Aula N05- Ensaios de Doseamento PDF

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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP 
CURSO DE FARMÁCIA
ENSAIOS DE 
DOSEAMENTO (TEOR)
Curso: Farmácia
Disciplina: Controle de Qualidade Físico-Químico
Prof. Dr. Thiago Levi Silva Oliveira
 Objetivo: Esclarecer sobre a quantidade dos componentes essenciais presentes em
uma determinada amostra.
DOSEAMENTO
PODEM EXISTIR DIFERENTES 
MÉTODOS VÁLIDOS OFICIAIS OU NÃO.
Entretanto, sem exceção, as multinacionais farmacêuticas adotam os métodos
cromatográficos como oficiais de doseamento, especialmente para produtos acabados.
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VOLUMETRIA
ANÁLISE TITRIMÉTRICA 
OU 
TITULOMETRIA = TITULAÇÃO
MÉTODOS CLÁSSICOS 
DE DOSEAMENTO
Determinação quantitativa 
através da reação com uma 
solução padrão (volume)
SOLUÇÃO PADRÃO
Na titulação a precisão é fundamental e incluem vidrarias precisas,
balança analítica calibrada, padrões primários a serem utilizados na
padronização e solução indicadora.
UTILIZADA NOS MAIS DIFERENTES 
TIPOS DE VOLUMETRIA
TITULAÇÃO
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 Volumetria de Neutralização: reação ácido – base.
 Volumetria de Complexação: reação com formação de
complexos que geralmente envolve um íon metálico e um
agente ligante (EDTA).
 Volumetria de Oxi-redução: baseado em reações de
oxirredução (transferência de elétron – iodometria).
 Volumetria de Precipitação: baseiam na formação de produtos
poucos solúveis (precipitado) por ação de um agente
precipitante como o Nitrato de Prata.
TITULAÇÃO
Tipos de titulação
TITULAÇÃO
Classifique os 
procedimentos!
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TITULAÇÃO
Classifique os 
procedimentos!
GRAVIMETRIA
PRECIPITAÇÃO
FILTRAÇÃO
“LAVAGEM”
AQUECIMENTO
PESAGEM
CÁLCULOS
Determinação quantitativa através da 
medida da massa de um ou mais 
constituintes da amostra (pesagem).
GRAVIMETRIA
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GRAVIMETRIA
•A análise gravimétrica é o processo de isolar e de pesar um elemento, ou um
composto definido de um elemento, na forma mais pura possível.
O composto estável e puro, que possa ser convertido, com facilidade, numa forma
apropriada para pesagem.
APRESENTAM MAIOR SENSIBILIDADE
MÉTODOS 
INTRUMENTAIS DE 
DOSEAMENTO
 - Espectrofotômetro (UV-Visível)
 - Cromatográficos (HPLC e CG)
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Espectrofotometria 
UV-Visível
Espectrofotometria: técnica que permite a determinação da concentração de um analito com
base no padrão de absorção de ondas de luz pelo mesmo.
Apresenta alta sensibilidade e especificidade, sendo muito utilizada em análises quantitativas.
 Absorção: processo específico relacionado com a estrutura da espécie absorvente
Análise farmacopeica:
-Ultravioleta: ( 190 – 380 nm)
-Visível: ( 380 – 780 nm)
Fenda de saída
Fenda de entrada 
Grade de 
difração Espelhos 
Espectrofotometria
D
e
te
ct
o
r
Resposta da leitura 
das amostras: 
absorbância!
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ESPECTROFOTÔMETRO
EXEMPLO
Absorbância do padrão Absorbância do amostra
CURVA 
ANALÍTICA
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a)Preparar uma série de padrões exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada.
b) Dosar todos os padrões de acordo com a técnica recomendada. Efetuar as leituras no
método e aparelho empregado.
c) Obter os valores (resultados).
d) Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando os parâmetros do método
(ordenada) com as concentrações dos padrões (abscissa).
e) Verificar a linearidade dos pontos, sendo que a curva deve ser interpolado entre os pontos;
f) Procede-se à regressão linear da curva, obtendo-se a equação da reta (y = ax + b) e o
coeficiente de determinação da reta (R2);
g) Por meio dessa equação pode-se verificar uma proporcionalidade entre os valores de y
(absorbância) e x (concentração), conseguindo-se determinar a concentração de determinada
solução.
COMO PREPARAR UMA CURVA ANALÍTICA?
EXEMPLO – ESPECTROFOTOMETRIA
CONCENTRAÇÃO 
(mg/mL)
ABSORBÂNCIA
0,1 0.201
0,2 0.300
0.3 0.405
0,4 0.506
0,5 0.600
y = 1,004x + 0,1012
R² = 0,9997
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Série1
Linear (Série1)
Linear (Série1)
LINEAR?
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EXEMPLO – ESPECTROFOTOMETRIA
CONCENTRAÇÃO 
(mg/mL)
ABSORBÂNCIA
0,1 0.201
0,2 0,254
0.3 0,3
0,4 0,345
0,5 0,6
LINEAR?
y = 0,889x + 0,0733
R² = 0,8237
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Série1
Linear (Série1)
Cromatografia Gasosa (CG)
Gas chromatography (GC)
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Cromatografia Gasosa (CG)
Cromatografia Gasoca (CG): técnica empregada na separação de gases ou substâncias
voláteis.
 A separação baseia-se na diferente distribuição das substâncias da amostra entre uma
fase estacionária (sólida ou líquida) em uma fase móvel (gasosa).
 A amostra é introduzida na coluna, que contém a FE, por meio de um sistema de
injeção.
 Os componentes da mistura são vaporizados e, de acordo com suas propriedades,
bem como as da FE, são retidos e eluidos através da coluna em tempos diferentes.
PRINCÍPIO DA 
TÉCNICA
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1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.
2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.
6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador) – CROMATOGRAMA.
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
ELEMENTOS DO 
INSTRUMENTO
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Cromatografia Gasosa (CG)
Indicado para quais 
tipos de amostra?
ELEMENTOS DO 
INSTRUMENTO
- Cromatografia gasosa isotérmica: a temperatura
da coluna permanece constante durante a análise.
- Cromatografia gasosa com programação de
temperatura: melhora a separação e diminui o
tempo de análise.
Eluição
Corrente de gás 
passa pela coluna
Arraste da 
amostra através 
da coluna
Amostra 
vaporizada é 
introduzida na 
coluna
Substâncias são 
separadas 
Cada substância 
passa pelo 
detector
É gerado um sinal
O sinal é 
registrado 
(cromatograma)
Cromatografia Gasosa (CG)
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Cromatografia Gasosa (CG)
Fase móvel em CG: Gás He, N, H e Ar que NÃO reage com a amostra. Apenas a carrega através da coluna.
Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE.
Gás puro: deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
FASE MÓVEL
H2O oxida / hidrolisa algumas FE
Hidrocarbonetos ruído no sinal
Cromatografia Gasosa (CG)
Está enrolada: posicionada dentro do forno. Separa os constituintes da amostra.
COLUNAS
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Cromatografia Gasosa (CG)
 Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando
da passagem de substâncias que não o gás de arraste.
DETECTORES
Universais: respondem para qualquer
substância.
Seletivos: respondem para substâncias com
determinadas propriedades.
Específicos: respondem para substâncias
com determinado elemento ou grupo
funcional.
Cromatografia Gasosa (CG)
Detector por ionização em chama
- Formação de íons pela combustão da amostra na presença de H2 e O2 .
- Origina corrente elétrica no coletor gerando um sinal.
DETECTORES
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CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
EXEMPLO
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
EXEMPLO
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Reservatorio
de solventes
Bomba
coluna
Detector 
UV/Vis
Detector 
PDA
UPLC®
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Cromatografia Líquida: método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, que
envolve a distribuição diferencial destes em um sistema heterogêneo bifásico:
- Cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela
força da gravidade.
- Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na qual são utilizadas fases estacionárias de partículas
menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel.
PRINCÍPIO DA 
TÉCNICA
Fase móvel = líquido Fase estacionária = coluna
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CROMATOGRAFIA 
LÍQUIDA CLÁSSICA
Coluna de vidro com sílica(fase estacionária)
Fase estacionária polar
Cromatografia de 
fase normal
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA 
LÍQUIDA CLÁSSICA
Coluna de sílica derivatizada
com hidrocarbonetos de 2C a 18C 
Coluna C18
Fase estacionária apolar
Cromatografia de 
fase reversa
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
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SISTEMA 
AUTOMATIZADO
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA - CLAE
Fase Móvel Amostra
Vários!
ELEMENTOS DO 
EQUIPAMENTO
Os aparelhos empregados em CL são chamados de
cromatógrafos líquido. Estes se caracterizam por
apresentarem a seguinte configuração instrumental:
1- Reservatório de fase móvel
2- Sistema de bombeamento da fase móvel
3- Sistema de injeção
4- Sistema analítico: coluna cromatográfica
5- Sistema de detecção
6- Sistema de controle, aquisição e registro de dados
Área do pico do padrão Área do pico da amostra
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA - CLAE
- Fase estacionaria sólida - suporte cromatográfico – coluna de aço inox empacotadas com a FE (Normal:
sílica-gel / Reversa: sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 ).
- Fase móvel líquida (eluente cromatográfico) - com alto grau de pureza, filtrados e desgaseificados.
Fase Normal Fase Reversa
ELEMENTOS DO 
EQUIPAMENTO
Sistema de Eluição: 
– Isocrático: constituição do solvente permanece constante. 
– Gradiente: composição do solvente é alterada.
Qual a vantagem?
A bomba abastece 
o sistema com 
fase móvel
A amostra é 
injetada
Arraste da 
amostra para a 
coluna
As substâncias são 
separadas 
Cada substância 
passa pelo 
detector
É gerado um sinal
O sinal é 
registrado 
(cromatograma)
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC
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E COMO INTERPRETAR OS 
RESULTADOS?
Diferentes espécies saem da coluna em tempos diferentes
Informações qualitativas e quantitativas
Tempo de retenção
Área do pico
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC
E COMO INTERPRETAR OS 
RESULTADOS?
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC
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Qual a melhor condição 
cromatográfica?
O que deve ser avaliado para 
conseguir esta condição?
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC
 Quando a banda cromatográfica é registra na forma de pico, a sua área pode ser
calculada, como a área do triângulo que engloba o pico cromatográfico.
 Medir a altura do pico (h) e a sua largura de base (Wb).
A = ½ x h xWb
Observação: O princípio básico da quantificação é que a área dos picos do cromatograma é proporcional a
massa do compostos.
COMO EXPRESSAR OS 
RESULTADOS POR MÉTODOS 
CROMATOGRÁFICOS?
Resposta da leitura das amostras: área do pico, 
tempo de retenção e espectro de absorção.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC
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IMPORTANTE!
1°) A Espectrofotometria UV/VIS não é a técnica mais indicada para determinação de
teor em amostras que contêm vários componentes, por não possuir capacidade de
eliminar interferentes e propriedades de separação.
2°) A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) oferece grande segurança na
determinação de teor em amostras complexas de medicamentos e cosméticos.
ESPECTROFOMETRIA X CLAE
Construir uma curva analítica!
► Para se obter o valor da quantidade real da substância cuja concentração se
desconhece, é necessário estabelecer uma relação entre a respostas do aparelho
(absorbância ou área do pico) de uma solução padrão em diferentes concentrações.
► Todo o analista deve ser capaz de preparar suas próprias curvas de calibração e
interpretar os resultados obtidos.
NECESSIDADES EM 
AMBOS OS MÉTODOS!
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CURVA ANALÍTICA
Não 
esqueça!
EXERCÍCIOS
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Obrigado pela presença!
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