formando o fosfomolibdato de amônio. A esse produto será adicionado hidroxilamina em meio alcalino,
que resultará em azul de molibdênio, indicando a concentração de fósforo na amostra avaliada.
Ferro: a molécula de ferro sérico será dissociada da transferrina em meio ácido, reduzindo seu estado
férrico pela hidroxilamina. As proteínas são precipitadas com o ácido clorídrico, ácido tricloroacético e
ácido tioglicólico. Ao final, o ferro irá reagir com a ferrozina, formando um complexo de cor violeta que
indicará a concentração do ferro na amostra avaliada.
TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA
A turbidimetria e a nefelometria são métodos que também se baseiam na fotometria, uma vez que
utilizam a intensidade de luz como fonte para avaliar a concentração da substância de interesse na
amostra; porém diferem da espectrofotometria, por não associar a colorimetria, e sim a turbidez da
amostra e a consequente dispersão e/ou transmissão da luz incidente.
Essas técnicas visam avaliar a presença de complexos insolúveis, como complexos de antígeno-
anticorpo. A quantificação desse imunocomplexo será proporcional à dispersão da luz: quanto mais turva
for a amostra, mais concentrada está a substância de interesse e, consequentemente, mais a luz
incidente será dispersada.
Esses dois métodos são inversos e complementares, mas quais são as diferenças entre eles?
A turbidimetria avalia e quantifica a luz que não foi dispersada, ou seja, a luz que foi transmitida até os
detectores / fotomultiplicadores. Já a nefelometria quantifica a luz dispersada pelos detectores alocados
em ângulos entre 45° a 90°, sendo um método bem mais sensível do que a turbidimetria.
Imagem: Elaborada por Fabiana Vieira de Mello.
 Esquema que compara os métodos de nefelometria e turbidimetria.
Vamos entender melhor?
A intensidade de luz que é captada nos detectores, tanto na nefelometria quanto na turbidimetria, irá
variar de acordo com as características do complexo proteico formado, principalmente em relação ao
quantitativo, ao tamanho e à forma. Para intensificar a turbidez da técnica, muitos kits comerciais
utilizam partículas de látex revestidas pelos anticorpos contra a substância de interesse.
Imagem: U.S. Geological Survey / Wikimedia Commons / Domínio Público.
 Esquema ilustrando o aumento da turbidez da reação antígeno-anticorpo com o látex.
Assim como na espectrofotometria, a curva padrão (de calibração) é fundamental para que se possa ter
valores de referência e para que o aparelho seja calibrado de maneira correta antes de ser utilizado com
as amostras de interesse. Para zerar o aparelho, também se utiliza um tubo somente com o reagente,
chamado de branco.
A vantagem da turbidimetria é que pode ser realizada em aparelhos de espectrofotometria, enquanto a
nefelometria precisa de um aparelho específico e que nem sempre está disponível nos laboratórios de
análises clínicas.
De maneira geral, o método turbidimétrico é vantajoso pela sua rapidez de execução, exatidão e
facilidade operacional. Por outro lado, é preciso se certificar de que não haja coloração na amostra, pois
a coloração pode atrapalhar e acabar interferindo no resultado final.
A turbidimetria pode ser usada nos seguintes setores:
MICROBIOLOGIA
Para acompanhar o crescimento bacteriano por meio de turvação, mensuração da sensibilidade aos
antibióticos nas culturas.
IMUNOLOGIA
Para avaliação de Proteína C-reativa (PCR).
BIOQUÍMICA
Para quantificação da concentração de proteínas em diversos líquidos biológicos, como em LCR (líquido
cerebrospinal) e urina.
Já a nefelometria é frequentemente utilizada para exames de detecção de anticorpos, uma vez que são
mais sensíveis do que a turbidimetria, como detecção de fator reumatoide (FR).
Finalidade Método Leitura
Microalbuminúria
Quantificação da
albumina na urina.
Reação de aglutinação
de antígeno-anticorpo.
540 nm
Ferritina
Quantificação da ferritina
no soro.
Reação de aglutinação
de antígeno-anticorpo.
540 nm
Proteína C-reativa
(PCR)
Quantificação da Proteína
C-reativa no soro.
Reação de aglutinação
de antígeno-anticorpo.
540 nm
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Vamos conhecer melhor os métodos de detecção desses analitos:
Microalbuminúria: quantificação da concentração da albumina de maneira diretamente proporcional à
aglutinação da albumina presente na amostra de urina avaliada com partículas de látex recobertas com
anticorpos antialbumina humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a
incubação com o reagente e após 2 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível
formação da aglutinação.
Ferritina: quantificação da concentração da ferritina de maneira diretamente proporcional à aglutinação
da ferritina presente na amostra de soro avaliada com partículas de látex recobertas com anticorpos
antiferritina humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a incubação
com o reagente e após 5 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível formação da
aglutinação.
Proteína C-reativa (PCR): quantificação da concentração da PCR de maneira diretamente proporcional
à aglutinação da PCR presente na amostra de soro avaliada com partículasde látex recobertas com
anticorpos anti-PCR humana. Realizar a leitura do tubo padrão e da amostra imediatamente após a
incubação com o reagente e após 2 minutos, para comparar a amostra antes e depois da possível
formação da aglutinação.
MÉTODOS ELETROFORÉTICOS
A eletroforese é um método de separação baseado principalmente na diferença de migração dos
componentes/substâncias carregados sob influência de campo elétrico.
De maneira geral, as substâncias que possuem carga negativa migram em direção ao polo positivo
(ânodo), e as que possuem carga positiva migram em direção ao polo negativo (cátodo). Essa migração
é feita em uma “malha” onde as amostras são injetadas, podendo ser em capilar ou placa de gel. Essa
malha é embebida em tampão específico para a corrida das amostras. E é necessário um sistema
composto por:
Imagem: Shutterstock.com
 Apresentação esquemática da eletroforese em gel e a obtenção dos resultados.
Além da carga dos componentes da amostra, o tamanho e o volume também podem influenciar essa
separação. Quanto mais concentrada for essa malha, menores serão os poros, e mais lento será o
processo de separação.
Conforme acontece o processo de separação, formam-se bandas na malha, que diferem umas das
outras pela carga elétrica e/ou pelo tamanho das substâncias.
A corrente elétrica aplicada no método é contínua, e quanto maior ela for, menor tende a ser o tempo
para separação dos componentes, pois a velocidade será maior. Além disso, terá uma menor dispersão
da banda, sendo mais eficiente, porém gerará maior calor, que poderá gerar processos de convecção e,
assim, misturar as bandas já separadas.
Imagem: Shutterstock.com
 Esquema da amostra no gel antes e depois da eletroforese.
Com isso, os parâmetros aplicados, como corrente, tempo e concentração da malha, devem ser
avaliados caso a caso, conforme a necessidade operacional/experimental.
Vamos conhecer o que é necessário para realizar uma eletroforese:
SUPORTE E MALHA
Pode ser de gel de agarose, gel de poliacrilamida, acetato de celulose.
SOLUÇÃO-TAMPÃO
Formada por água, sal ácido ou sal básico (pode ser ácido ou alcalino, dependendo da necessidade).
CUBA DE ELETROFORESE
Permite que a malha fique embebida no tampão e possui os eletrodos positivo e negativo.
FONTE DE VOLTAGEM
Aparelho que transforma a corrente alternada em corrente contínua, permitindo a regulagem da
intensidade e determinando a polaridade dos compartimentos da cuba.
A escolha da malha precisa ser avaliada de acordo com a necessidade de cada caso. O acetato de
celulose permite uma separação proteica rápida e possibilita um armazenamento mais prolongado dos
filmes corados, além de ter um custo mais baixo, porém é um pouco limitado quanto à separação de
amostras muito heterogêneas.
Foto: Shutterstock.com
 Aparato para a eletroforese em cuba vertical.
Foto: Shutterstock.com
 Aparato para a eletroforese em cuba horizontal .
O gel de agarose possui ampla capacidade de separação proteica e permite avaliar substâncias com
peso molecular alto. Também possui custo relativamente baixo, porém não pode ser armazenado e
preservado por muito tempo.
O gel de poliacrilamida pode conter um reagente desnaturante, que facilita a separação das substâncias.
Comparada a outras técnicas, é a que apresenta melhor resultado em termos de visualização de
proteínas com baixas concentrações, porém é a de mais difícil execução para a rotina laboratorial,
sendo destinada para casos mais específicos.
Uma das aplicações da eletroforese no laboratório de análises clínicas é a avaliação das diferentes
proteínas nas amostras.
Para entendermos esse processo na prática, vamos ver um passo a passo de uma eletroforese em gel
de agarose de hemoglobinas na prática clínica.
1
Diluímos o pó da agarose em tampão, de acordo com a concentração desejada.
Colocamos a solução de agarose para solidificar no suporte específico, e com o “pente” que irá
demarcar os locais para aplicação das amostras no gel.
Foto: Shutterstock.com
 Encaixe do “pente” no gel ainda líquido para formação dos poços, onde será feita a aplicação das
amostras.
2
3
Após a solidificação total, colocamos o gel dentro da cuba de eletroforese horizontal e acrescentamos a
solução-tampão.
Colocamos no primeiro poço para as amostras (slot ) um padrão de peso molecular ou um padrão dos
parâmetros a serem avaliados. No nosso caso, podemos colocar uma amostra padrão contendo
hemoglobina AS (traço falcêmico), uma contendo hemoglobina A (normal), no slot ao lado um padrão
de hemoglobina SS (falcêmico), e em outro a amostra de um paciente. Em todas as amostras, antes de
aplicá-las no gel, misturamos com um tampão de amostra para corrida.
4
5
Foto: Shutterstock.com
 Aplicação das amostras nos poços do gel.
Após aplicar todas as amostras, cada uma em um poço, fechamos a cuba eletroforética e ligamos os
eletrodos à fonte. Atenção! Precisamos de muita atenção para colocar o gel de maneira que as
amostras (que estão carregadas negativamente) corram no gel em direção ao polo positivo; pois se
colocar o gel virado ao contrário, todas as amostras sairão do gel, invalidando a corrida.
Esperamos o tempo necessário para as substâncias migrarem pelo gel de agarose e se separarem
conforme carga elétrica.
Imagem: Shutterstock.com
 Gel com a migração das diferentes moléculas por amostra.
6
7
Imagem: Paulo Cesar Naoum, Hemoglobinas, 2013, p. 49 adaptado por Fabiana Vieira de Mello.
 Eletroforese em gel de agarose de hemoglobinas.
Analisaremos a distribuição de bandas das amostras comparando com a distribuição de bandas do
padrão.
A partir do gel, podemos observar que na amostra padrão da hemoglobina A e no paciente verificamos
uma banda mais forte (que seria a hemoglobina A) e uma banda mais fraquinha na parte inferior do gel
(que seria a hemoglobina A2), ambas as amostras com características de migração no gel similares. É
importante ressaltar que em indivíduos normais a hemoglobina é formada por quatro globinas (duas
cadeias alfa e duas cadeias beta) e um grupo heme. Na amostra padrão da hemoglobina AS temos três
bandas, sendo a mais fraquinha compatível com a hemoglobina A2, uma mais forte compatível com a
hemoglobina A e uma outra banda, compatível com a migração da hemoglobina S. A hemoglobina S
difere da hemoglobina A, pois a cadeia beta da globina apresenta uma substituição de um ácido
glutâmico por uma valina na sexta posição da cadeia de DNA que origina uma hemoglobina anormal.
Indivíduos que apresentam Hb AS apresentam traço falciforme e possuem aproximadamente 50% de
hemoglobina A e 50% de hemoglobina S. Já os indivíduos Hb SS apresentam anemia falciforme e têm
aproximadamente 100% da hemoglobina S. O nosso paciente em estudo não apresenta alteração na
hemoglobina.
 ATENÇÃO
Na bioquímica clínica, a eletroforese é muito utilizada para investigar a composição de proteínas na
urina e no soro, principalmente quando o paciente apresentou níveis anormais na dosagem de proteínas
totais, ou albumina, no exame anterior. O médico solicita esse exame de maneira complementar para
entender o que está afetando as concentrações dessas proteínas no sangue e/ou na urina.
A eletroforese de proteínas do sangue forma um padrão clássico de bandeamento de aproximadamente
5 grupos: albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama.
Imagem: Shutterstock.com
 Resultado típico do bandeamento das proteínas do soro humano.
Algumas doenças, porém, podem afetar essa produção equilibrada, aumentando o quantitativo de uma
banda específica, como no caso de mieloma múltiplo. Quando se detecta uma banda em quantidade
anormal, realiza-se um exame complementar de imunofixação.
Imagem: Paula Virginia Bottini, Testes laboratoriais para avaliação do componente monoclonal, 2007, p.
24.
 Eletroforese em gel de agarose. Em (A), paciente normal; e em (B), paciente com mieloma múltiplo.
Além do mieloma múltiplo, a eletroforese de proteínas também pode ser solicitada quando os sintomasindicam algumas doenças autoimunes, inflamatórias, hepáticas ou renais.
Outra aplicação clínica é a avaliação do perfil de lipoproteínas por eletroforese, sendo utilizada como
auxílio no diagnóstico das dislipidemias primárias e secundárias. Onde tem-se como referência o padrão
de distribuição de:
alfa lipoproteínas (22,3 a 53,3%)
pré-beta lipoproteínas (4,4 a 23,1%)
beta lipoproteínas (38,6 a 69,4%)
lipoproteína-Lp(a) (Ausente)
A eletroforese também pode auxiliar no diagnóstico dos processos inflamatórios no sistema nervoso
central, como esclerose múltipla, a partir da análise eletroforética da composição proteica do líquor. Por
fim, conforme já falamos ao longo do módulo, a eletroforese é muito utilizada para o diagnóstico de
talassemias e hemoglobinopatias, sendo fonte de diagnóstico diferencial de microcitoses e anemias
hemolíticas.
PRINCIPAIS ERROS DE EXECUÇÃO DAS
TÉCNICAS DE ESPECTROFOTOMETRIA E
ELETROFORESE
A especialista Fabiana Vieira de Mello discute sobre os principais erros metodológicos na execução das
técnicas em laboratórios de bioquímica clínica.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. O TÉCNICO DO LABORATÓRIO PROCUROU O RESPONSÁVEL TÉCNICO
PARA APRESENTAR AS ABSORBÂNCIAS DA DOSAGEM DE DUAS AMOSTRAS
DENTRO DO GRÁFICO DA CURVA PADRÃO DIÁRIA, SOLICITANDO QUE VOCÊ
ASSINE O LAUDO PARA LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS.
 ELABORADO POR FABIANA VIEIRA DE MELLO.
NO GRÁFICO, AMOSTRAS EM TESTES ESTÃO SINALIZADAS PELO TRIÂNGULO
VERDE E PELO QUADRADO ROXO E AS AMOSTRAS PADRÃO,
REPRESENTADAS PELAS BOLAS BRANCAS. A PARTIR DOS RESULTADOS
APRESENTADOS, VOCÊ:
A) Assina o laudo e autoriza a liberação dos resultados com os valores apresentados.
B) Não assina o laudo e solicita que refaçam as dosagens das duas amostras.
C) Não assina o laudo, e solicita que refaça a dosagem da amostra quadrado roxa diluindo-a.
D) Não assina o laudo e solicita que refaça a dosagem da amostra triângulo verde diluindo-a.
E) Não assina o laudo e solicita que refaça a dosagem das duas amostras diluindo-as.
2. (ADAPTADA) SERVIÇO AUTÔNOMO DE ÁGUA E ESGOTO DE SÃO PAULO
(SAAE-SP) - DIVERSOS CARGOS (VUNESP - 2014). O ENSAIO QUE AVALIA A
TURBIDEZ DA AMOSTRA E COM A CONSEQUENTE DISPERSÃO DA LUZ
INCIDENTE É:
A) Eletroforese
B) Nefelometria
C) Turbidimetria
D) Espectrometria
E) Reação de aglutinação do látex
GABARITO
1. O técnico do laboratório procurou o responsável técnico para apresentar as absorbâncias da
dosagem de duas amostras dentro do gráfico da curva padrão diária, solicitando que você assine
o laudo para liberação dos resultados.
 Elaborado por Fabiana Vieira de Mello.
No gráfico, amostras em testes estão sinalizadas pelo triângulo verde e pelo quadrado roxo e as
amostras padrão, representadas pelas bolas brancas. A partir dos resultados apresentados,
você:
A alternativa "C " está correta.
A partir do gráfico, vemos que a amostra representada pelo quadrado roxo está na região “platô” da
curva padrão. Caso a dosagem da amostra do paciente caia próxima ao “platô”, é importante repetir a
dosagem diluindo a amostra do paciente, para que a dosagem caia no intervalo seguro da curva padrão.
Em relação à amostra representada pelo triângulo verde, podemos liberar o laudo, pois está dentro da
faixa de margem segura da dosagem.
2. (Adaptada) Serviço Autônomo de Água e Esgoto de São Paulo (SAAE-SP) - Diversos Cargos
(VUNESP - 2014). O ensaio que avalia a turbidez da amostra e com a consequente dispersão da
luz incidente é: