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<p>Atividade do Estudante Enzimas de Restrição: Tesouras de DNA 11 32 Leitura Básica EcoRI 1/5541 Os estudos de engenharia genética são possíveis devido à existência de uma classe especial de enzimas que cortam Pvul 4916 o DNA. Essas enzimas são chamadas de enzimas de restrição ou endonucleases de restrição. As enzimas de restrição são Eagl 942 proteínas produzidas por bactérias para prevenir ou res- tringir a invasão de um DNA Elas atuam como tesouras de DNA, cortando o DNA invasor em diversos YIP5 fragmentos sem função. As enzimas de restrição reconhecem e cortam posi- ções específicas ao longo da molécula de DNA, nos cha- mados sítios de restrição. Cada enzima de restrição (e elas Apal 2035 são centenas, produzidas por diversas bactérias) tem seu próprio sítio de reconhecimento. Em geral, um sítio de 3247 restrição é formado por uma de 4 a 6 pares de 2540 bases, chamados de palíndrome (ou seqüência palindrô- mica). Uma palíndrome de DNA é uma na qual FIGURA 13.1 Mapa de restrição do YIP5, um de 5.541 a fita superior, lida de 5' para 3', é igual à da pares de bases. o número após cada nome de enzima de restrição indica em qual par de base DNA é cortado pela enzima. fita inferior, lida de 5'para Por exemplo, 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' A EcoRI cliva em sítios que não estão perfeitamen- é uma palindrômica de DNA. Para verificar isto, te alinhados na molécula de DNA. Quando a EcoRI cli- leia a da fita superior e da fita inferior da extre- va uma molécula de DNA, ela deixa "caudas" de fita midade 5' para a extremidade Esta também simples nos novos terminais (veja exemplo anterior) corresponde ao sítio de restrição da enzima de restrição Este tipo de terminação é chamado de "extremidades EcoRI. O nome EcoRI vem da bactéria na qual esta enzima coesivas", pois se liga facilmente à sua coesiva comple- foi descoberta: Escherichia coli cepa RY 13 (EcoR), e I, mentar. Nem todas as enzimas de restrição produzem porque esta foi a primeira enzima de restrição encontra- finais coesivos; algumas cortam as duas fitas de DNA da neste organismo. sobre um mesmo eixo, de forma alinhada, produzindo A EcoRI cliva cada fita do DNA entre as bases G e A uma extremidade "cega" (ver adiante). Depois que as clivagens são feitas, o DNA Quando os cientistas estudam uma de permanece unido apenas por pontes de hidrogênio en- DNA, uma das primeiras coisas que fazem é determinar tre as quatro bases do meio. Como as pontes de hidrogê- os vários sítios de restrição deste DNA. Eles então cons- nio são ligações fracas, o DNA se separa. troem um mapa de restrição, mostrando a localização dos sítios de clivagem para as diferentes enzimas. Esses mapas são utilizados como um mapa da molécula de DNA. Um Sítios de clivagem: 5' GAATTC 3' exemplo de mapa de restrição de um plasmídeo é mos- 3' CTTAAG 5' trado na Figura 11.1. Os sítios de restrição de várias destas enzimas, com DNA clivado: AATTC 3' seus sítios de clivagem, são mostrados na próxima pági- 3' CTTAA na. 168 / HELEN KREUZER & ADRIANNE MASSEY</p><p>4. Simule a atividade da HindIII com a tira 3. Estas ex- EcoRI: 5' GAATTC 3' HindIII: 5' AAGCTT 3' tremidades são cegas ou coesivas? Marque as novas 3' CTTAAG 5' 3' TTCGAA 5' extremidades geradas pela clivagem com HindIII e guarde os fragmentos. 5. Repita o procedimento mais uma vez com a tira 4, simulando novamente a clivagem com EcoRI. BamHI: 5' GGATCC 3' 5' AGCT 3' 6. Pegue a "extremidade inicial" do fragmento de DNA 3' CCTAGG 5' 3' TCGA 5' da tira 4 (um fragmento de EcoRI) e a "extremidade final" do fragmento obtido pela enzima HindIII a partir da tira 3. Ambos os fragmentos têm caudas simples fita de quatro bases. Escreva as Smal: 5' CCCGGG 3' Hbal: 5' GCGC 3' de bases das duas extremidades, identifique-as como 3' GGGCCC 5' 3' CGCG 5' EcoRI e HindIII. Identifique as extremidades 5' e 3' As de bases de HindIII e EcoRI têm cau- das complementares? 7. Deixe de lado o fragmento de HindIII e pegue a ex- Quais destas enzimas deixarão extremidades cegas? tremidade final do fragmento de DNA da tira 1 (cor- Quais deixarão extremidades coesivas? Tome como refe- tada com EcoRI). Compare as caudas simples fita do rência esta lista de sítios de clivagem das enzimas quando fragmento de EcoRI da tira 1 e do fragmento de Eco- realizar suas atividades. RI da tira 4. Escreva as de bases das cau- das simples fita e identifique as extremidades 5' e 3' Elas são complementares? Exercícios e Questões 8. Imagine que você cortou um fragmento de DNA completamente desconhecido com EcoRI. Você acha Exercício 1 que as caudas simples fita desses fragmentos pode- riam ser complementares às caudas simples fita dos Corte as tiras da seqüência de DNA (Apêndice A) ao lon- fragmentos da tira 1 e da tira 4? go de suas bordas. Estas fitas representam as 9. Uma enzima chamada DNA ligase refaz ligações fos- de DNA dupla fita. Cada cadeia de letras representa fodiéster entre nucleotídeos. Para a DNA ligase agir, esqueleto e as linhas verticais entre os pares de dois nucleotídeos precisam aproximar-se na orienta- bases representam as pontes de hidrogênio entre as bases. ção apropriada para a ligação (a extremidade 5' deve estar próximo à extremidade 3' do outro). Você acha 1. Agora você vai simular a atividade da enzima EcoRI. que seria mais fácil para a DNA ligase religar dois frag- Procure ao longo da da fita de DNA (tira mentos cortados por EcoRI ou um fragmento cortado 1) sítio de restrição da EcoRI (tome com referên- por EcoRI e outro cortado por HindIII? Por que razão? cia a lista antes citada para saber a Faça cortes no esqueleto cortando exatamen- Exercício 2 te entre o G e o primeiro A do sítio de restrição em ambas as fitas. Não corte toda a fita. Lembre-se de A Figura 11.1 mostra o mapa de restrição do plasmídeo que a EcoRI corta esqueleto de cada fita do DNA circular YIP5. Esse plasmídeo contém 5.541 pares de ba- em um ponto diferente. Existe um sítio para EcoRI no par de base 1. A localiza- 2. Agora, separe as pontes de hidrogênio entre os ção dos outros sítios de restrição é mostrada no mapa. Os tios de clivagem, cortando as linhas verticais. Separe números após os nomes das enzimas indicam em qual par as duas porções de DNA. Observe os novos termi- de base aquela enzima cliva DNA. Se você digerir o YIP5 nais de DNA produzidos pela EcoRI. Eles são coesi- com EcoRI, você obterá um fragmento de DNA linear de vos ou cegos? Escreva EcoRI nos terminais. Guarde 5.541 pares de bases de comprimento. os fragmentos cortados na sua mesa. 10. Quais seriam os produtos de uma digestão com as 3. Repita o procedimento com a tira 2, desta vez simulan- enzimas EcoRI e do a atividade da Smal. Encontre sítio da Smal e cor- 11. Quais seriam os produtos de uma digestão com as te esqueleto nos sítios de clivagem antes enzimas HindIII e Apal? indicados. Há alguma ponte de hidrogênio entre os 12. Quais seriam os produtos de uma digestão com as sítios de corte? As novas extremidades são cegas ou enzimas HindIII, Apal e coesivas? Marque os novos terminais da clivagem com 13. Se você pegar os produtos da digestão da Questão e guarde os fragmentos de DNA na sua mesa. 10 e digeri-los com quais seriam os produtos? ENGENHARIA GENÉTICA E BIOTECNOLOGIA / 169</p><p>Fitas de de DNA para: Tesouras de DNA 1 1 5 3 3 2 2 5 -ATACGCCCGGGTTCTAAA- 3 I 3 3 3 5 CAGGATCGAAGCTTATGC- 3 3 -GTCCTAGCTTCGAATACG-5 4 4 5 - - 3 3 ENGENHARIA E BIOTECNOLOGIA / 359</p>