Lista_de_Exerccio_HPLC_metodos_Instrumentais_plse_2023_1_vitoriaa

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Universidade Federal do Rio Grande Do Norte 
Departamento de Farmácia 
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análises aplicados a Produtos Farmacêuticos 
 Discente: Vitória Augusto Santana 
 
 LISTA DE EXERCÍCIO 
 
Sobre a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, responda: 
 
1. Sobre cromatografia líquida analise as seguintes afirmações como verdadeiras (V) ou falsas (F), 
justificando as falsas: 
(F) A HPLC é uma técnica de ultra-microanálise, que de acordo com a substância e detector 
empregado é capaz de quantificar massas de componentes inferiores a 10-8 g. -> não é capaz 
(F) As colunas analíticas são destinadas apenas para fins de identificação e quantificação, não 
sendo possível isolar os compostos de uma mistura. -> não é o objetivo, também é utilizado para 
fins de separação. 
(V) Esse tipo de cromatografia foi inicialmente desenvolvida pelo russo Mikhail Tswett. 
(V) Altura equivalente a um prato teórico, H, compreende o comprimento da coluna no qual o 
equilíbrio termodinâmico foi atingido entre a substância e a fase estacionária. 
 
2. A figura a seguir esquematiza os elementos que compõem um cromatógrafo líquido de alta 
eficiência. Com base nisto, identifique os componentes e descreva as etapas operacionais que 
levam a obtenção do cromatograma. 
 
Fonte:https://arquivo.pciconcursos.com.br/provas/25776677/063fb414ddeb/farmaceutico.pdf 
 
a. Fase móvel: A fase móvel é impulsionada pela bomba para se deslocar através do sistema 
cromatográfico. 
b. Bomba: A bomba é responsável por acompanhar a fase móvel ao longo do sistema 
cromatográfico, permitindo que ela se misture com a amostra na coluna. 
c. Injetor da amostra: O injetor da amostra é usado para introduzir a amostra no sistema 
cromatográfico, onde seus constituintes serão separados dentro da coluna. 
d. Coluna: A coluna é onde ocorre a separação dos componentes da amostra com base nas 
temporariamente entre a fase móvel, fase estacionária e os componentes analisados. 
e. Detector: O detector monitora as mudanças na fase móvel durante a separação 
cromatográfica. Ele detecta propriedades físicas específicas dos componentes, convertendo 
testes de variações em sinais elétricos que são enviados para o software de análise. 
f. Descarte da fase móvel: É o local onde a fase móvel que passou pelo detector é descartada, 
uma vez que não possui mais utilidade para a análise. 
g. Software: O software é responsável por receber e processar o sinal elétrico gerado pelo 
detector. Ele realiza o registro dos dados e realiza tratamentos matemáticos para gerar o 
gráfico ou cromatograma, que representam a separação dos componentes da amostra ao 
longo do tempo. O software também pode fornecer recursos adicionais de análise e 
interpretação dos resultados. 
3. Considere as seguintes condições cromatográficas em HPLC: coluna de sílica, eluente ACN:H2O 
(70:30, v/v), fluxo de 1 ml/min, detecção a 217 nm. O cromatograma apresentou 3 picos: Pico 1 
Tr = 2 min Pico 2 Tr = 5 min Pico 3 Tr = 7 min. Qual pico representa o composto de menor 
polaridade? Justifique sua resposta. 
O pico 1, pois a ordem de eluição dos componentes é diretamente proporcional à polaridade do 
soluto e inversamente proporcional à polaridade da fase móvel. Portanto, o componente com 
menor polaridade eluirá mais rapidamente, sendo representado pelo pico 1. 
4. Por que as fases estacionárias de sílica microporosa estão geralmente limitadas a operar na faixa 
de pH entre 2 e 8? 
As fases estacionárias de sílica microporosa são geralmente limitadas a operar na faixa de pH 
entre 2 e 8 devido à estabilidade química da sílica, problemas de solubilidade e limitações das 
características de superfície. Manter o pH dentro dessa faixa ajuda a garantir uma separação 
cromatográfica eficiente e confiável. 
5. A cromatografia líquida de alta eficiência utiliza pressões elevadas para forçar a passagem de 
solventes através das colunas cromatográficas. Diante disto, por que é necessária alta pressão 
na HPLC e quais características as colunas analíticas devem possuir para suportarem esta 
pressão? 
A alta pressão na HPLC é necessária para garantir um fluxo rápido e eficiente, melhorar a 
eficiência da separação, reduzir a difusão dos analitos, diminuir a viscosidade da fase móvel e 
permitir o uso de colunas de menor diâmetro interno. Esses aspectos contribuem para uma 
separação cromatográfica de alta qualidade e resultados analíticos confiáveis. As colunas 
analíticas devem possuir material resistente, como aço inoxidável ou materiais poliméricos de alta 
resistência, para suportar a pressão aplicada. Também devem ter diâmetro interno adequado 
para acomodar o fluxo de alta pressão, partículas estacionárias de alta qualidade, 
empacotamento adequado das partículas estacionárias para garantir um fluxo adequado da fase 
móvel e uma separação eficiente, conexões e vedação adequadas para evitar vazamentos de 
pressão ao longo da coluna. 
 
6. Por que a força eluente aumenta quando o solvente se torna menos polar na cromatografia de 
fase reversa, enquanto a força eluente aumenta quando o solvente se torna mais polar na 
cromatografia de fase normal? 
 
Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é polar e a fase móvel é não polar. Quando 
o solvente da fase móvel se torna menos polar, a força eluente aumenta. Isso ocorre porque a 
presença de um solvente menos polar na fase móvel enfraquece a interação entre a fase 
estacionária polar e o soluto, reduzindo sua retenção na coluna. Assim, os solutos são eluídos 
mais rapidamente. 
Por outro lado, na cromatografia de fase normal, a fase estacionária é apolar e a fase móvel é 
polar. Quando o solvente da fase móvel se torna mais polar, a força eluente aumenta. Isso 
acontece porque um solvente mais polar na fase móvel aumenta a interação entre a fase 
estacionária apolar e o soluto, retardando sua eluição. Portanto, os solutos são retidos por mais 
tempo na coluna antes de serem eluídos. 
 
7. Descreva as diferenças entre o bombeamento isocrático e por gradiente. 
o bombeamento isocrático mantém a composição da fase móvel constante, enquanto o 
bombeamento por gradiente permite alterar a composição da fase móvel de forma programada. 
 
8. O detector emite um sinal elétrico o qual é registrado, que fornece informações de concentração 
ou a massa dos compostos da amostra que eluem ao longo da coluna cromatográfica. Descreva 
as propriedades, de maior relevância, que os detectores devem possuir. 
Devem ser sensíveis, precisos, seletivos e exatos. 
9. Aponte as diferenças, destacando as principais aplicações dos detectores empregados em HPLC: 
Detectores de absorbância no UV/Vis; Fluorescência; Índice de Refração; Eletroquímicos. 
Detectores de Absorbância no UV/Vis: são amplamente utilizados devido à sua versatilidade e 
aplicabilidade em uma variedade de compostos. Podem ser usados para análises de fármacos, 
compostos orgânicos, poluentes ambientais, aminoácidos, entre outros. 
Detectores de Fluorescência: são úteis para compostos que possuem propriedades de 
fluorescência. São amplamente empregados em aplicações biomédicas, ambientais e de 
alimentos, permitindo a detecção de baixas concentrações de analitos com alta sensibilidade e 
seletividade. 
Detectores de Índice de Refração: são utilizados para analisar compostos não absorventes no 
UV/Vis, como açúcares, polímeros, lipídios e aminoácidos. São especialmente úteis quando os 
analitos não possuem grupos cromóforos ou quando a detecção de baixas concentrações é 
necessária. 
Detectores Eletroquímicos: são utilizados para a análise de compostos redox ativos, como 
antioxidantes, compostos fenólicos, neurotransmissores e fármacos. São especialmente úteis 
na determinação de analitos eletroativos em matrizes complexas. 
 
10. Qual coluna é mais eficiente: aquela com uma altura do prato igual a 0,1 mm ou 1 mm? Justifique 
sua resposta. 
Uma altura do prato menorindica que a coluna é capaz de realizar uma maior quantidade de 
separações em um dado comprimento. Isso pode resultar em uma melhor resolução dos picos 
cromatográficos e em uma separação mais eficiente dos componentes da amostra. Portanto, a 
coluna com uma altura do prato igual a 0,1 mm tende a ser mais eficiente. 
 
 
11. Os cromatrogramas dos compostos A e B foram obtidos na mesma vazão em duas colunas de 
mesmo comprimento com eluente MeOH: H2O (35:65, v/v), coluna RP-C18 . Assinale a alternativa 
correta. 
 
a) A coluna 2 tem resolução maior. 
b) O composto B tem coeficiente de partição maior. 
c) As colunas apresentam fator de retenção (k) diferente. 
d) A coluna 2 é mais eficiente. 
12. Correlacione os métodos cromatográficos as proposições a seguir: 
 
1. Cromatografia de troca iônica; 
2. Cromatografia de partição; 
3. Cromatografia de adsorção; 
4. Cromatografia de exclusão molecular; 
5. Cromatografia de afinidade. 
(4) Solutos de tamanho diferentes penetram com uma diferente extensão em ambientes vazios 
existentes na fase estacionária. Os solutos maiores são eluidos primeiramente. 
(3) Fase estacionária sólida e uma fase móvel líquida ou gasosa. O soluto é adsorvido na superfície 
das partículas sólidas. 
(5) Utiliza interações específicas entre um tipo de molécula do soluto e uma segunda molécula que 
se encontra covalentemente ligada à fase estacionária. 
(1) Ânions ou cátions estão ligados covalentemente à fase estacionária sólida, que neste tipo de 
cromatografia costuma ser uma resina. 
(2) A separação é baseada nos diferentes coeficientes de partição (solubilidade) dos componentes 
da mistura entre dois solventes imiscíveis. 
13. A separação cromatográfica de duas substâncias foi realizada utilizando-se fase estacionária RP-
C18 e fase móvel de composição constante ACN: Ácido acético a 2% (40:60, v/v). Nestas 
condições, a substância B surge no cromatograma com Tr a 7,4 min e a substância A com Tr a 
10,5 min. Com base na afirmativa, assinale a alternativa correta. 
 
a) O procedimento descrito caracteriza-se como cromatografia líquida de fase normal. 
b) O aumento da proporção de ACN diminuirá a polaridade da fase móvel. 
c) A separação foi realizada pelo método gradiente. 
d) A substância A é menos polar que a substancia B. 
 
14. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) é um dos métodos analíticos mais utilizados 
para fins qualitativos e quantitativos. Quanto a esta técnica de cromatografia líquida, está 
INCORRETO afirmar que: 
 
a) A qualidade de coluna deve ser verificada quando houver variações de reprodutibilidade. 
b) Uma pré-coluna com composição de fase estacionária distinta da coluna cromatográfica deve 
ser instalada para aumentar a vida útil do sistema. 
c) Os solventes em cromatografia líquida são injetados sob alta pressão. 
d) Utilizando uma coluna de fase reversa, o analito mais polar elui primeiro que o analito menos 
polar. 
 
15. Um solvente ideal para ser empregado na fase móvel de uma análise em HPLC necessita ter os 
seguintes requisitos, EXCETO: 
a) Ter alto grau de pureza. 
b) Não dissolver a fase estacionária. 
c) Alta viscosidade. 
d) Dissolver a fase móvel sem decompor os analitos. 
e) Ser compatível com o detector. 
16. A HPLC pode ser efetuada por eluição isocrática ou eluição gradiente. Com base nisto, assinale 
a alternativa correta. 
 
a) A separação por gradiente é capaz de diminuir a resolução e reproduz picos menos simétricos. 
b) A eluição por gradiente apresenta a desvantagem de aumentar o tempo de análise; 
c) A separação por gradiente possui como desvantagens o aumento do custo, já que necessita 
de bomba com misturador, e não é compatível com todos os detectores. 
d) Dar-se o nome de eluição isocrática, quando a composição da fase móvel é alterada durante a 
eluição; 
 
17. Os detectores modernos são capazes de operar em ampla faixa ou intervalos de concentração. 
Geralmente, apresentam excelente sensibilidade, fornecem informações estruturais importantes 
sobre os analitos e permitem fácil quantificação. A respeito dos detectores modernos, é correto 
afirmar. 
 
a) Detectores por índice de refração são detectores específicos e apresentam maior seletividade 
se comparados aos outros detectores empregados em cromatografia líquida. 
b) Os detectores de fluorescência medem as mudanças da fluorescência no efluente das colunas 
quando este for exposto a comprimentos de onda selecionados. A grande desvantagem está na 
sua baixa sensibilidade. 
c) UV-VIS apresentam a vantagem de ser universais, isto é detectam qualquer composto que não 
seja a fase móvel. 
 d) UV-VIS têm como princípio a utilização da luz absorvida. Esses detectores são baseados na 
relação existente entre a intensidade do feixe de luz que incide na amostra e a intensidade do 
feixe que emerge dela. 
 
 
 
18. A cromatografia líquida de alta eficiência é uma importante técnica de separação. Conhecer suas 
vantagens e limitações é de extrema relevância para profissionais de laboratórios químicos, 
farmacêuticos, bioquímicos e outros. Assinale a alternativa que apresenta um importante 
diferencial deste sistema. 
 
a) Necessidade de amostra volátil e termicamente estável. 
b) A instrumentação é de fácil manipulação e não necessita mão de obra especializada. 
c) Pode ser aplicada tanto para compostos orgânicos como inorgânicos. 
d) As amostras podem ser líquidas, sólidas ou gasosas, iônicas ou covalentes, de baixa ou alta 
peso molecular. 
 
19. No cromatograma, a substância identificada pelo pico 1 (um) é tratada como uma substância que: 
 
a) Está em maior concentração na amostra. 
b) Está em menor concentração na amostra. 
c) Há baixa interação com a fase estacionária. 
d) Há baixa interação com a fase móvel. 
 
20. Analise as proposições a respeito a seguir, justificando as falsas: 
(F) A cromatografia com fase estacionária de troca iônica é mais adequada para compostos 
polares. ->composto iônicos 
(F) A fase estacionária de exclusão molecular é sempre aplicada para espécie de baixa massa 
molar. ->nem sempre 
(F) Uma das vantagens da cromatográfica líquida sobre a cromatografia gasosa é a possibilidade 
de separar termicamente instáveis. 
(V) Na cromatografia por partição de fase normal, a fase estacionária é apolar e a fase móvel 
deve ser polar. 
 
21- A cromatografia líquida de alta eficiência é uma das técnicas empregadas nas análises 
toxicológicas. Indique a alternativa que NÃO se apresenta como vantagem na aquisição deste 
equipamento. 
a) A boa sensibilidade 
b) A versatilidade 
c) A alta resolução 
d) Os resultados qualitativos 
e) O baixo custo de aquisição do equipamento 
 
22) Entre as misturas de solventes relacionadas abaixo, qual é aquela que apresenta maior polaridade 
(em relação à polariade da sílica)? 
a) CH2Cl2: hexano (40:60) 
b) MTBE: hexano (2:98) 
c) isopropanol:hexano (5:95) 
 
23) Enumere e justifique os problemas associados à presença e/ou formação de bolhas de ar em 
sistemas cromatográficos de alta eficiência (CLAE). Que alternativas existem para minimizar estes 
problemas? 
 
24) Quais as principais características (vantagens e limitações) das técnicas cromatográficas CLAE. 
Quais são os cuidados necessários para utilização correta de um cromatógrafo líquido de alta 
eficiência? 
As principais características da CLAE incluem alta eficiência, versatilidade, sensibilidade e 
seletividade. Ela oferece vantagens como velocidade, capacidade analítica e possibilidade de 
automação e limitações como necessidade de conhecimento e otimização, e sensibilidade à pressão. 
No entanto, é necessário cuidado na otimização das condições cromatográficas, manutenção do 
equipamento e seleção adequada de colunas. Além disso, é importante seguir os procedimentos 
corretos de preparação de amostras, realizar análises de controle de qualidade e garantir o treinamento 
adequadodos operadores 
 
 
25) Assinale a opção que se refere à característica que um método analítico tem de avaliar um dos 
componentes de uma dada amostra sem sofrer a interferência dos demais componentes dessa matriz. 
A) repetitividade 
B) precisão 
C) seletividade 
D) linearidade 
E) reprodutibilidade 
 
26) Com relação à cromatografia líquida, assinale a opção correta. 
a) Na chamada cromatografia com fase reversa, a fase estacionária é polar e a fase móvel é não 
polar. 
b) Em alguns aspectos, a cromatografia líquida de alta eficiência é mais versátil do que a 
cromatografia gasosa, por não estar limitada a amostras voláteis e termicamente estáveis. 
c) A escolha de solventes na cromatografia líquida exerce um papel secundário, enquanto o 
controle de temperatura é fundamental nas separações com o uso dessa técnica. 
d) Essa técnica apresenta separações rápidas, porém baixa resolução. 
e) Apresenta medidas qualitativas precisas e medidas quantitativas não precisas. 
 
27) Acerca da cromatografia líquida de exclusão por volume, assinale a opção correta. 
a) Entre os seus principais usos, destaca-se a separação entre moléculas volumosas e moléculas 
menores. 
b) As separações de espécies solúveis em água com solventes aquosos são denominadas 
cromatografia com permeação em gel. 
c) Nessa técnica, a separação ocorre pela interação molecular entre o soluto e a fase estacionária. 
d) As fases estacionárias utilizadas nessa técnica são partículas à base de sílica. 
e) Não é indicada para a separação de materiais poliméricos. 
 
28) Uma amostra contém os quatro compostos a seguir. O composto que não poderá ser identificado 
por CLAE com detecção por ultravioleta é: 
 
a) I 
b) II 
c) III 
d) IV 
 
29) De acordo com a técnica de CLAE, é correto o uso de: 
a) ultrassom para promover desgaseificação de solventes 
b) bombas peristálticas para promoverem um fluxo pulsado e de baixa pressão 
c) solventes com pureza analítica (P.A.) para impedir a contaminação da amostra 
d) colunas mais longas do que as utilizadas na cromatografia gasosa para separar melhor as 
substâncias 
 
30. Indique a função de cada uma das partes que compõem um cromatógrafo líquido de alta eficiência 
ilustrados na figura abaixo: 
 
Fase móvel: A fase móvel é impulsionada pela bomba para se deslocar através do sistema 
cromatográfico. 
Bomba: A bomba é responsável por acompanhar a fase móvel ao longo do sistema 
cromatográfico, permitindo que ela se misture com a amostra na coluna. 
Injeção da amostra: O injetor da amostra é usado para introduzir a amostra no sistema 
cromatográfico, onde seus constituintes serão separados dentro da coluna. 
Coluna cromatográfica: A coluna é onde ocorre a separação dos componentes da amostra 
com base nas temporariamente entre a fase móvel, fase estacionária e os componentes 
analisados. 
Detector: O detector monitora as mudanças na fase móvel durante a separação 
cromatográfica. Ele detecta propriedades físicas específicas dos componentes, convertendo 
testes de variações em sinais elétricos que são enviados para o software de análise. 
Resíduos: É o local onde a fase móvel que passou pelo detector é descartada, uma vez que 
não possui mais utilidade para a análise 
 
 
31. Qual a importância da CLAE para a indústria farmacêutica? 
A CLAE desempenha um papel crucial na indústria farmacêutica, auxiliando no controle de 
qualidade, identificação de impurezas, avaliação de estabilidade, desenvolvimento de métodos 
analíticos e controle de processo. Ela contribui para a garantia da qualidade e segurança dos 
medicamentos produzidos, além de atender aos requisitos regulatórios e normas da indústria. 
32. Considerando o cromatograma por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) abaixo 
apresentado indique a ordem de eluição dos compostos. 
 
 
33. O alargamento dos picos é algo rotineiro na cromatografia líquida, quais os termos que estão 
relacionados com o alargamento? Defina-os com a equação matemática. 
Dispersão Longitudinal (DL): a dispersão longitudinal refere-se ao alargamento do pico ao longo 
da direção do fluxo, ou seja, ao longo do tempo de retenção. É causada por diferenças na 
velocidade de migração das moléculas dentro da coluna e pode ser expressa pela seguinte 
equação: 
DL = A * t 
Dispersão Transversal (DT): A dispersão transversal refere-se ao alargamento do pico na 
direção perpendicular ao fluxo, ou seja, em termos de largura do pico. É causada por diferenças 
na trajetória das moléculas dentro da coluna, incluindo a difusão molecular e os efeitos de 
diferenças na velocidade de fluxo. Pode ser expressa pela seguinte equação: 
DT = B * u^0.5 
34. A separação cromatográfica é regida principalmente pelos fenômenos de adsorção, partição e 
exclusão por tamanho molecular, qual a diferença entre esses fenômenos? 
A adsorção ocorre devido a interações seletivas entre os analitos e a fase estacionária sólida, 
a partição é baseada na diferença de afinidade dos analitos entre a fase móvel e a fase 
estacionária líquida ou polimérica, e a exclusão por tamanho molecular separa os analitos com 
base em seus tamanhos moleculares através de uma matriz porosa. Cada um desses 
fenômenos oferece mecanismos de separação distintos e é utilizado em diferentes tipos de 
cromatografia, dependendo das propriedades dos analitos e da aplicação específica. 
 
35. Defina as principais características que os detectores precisam ter. 
Sensibilidade: Os detectores devem ser capazes de detectar e quantificar analitos em 
concentrações muito baixas. 
Ampla faixa dinâmica: Os detectores devem ser capazes de lidar com uma ampla faixa de 
concentrações de analito, desde concentrações muito baixas até concentrações elevadas. 
Seletividade: Os detectores devem ser seletivos para o analito de interesse, evitando a 
interferência de outros componentes da amostra 
Linearidade: Os detectores devem ter uma resposta linear em relação à concentração do 
analito. 
Rapidez de resposta: Os detectores devem ter uma resposta rápida, ou seja, ser capazes de 
registrar alterações na concentração do analito em tempo real. 
Estabilidade: Os detectores devem ser estáveis ao longo do tempo, mantendo uma resposta 
consistente e reproduzível. 
 
36. 
 
 
A separação eficiente dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos pireno e criseno (ver estruturas 
acima) deve ser feita por cromatografia líquida de alta eficiência, usando uma coluna de 
(a) fase estacionária reversa 
(b) fase estacionária de exclusão de tamanho 
(c) fase estacionária de troca iônica 
(d) coluna para osmose reversa 
(e) tubo capilar aberto 
 
37. Na Cromatografia há um método em que a fase estacionária não é polar, e a fase móvel é polar. 
Neste método a ordem de eluição ocorre com os solutos polares sendo eluídos antes dos solutos não-
polares. Trata-se da: 
a) cromatografia com fase reversa. 
b) cromatografia líquido-líquido normal. 
c) cromatografia de troca iônica. 
d) cromatografia de exclusão por volume. 
e) cromatografia em camada delgada. 
 
38. Na Cromatografia Líquida de alta eficiência, pode-se utilizar, durante a eluição da fase móvel, um 
único solvente ou uma mistura de solventes que permanece constante durante todo o processo. Trata-
se da: 
a) eluição isocrática 
b) eluição por gradiente 
c) eluição apolar 
d) eluição polar 
e) eluição saturada 
 
39) A maior vantagem do desenvolvimento de um método para um estudo de bioequivalência por 
cromatografia líquida acoplada a espectometria de massas ao invés da cromatografia líquida acoplada 
ao detector de ultravioleta é: 
(a) diferenciar estereoisômeros. 
(b) os analitos não necessitam possuir cromóforo. 
(c) não necessita de estudos de estabilidade na validação. 
(d) não necessita de curva de calibração em cada corrida analítica. 
(e) não necessita de controles de qualidade em cada corrida analítica.40) O sucesso de uma análise cromatográfica depende, fundamentalmente, da coluna escolhida 
conforme a natureza das substâncias que se deseja determinar. As colunas de fase reversa são as 
mais utilizadas na separação por CLAE. Não é correto afirmar, sobre as colunas de fase reversa, que: 
(a) são colunas de fase ligada. 
(b) a retenção pode ser aumentada, reduzindo a polaridade da fase móvel. 
(c) a polaridade da fase móvel utilizada é alta. 
(d) a amostra mais polar, elui mais rapidamente. 
(e) as do tipo C18, C8 e C2 são exemplos.