3 - Estrutura e replicação do DNA

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Adriano Negrão Zingra
 RESUMO GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
Assunto: Estrutura do DNA e replicação
Introdução
· A vida depende da capacidade das células em armazenar, recuperar e traduzir as instruções genéticas necessárias para produzir e manter o organismo vivo.
· Genes – os elementos que contêm as informações que determinam as características de uma espécie como um todo e de cada indivíduo.
· Informação genética consisti, principalmente, em instruções para a produção de proteínas.
· As proteínas são macromoléculas que realizam a maioria das funções celulares, atuam como blocos na formação das estruturas celulares, formam as enzimas que catalisam todas as reações químicas celulares, regulam a expressão gênica e permitem que as células se movam e se comuniquem umas com as outras.
· O ácido desoxirribonucleico (DNA) é, provavelmente, o portador da informação genética.
A ESTRUTURA E A FUNÇÃO DO DNA
· DNA contém a informação hereditária das células e que as proteínas que compõem os cromossomos atuam principalmente para compactar e controlar essas enormes moléculas de DNA.
· A molécula de DNA consiste em duas cadeias nucleotídicas complementares:
1. Cada uma dessas cadeias de DNA ou fitas de DNA é composta de quatro tipos de subunidades de nucleotídeos unidas por pontes de hidrogênio entre as bases dos nucleotídeos.
2. Os nucleotídeos são compostos por um açúcar de cinco carbonos, mais grupos fosfato e uma base contendo nitrogênio.
3. Nos casos dos nucleotídeos no DNA, o açúcar é uma desoxirribose e a base pode ser uma adenina (A), citosina (C), guanina (G) ou timina (T).
4. A forma pela qual as subunidades nucleotídicas são unidas fornece à fita de DNA uma polaridade química.
5. As duas extremidades da cadeia são facilmente distinguíveis, pois uma possui a depressão (hidroxila 3’), e a outra, a protuberância (fosfato 5’).
6. Essa polaridade da cadeia de DNA é indicada como extremidade 3’ e extremidade 5.
7. 
8. A sempre pareia com T, e C sempre pareia com G.
9. Esses pares purina-pirimidina são denominados pares de bases, e esta complementaridade de pareamento de bases permite que eles sejam compactados em um arranjo mais favorável energeticamente no interior da fita dupla.
10. As duas hélices são antiparalelas, isto é, elas são orientadas com as polaridades opostas.
11. Uma consequência desses requisitos para o pareamento das bases é que cada molécula de DNA contenha uma sequência de nucleotídeos que é exatamente complementar à sequência nucleotídica da fita antiparalela.
· A estrutura do DNA fornece um mecanismo para a hereditariedade
1. O DNA codifica a informação na ordem ou sequência de nucleotídeos ao longo de cada fita.
2. Cada base – A, C, T ou G – pode ser considerada como uma letra em um alfabeto de quatro letras que é usado para escrever as mensagens biológicas na estrutura química do DNA.
3. O código genético pode ser descrito no processo de expressão genica, pelo qual uma célula transcreve a sequência de nucleotídeos de um gene em uma molécula de RNA e então traduz essa informação na sequência de aminoácidos de uma proteína.
4. A série completa de informações no DNA de um organismo é denominada genoma (o termo é também usado para se referir ao DNA que carrega essa informação).
REPLICAÇÃO DO DNA
O pareamento de bases permite a replicação do DNA
· Cada fita pode servir de molde, ou modelo, para a síntese de uma nova fita complementar.
· A informação genética contida no DNA pode ser copiada com precisão por um processo, no qual a fita S é separada da fita S’ e cada uma atua, separadamente, como molde para a produção de uma nova fita complementar, idêntica à fita complementar original.
· Esse feito é realizado por um grupo de proteínas que juntas formam uma máquina de replicação.
· A replicação do DNA produz duas duplas-hélices completas a partir da molécula original de DNA, cada hélice nova de DNA possui a sequência de nucleotídeos idêntica (exceto pelos raros erros) à dupla-hélice de DNA original
· Como cada fita de DNA original atua com um molde para uma nova fita, cada uma das hélices-filhas de DNA é formada por uma fita original (existente) e outra completamente nova. 
· Esse modo de replicação é chamado de semiconservativo
A síntese de DNA inicia nas origens de replicação
· As duas fitas de DNA estão firmemente ligadas por um grande número de pontes de hidrogênio entre as bases presentes em ambas as fitas.
· Para ser utilizada como molde, a dupla-hélice deve ser primeiramente aberta, as duas fitas separadas para expor as bases não pareadas.
· Processo de replicação do DNA começa com proteínas iniciadoras que se ligam ao DNA e provocam a abertura das fitas, quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases.
· Os locais em que ocorre a abertura inicial das fitas de DNA são denominados origens de replicação e são geralmente caracterizados por uma sequência específica de nucleotídeos.
· Um segmento de DNA rico em pares de bases A -T é relativamente mais fácil de ser separado (Segmentos A-T possuem somente 2 ligações de hidrogênio diferentemente do segmento C-G que possui 3) e segmentos de pares A-T são normalmente encontrados nas origens de replicação.
· Um genoma bacteriano possui apenas uma origem de replicação, o genoma humano, que é muito maior, possui aproximadamente 10.000 dessas origens. 
· Em humanos, o início da replicação em vários locais ao mesmo tempo reduz enormemente o tempo necessário para que uma célula copie todo seu genoma.
· Quando uma proteína iniciadora se liga ao DNA na origem de replicação e provoca a abertura local da dupla-hélice um grupo de proteínas que realizam a replicação do DNA é atraído ao local.
A síntese de DNA novo ocorre nas forquilhas de replicação
· Durante o processo de replicação, estruturas com forma de Y podem ser vistas nas moléculas de DNA, denominadas forquilhas de replicação.
· Nessas forquilhas, a máquina de replicação se desloca sobre o DNA, causando a abertura das duas fitas da dupla-hélice e usando cada uma das fitas como um molde para produzir uma nova fita-filha.
· Duas forquilhas aparecem em cada origem de replicação e se afastam em direções diferentes abrindo a fita de DNA. Por esse motivo a replicação do DNA desse modo é dita bidirecional.
· No coração da máquina de replicação está a enzima DNA-polimerase, que sintetiza o DNA novo utilizando uma das fitas existentes como molde.
· Essa enzima catalisa a adição de nucleotídeos à extremidade 3’ de uma cadeia crescente de DNA pela formação da ligação fosfodiéster entre a extremidade 3’ e o grupo 5’-fosfato do nucleotídeo a ser incorporado.
· Os nucleotídeos entram na reação inicialmente como trifosfatos de nucleosídeo que fornecem energia para a polimerização.
· A hidrólise de uma ligação de alta energia do trifosfato de nucleosídeo fornece a energia para a reação que liga um monômero nucleotídico à cadeia e libera pirofosfato (PPi ).
· A DNA-polimerase acopla a liberação dessa energia à reação de polimerização.
· O pirofosfato é ainda hidrolisado a fosfato inorgânico (Pi ), tornando a reação de polimerização irreversível.
· A DNA-polimerase não se dissocia do DNA cada vez que adiciona um novo nucleotídeo na cadeia crescente, ela permanece e adiciona outros nucleotídeos.
A forquilha de replicação é assimétrica
· A direção 5’-3’ do mecanismo de polimerização do DNA impõe um problema para a forquilha de replicação.
· Na forquilha de replicação, uma fita nova de DNA é sintetizada sobre um molde com uma orientação (3’-5’), e outra é sintetizada sobre um molde com orientação oposta (5’-3’). Portanto ela é assimétrica.
· A DNA-polimerase so pode catalisar o crescimento da cadeia de DNA em uma única direção; a adição de novas subunidades só pode ocorrer na extremidade 3’ da cadeia.
· Esse problema de assimetria é resolvido por uma manobra de “costurar para tras”.
· A fita de DNA cuja extremidade 5’ deve crescer é produzida de modo descontínuo, em pequenos segmentos sucessivos, na qual a DNA-polimerase polimeriza para trás em relação ao movimento da forquilha, na direção 5’-3’ em cadanovo segmento.
· Esses pequenos segmentos de DNA – chamados de fragmentos de Okazaki - são unidos mais tarde, formando uma fita nova contínua.
· A fita de DNA sintetizada de modo descontínuo é chamada de fita retardada; a outra fita, sintetizada de modo contínuo, é chamada de fita-líder.
A DNA-polimerase é autocorretiva
· Pares, menos estáveis – como G-T e C-A, por exemplo – podem ser formados.
· Esses pareamentos incorretos são formados com muito menos frequência comparados aos corretos, mas, se permanecessem no DNA, matariam a célula pelo acúmulo de mutações.
· A polimerase monitora cuidadosamente o pareamento de bases entre cada nucleotídeo a ser incorporado e a fita-molde.
· A DNA-polimerase catalisa a reação de adição apenas quando o pareamento está correto.
· Quando a DNA-polimerase produz um erro raro e adiciona um nucleotídeo incorreto, ela pode verificar o erro por uma atividade chamada de correção de erros (proofreading).
· Antes de adicionar um próximo nucleotídeo à cadeia crescente de DNA, a enzima verifica se o nucleotídeo inserido anteriormente está pareado de forma correta à fita-molde.
Pequenos segmentos de RNA atuam como iniciadores na síntese de DNA
· A DNA polimerase não pode iniciar a síntese de uma molécula de DNA completamente nova.
· Uma enzima diferente é necessária – uma capaz de começar uma nova cadeia polinucleotídica simplesmente pela junção de dois nucleotídeos sem a necessidade de uma extremidade pareada.
· Ela produz pequenos segmentos de um tipo de ácido nucleico intimamente relacionado – RNA (ácido ribonucleico) – usando a fita de DNA como molde.
· Esse pequeno segmento de RNA, com cerca de 10 nucleotídeos, é pareado à fita-molde e fornece a extremidade 3’ pareada como ponto de início para a DNA-polimerase.
· Portanto, atua como um iniciador (primer) para a síntese de DNA, e a enzima que sintetiza o iniciador de RNA é denominada primase.
· Uma fita de RNA é muito semelhante quimicamente a uma fita única de DNA, com a exceção de ser formada por subunidades de ribonucleotídeos, na qual o açúcar é a ribose, e não a desoxirribose;
· O RNA também difere do DNA por conter a base uracila (U), em vez da timina (T)
· Na fita líder apenas um iniciador de RNA é necessário, mas na fita retardada são necessários vários iniciadores a medida que o movimento da forquilha de replicação expõe um novo segmento de pares de bases não pareadas um novo iniciador é produzido em intervalos de fita retardada.
· A DNA-polimerase adiciona um desoxirribonucleotídeo à extremidade 3’ desse iniciador para começar uma fita de DNA.
· 3 enzimas são necessárias para ligar os vários segmentos da fita descontinua:
1. Nuclease degrada o iniciador de RNA
2. DNA-polimerase chamada de polimerase de reparo substitui o RNA por DNA.
3. DNA-ligase une a extremidade 5’- fosfato de um fragmento novo de DNA à extremidade 3’–OH do próximo.
As proteínas se associam na forquilha de replicação, formando uma máquina de replicação
· Dois tipos de proteínas de replicação – DNA-helicases e proteína ligadora de fitas simples – se associam para abrir a frenda da forquilha de replicação, de modo que os desoxirribonucleosideos possam ser pareados com a fita molde.
· Helicase, uma proteína que utiliza energia da hidrólise do ATP para separar a dupla-hélice à medida que se desloca sobre o DNA.
· A proteína ligadora de fita simples se liga ao DNA de fita simples exposto pela helicase, evitando temporariamente o repareamento de bases e mantendo a fita alongada para que possa atuar como molde para a DNA-polimerase.
· Uma proteína adicional da replicação, chamada de grampo deslizante, mantém a DNA-polimerase firmemente ligada ao DNA-molde enquanto sintetiza novas fitas de DNA.
· A montagem desse grampo em volta do DNA necessita da atividade de uma proteína adicional de replicação, o montador do grampo.
· Essa montagem deve ocorrer apenas uma vez por ciclo de replicação na fita-líder; na fita retardada, porém, o grampo é removido e recolocado cada vez que um novo fragmento de Okazaki é produzido.
A telomerase replica as extremidades dos cromossomos eucarióticos
· Quando a forquilha de replicação se aproxima da extremidade de um cromossomo, a máquina de replicação encontra um grave problema: não há como colocar o iniciador de RNA necessário para iniciar um fragmento de Okazaki na extremidade de uma molécula de DNA linear.
· Sequências de DNA telomérico atraem uma enzima chamada de telomerase ao cromossomo.
· Usando um molde de RNA que é parte da própria enzima, a telomerase recoloca os nucleotídeos perdidos cada vez que um cromossomo é duplicado.
· Permitindo que a replicação da fita retardada seja completada pela replicação convencional.
Modulação da compactação:
· Heterocromatina é o filamento mais condensado, região mais escura.
· A Eurocromatina é o filamento mais frouxo, consiste no Dna ativo, e é a parte mais clara. Menos condensado.
· A heterocromatina pode se expressar em dois tipos:
1. Heterocromatina constitutiva, que nunca se expressa como proteínas e que se encontra localizada à volta do centrómero (contém geralmente sequências repetitivas);
2. Heterocromatina facultativa, que, por vezes, é transcrita em outros tipos celulares, consequentemente a sua quantidade varia dependendo da atividade transcricional da célula. Apresenta condensada na interfase.
· Na acetilação e desacetilação de histona, as histonas são acetiladas e deacetiladas em resíduos de lisina na ramificação N-terminal como parte da regulação genética.
· Tipicamente, estas reações são catalisadas por enzimas com atividade "histona acetiltransferase" (HAT) ou "histona desacetilase" (HDAC ou HD).
· A acetilação das histonas diminui as interações a interação das terminações N das histonas com os grupos fosfato negativamente carregados do DNA. Como consequência a cromatina fica mais relaxada e descondensada, associada com maiores níveis de transcrição de genes. 
· Este relaxamento pode ser revertido pela atividade HDAC (desacetilase). Relaxada, o DNA transcricionalmente ativo é relacionado à eucromatina.
· A condensação pode ser conduzida por processos incluindo desacetilação e metilação; a ação de metilação é indireta e não tem efeito sobre a carga.
· A regulação genica da replicação depende do quanto a cromatina está descondensada.
Resolvendo o problema do enrolamento do DNA: Topoisomerases
· topoisomerase ou DNA topoisomerase é uma enzima que desempenha importante papel nos processos de replicação e empacotamento de DNA.
· Ela catalisa uma quebra nas moléculas de DNA, mas usa ligações covalentes para segurar as moléculas de DNA que foram quebradas.
· Esta enzima evita que a dupla hélice de DNA à frente do garfo de replicação torne-se muito estreitamente enrolada à medida que o DNA é aberto. 
· Ela age fazendo cortes temporários na hélice para liberar tensão, depois fecha os cortes para evitar dano permanente.
· Existem dois tipos de topoisomerases, são elas:
1. Topoisomerase I - Produz quebras numa cadeia do DNA e permite o giro da cadeia quebrada sobre a cadeia intacta. A topoisomerase I conserva a energia do rompimento da ligação fosfodiéster, depois ela utiliza essa energia para restaurar a ligação fosfodiéster e selar a quebra. Algumas topoisomerases I podem relaxar superespiralamentos positivos e negativos no DNA.
2. Topoisomerase II - Produz quebras nas duas cadeias do DNA. Ela quebra as duas cadeias de DNA ao mesmo tempo e pode introduzir ou retirar superespiras, duas de cada vez, em um mecanismo que é dependente de ATP. Ela corta as duas cadeias de DNA, prendem-se às extremidades através de ligações covalentes, passa a dupla cadeia através do corte e sela a quebra.
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