PDF Aula - 13-05-2024

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<p>CONTROLE DE QUALIDADE</p><p>MICROBIOLÓGICO</p><p>Profa. Luiza Carolina França Opretzka</p><p>UNIDADE 3</p><p>Pirogênios e toxicidade de microrganismos</p><p>Pirogênios in vitro</p><p>Pirogênios in vivo</p><p>Toxicidade</p><p>▪O que são pirogênios?</p><p>Pirogênio é uma substância que, quando administrada em um ser vivo,</p><p>induz ao aumento da temperatura corporal.</p><p>PIROGÊNIOS</p><p>Centro termorregulador</p><p>do hipotálamo</p><p>▪O que são pirogênios?</p><p>Pirogênio é uma substância que, quando administrada em um ser vivo,</p><p>induz ao aumento da temperatura corporal.</p><p>PIROGÊNIOS</p><p>Endógenos Exógenos</p><p>Mediadores primários:</p><p>Citocinas</p><p>IL-1 e IL-6, TNF, IFN</p><p>Prostaglandina</p><p>Origem fora do corpo:</p><p>Bactérias, fungos, vírus, alguns</p><p>fármacos, e frações do plasma</p><p>Endotoxinas bacterianas (LPS)</p><p>▪O que são pirogênios?</p><p>Pirogênio é uma substância que, quando administrada em um ser vivo,</p><p>induz ao aumento da temperatura corporal.</p><p>PIROGÊNIOS</p><p>Endógenos Exógenos</p><p>Mediadores primários:</p><p>Citocinas</p><p>IL-1 e IL-6, TNF, IFN</p><p>Prostaglandina</p><p>Origem fora do corpo:</p><p>Bactérias, fungos, vírus, alguns</p><p>fármacos, e frações do plasma</p><p>Endotoxinas bacterianas (LPS)</p><p>PIROGÊNIOS</p><p>PROPRIEDADE DOS PIROGÊNIOS:</p><p>▪ Hidrossolúveis</p><p>▪ Arrastáveis por vapor de água</p><p>▪ Termoestáveis: inativação a 250 ºC/1h</p><p>▪ Adsorvíveis</p><p>▪ Filtráveis (Moléculas agregadas de LPS</p><p>tem PM > 300.000 Daltons)</p><p>ORIGEM DOS PIROGÊNIOS EM</p><p>PREPARAÇÕES ESTÉREIS:</p><p>▪ Matérias-primas</p><p>▪ Veículo</p><p>▪ Material utilizado na preparação</p><p>▪ Embalagem</p><p>▪É possível remover os pirogênios?</p><p>▪ Inativação (hidrólise ácida/alcalina, oxidação/alquilação ou calor seco).</p><p>▪ Tratamento químico que proporcione a quebra de ligações da molécula de LPS ou</p><p>bloqueie os sítios necessários para a atividade pirogênica</p><p>▪Remoção das endotoxinas bacterianas (destilação, ultrafiltração, osmose</p><p>reversa, atração eletrostática e atração por membrana hidrófoba).</p><p>▪ Diferentes métodos, baseados nas características do LPS, como tamanho, peso</p><p>molecular, carga eletrostática ou afinidade do LPS com diferentes superfícies.</p><p>PIROGÊNIOS</p><p>▪Por que é importante controlar os pirogênios em produtos de saúde?</p><p>Febre → Choque → Óbito</p><p>▪Em quais produtos é importante controlar os pirogênios?</p><p>Todos os injetáveis, acessórios para transfusão, infusão e todos os dispositivos</p><p>implantáveis ou descartáveis empregados em terapia parenteral</p><p>A detecção/quantificação de endotoxinas bacterianas em produtos</p><p>farmacêuticos e biológicos pode ser realizada empregando-se</p><p>métodos in vivo ou in vitro.</p><p>PIROGÊNIOS</p><p>▪OBJETIVO: limitar a um nível aceitável os riscos de reação febril no</p><p>paciente após à administração intravenosa (ou intratecal) do</p><p>produto farmacêutico.</p><p>▪FUNDAMENTO: Mede-se o aumento da temperatura de coelhos após</p><p>a injeção intravenosa de uma solução de teste.</p><p>▪Coelho → apresentam sistema termorregulador com características</p><p>semelhantes ao do ser humano</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>1 - SELEÇÃO DOS ANIMAIS:</p><p>▪Coelhos de mesmo sexo, adultos, sadios, mesma raça.</p><p>▪Orelhas bem desenvolvidas (Tipo Nova Zelândia)</p><p>▪Peso corporal mínimo: 1,5 Kg</p><p>▪Manter os animais em gaiolas em sala a 20±3º C.</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>2 - ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS:</p><p>▪ 7 dias antes do ensaio.</p><p>▪ Simular administração da amostra com solução fisiológica estéril no mesmo</p><p>volume → veia marginal da orelha.</p><p>▪ Verificar a temperatura pelo menos 1 vez ao dia.</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>2 - ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS: Inclusão/exclusão de animais</p><p>▪ Elevação de ≥ 0,5 ºC em relação à temperatura inicial → descartados.</p><p>▪ Temperatura ≥ 39,8 ºC → descartados.</p><p>▪ Selecionar grupos de teste com variação de no máximo 1 ºC entre os animais.</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>▪3 - PREPARO DA AMOSTRA:</p><p>▪ Vidrarias e outros materiais devem ser despirogenizados/ material apirogênico</p><p>descartável.</p><p>▪ Soluções estéreis e apirogênicas.</p><p>▪ Volume: 0,5 a 10 mL/kg do animal da solução da amostra.</p><p>▪ A concentração da solução é a especificada na monografia do produto.</p><p>▪ Solução aquecida a 37±2ºC antes de injetar e velocidade de 4 a 6 mL/min.</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>▪3 - ENSAIO:</p><p>▪ 3 animais → SE RETESTE: + 5 animais.</p><p>▪ Jejum de 2h antes e durante o ensaio/ acesso à água livre</p><p>▪ Dispositivo de registro de temperatura ou termômetros com precisão de ±0,1ºC</p><p>são inseridos no reto dos animais (±6cm).</p><p>▪ Registrar a temperatura de cada animal (2 leituras) antes da injeção da amostra,</p><p>em intervalos de 30 minutos.</p><p>▪ Fazer a média das duas leituras (temperatura controle dos ensaios).</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>▪3 - ENSAIO:</p><p>▪ Injetar, pela veia marginal da orelha de 3 COELHOS, não menos que 0,5 mL e não</p><p>mais que 10 mL da solução por kg, ou a quantidade indicada na monografia.</p><p>▪ Registrar a temperatura de cada animal a cada 30 minutos, por 3 horas, após a</p><p>injeção.</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>Pirogênio endógeno:</p><p>após 3 horas ou mais</p><p>Pirogênio exógeno:</p><p>60 e 90 minutos</p><p>Efeito bifásico da febre</p><p>Falso-positivo</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>4 – INTERPRETAÇÃO:</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>1º etapa: 3 coelhos</p><p>Nenhum  temperatura ≥ 0,5ºC 1 ou mais  temperatura ≥ 0,5ºC</p><p>2ª etapa: 5 coelhos</p><p>Até 3  temperatura ≥ 0,5ºC |</p><p>Soma  temperatura  3,3ºC</p><p>Mais que 3  temperatura ≥ 0,5ºC |</p><p>Soma  temperatura ≥ 3,3ºC</p><p>OBS: Não considerar os decréscimos de temperatura</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>4 - INTERPRETAÇÃO:</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>COELHO T basal T1 T2 T3 VARIAÇÃO</p><p>1 38,5 37,8 38,5 38,9 0,4 °C</p><p>2 39,0 39,3 39,0 39,2 0,3 °C</p><p>3 39,3 39,7 40,0 39,4 0,7 °C</p><p>1ª rodada</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>4 - INTERPRETAÇÃO:</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>COELHO T°C T1 T2 T3 VARIAÇÃO</p><p>1 38,5 37,8 38,5 38,9 0,4</p><p>2 39,0 39,3 39,0 39,2 0,3</p><p>3 39,3 39,7 40,0 39,4 0,7</p><p>4 39,0 39,3 39,4 39,3 0,4</p><p>5 39,1 39,0 39,2 39,2 0,1</p><p>6 38,4 38,5 38,7 38,6 0,3</p><p>7 38,7 38,5 39,0 39,3 0,6</p><p>8 38,9 39,1 39,0 39,1 0,2</p><p>SOMA 3,0</p><p>2ª rodada</p><p>PRODUTO CUMPRE O TESTE se, no máximo,</p><p>3 dos 8 coelhos apresentarem</p><p>aumentos individuais de</p><p>temperaruta ≥ 0,5 ºC, e se a soma</p><p>dos aumentos individuais de todos</p><p>os coelhos não exceder a 3,3 ºC.</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>5 – CONSIDERAÇÕES:</p><p>▪O método in vivo é qualitativo: indica a presença de pirogênios, mas</p><p>não permite a quantificação dos mesmos.</p><p>▪Os animais podem ser reutilizados, desde que respeitados os</p><p>períodos de descanso:</p><p>▪Teste negativo = descanso de 2 a 3 dias.</p><p>▪Teste positivo = descanso de 2 a 3 semanas para evitar tolerância.</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>5 – CONSIDERAÇÕES: CASOS EM QUE O TESTE NÃO SE APLICA</p><p>▪Fármacos antitérmicos.</p><p>▪Radiofármacos.</p><p>▪Fármacos hipnóticos;</p><p>▪Fármacos anestésicos;</p><p>▪Gluconato de cálcio;</p><p>▪Anfotericina e vancomicina.</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪PROCEDIMENTO</p><p>5 – CONSIDERAÇÕES:</p><p>PIROGÊNIOS IN VIVO</p><p>▪ Baixa sensibilidade;</p><p>▪ Custo elevado (manutenção do biotério);</p><p>▪ Interferências na resposta;</p><p>▪ Utilização de animais;</p><p>▪ Qualitativo.</p><p>▪ Reproduz resposta fisiopatológica.</p><p>▪ Detecta vários tipos de pirogênios.</p><p>VANTAGENS DESVANTAGENS</p><p>▪1956 - Morte de um caranguejo ferradura</p><p>americano Limulus polyphemus por coagulação intravascular.</p><p>▪1964 - Endotoxinas bacterianas coagulam a hemolinfa do Limulus.</p><p>▪Coagulação induzida por endotoxina → natureza enzimática.</p><p>▪Enzima presente nos amebócitos (único tipo de célula presente na</p><p>hemolinfa) do Limulus.</p><p>LAL: Lisado dos Amebócitos do Limulus</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>▪O reagente de LAL é um extrato aquoso de amebócitos, composto por</p><p>um conjunto de enzimas serino-proteases do tipo tripsina capaz de</p><p>reagir em cascata frente a pequenas quantidades de endotoxinas.</p><p>▪O teste de endotoxina bacteriana é usado para detectar ou</p><p>quantificar endotoxinas de bactérias gram negativas presentes em</p><p>amostras para qual o teste é preconizado.</p><p>▪A reação entre o lisado de amebócito e a endotoxina é dependente</p><p>da concentração de endotoxina, temperatura e pH.</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>▪FUNDAMENTO</p><p>Cascata de coagulação</p><p></p><p>produto final</p><p>(gel/coloração)</p><p></p><p>deteção</p><p>O que varia é o método de</p><p>detecção.</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>FB 6ª ed:</p><p>5.5.2.2 ENDOTOXINAS</p><p>BACTERIANAS</p><p>O teste in vitro só detecta endotoxinas bacterianas livres (não</p><p>agregadas)</p><p>▪ TIPOS DE METODOLOGIAS</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>Gel Clot (Ponto</p><p>Final)</p><p>Cromogênico -</p><p>Ponto Final</p><p>Cromogênico -</p><p>Cinético</p><p>Turbidimétrico</p><p>- Ponto Final</p><p>Turbidimétrico</p><p>- Cinético</p><p>▪ TIPOS DE METODOLOGIAS</p><p>▪Grupos teste:</p><p>▪Amostra</p><p>▪Amostra + Endotoxina</p><p>▪Endotoxina</p><p>▪Diluente</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>CONTROLE POSITIVO</p><p>PADRÃO</p><p>CONTROLE NEGATIVO</p><p>▪ TIPOS DE METODOLOGIAS</p><p>▪1 – GEL CLOT</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>BANHO-MARIA A 37ºC POR 1h GELIFICAÇÃO: POSITIVO</p><p>SEM GELIFICAÇÃO: NEGATIVO</p><p>ÁGUA PADRÃO</p><p>ÁGUA</p><p>REAGENTE</p><p>LAL</p><p>▪ TIPOS DE METODOLOGIAS</p><p>▪2 – CROMOGÊNICO</p><p>→ FUNDAMENTO:</p><p>▪ Intensidade da coloração é proporcional à</p><p>concentração de endotoxina</p><p>▪ Enzima de coagulação cliva ligações de peptídios</p><p>conjugada à p-nitroanilina → substância cromogênica</p><p>(amarela)</p><p>▪ Detecção: ponto final x cinético.</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>▪ TIPOS DE METODOLOGIAS</p><p>▪3 – TURBIDIMÉTRICO</p><p>→ FUNDAMENTO:</p><p>▪ Intensidade da turbidez é proporcional à</p><p>concentração de endotoxina</p><p>▪ O processo de gelificação aumenta continuamente a</p><p>turbidez do meio</p><p>▪ Detecção: ponto final x cinético.</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>▪ TIPOS DE METODOLOGIAS - COMPARAÇÃO</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>PONTO FINAL CINÉTICO</p><p>O resultado é lido num determinado momento após o</p><p>reagente que contém o lisado entrar em contato</p><p>com a amostra.</p><p>Escolhido na maioria dos casos em que o teste de LAL</p><p>precisa ser feito quantitativamente</p><p>Um único momento para realizar a medição: erros de</p><p>manipulação têm maior impacto</p><p>Leitura automatizada</p><p>necessidade de repetir todo o processo desde o</p><p>início, caso seja cometido algum erro que afete a</p><p>leitura</p><p>Um erro em um ponto de leitura errôneo não provoca</p><p>a necessidade de refazer toda a análise (descartar o</p><p>ponto)</p><p>Leitura no fora do momento indicado: a reação</p><p>continua e leva a erros no cálculo das concentrações</p><p>de endotoxina</p><p>Capacidade de detectar endotoxinas em uma</p><p>ampla gama de concentrações.</p><p>▪ TIPOS DE METODOLOGIAS - COMPARAÇÃO</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>MÉTODO VANTAGENS DESVANTAGENS</p><p>GEL-CLOT</p><p>• Facilidade de execução</p><p>• Não necessita equipamentos</p><p>• Baixo custo (em relação aos</p><p>métodos turbidimétrico e</p><p>cromogênico</p><p>• Ensaio semi-quantitativo</p><p>• Baixa sensibilidade (em relação aos</p><p>métodos turbidimétrico e</p><p>cromogênico</p><p>TURBIDIMÉTRICO</p><p>• Ensaio quantitativo</p><p>• Alta sensibilidade (em relação ao</p><p>método gel-clot)</p><p>• Interferência de amostras coloridas</p><p>• Alto custo dos reagentes (em</p><p>relação ao método gel-clot)</p><p>CROMOGÊNICO</p><p>• Ensaio quantitativo</p><p>• Alta sensibilidade (em relação aos</p><p>métodos turbidimétrico e gel-clot)</p><p>• Alto custo dos reagentes (em</p><p>relação aos métodos</p><p>turbidimétricoe gel-clot)</p><p>▪ TIPOS DE METODOLOGIAS - COMPARAÇÃO</p><p>▪ Um estudo feito em 1970 mostrou que o teste de LAL é mais sensível do que os testes</p><p>realizados em coelhos, pois a intensidade com que o gel é formado é semelhante à</p><p>concentração das endotoxinas.</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>LAL não detecta todos os tipos</p><p>de pirogênios</p><p></p><p>ENDOTOXINAS BACTERIANAS</p><p>OUTRO PIROGÊNIOS</p><p></p><p>Teste in vivo ou Teste de Ativação de Monócitos</p><p>COELHO LAL TAM</p><p>▪ INTERPRETAÇÃO</p><p>▪Grupos teste:</p><p>▪A: Diluente</p><p>▪B: Endotoxina</p><p>▪C: Amostra</p><p>▪D: Amostra + Endotoxina</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>RESULTADO INVÁLIDO</p><p></p><p>FALHA DOS CONTROLES NEGATIVO OU POSITIVO</p><p>▪ INTERPRETAÇÃO</p><p>▪ O limite de endotoxina é especificado nas monografias individuais das drogas</p><p>parenterais em UE/mL, UE/mg ou UE/unidade de atividade biológica.</p><p>UE = UNIDADE DE ENDOTOXINA</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>▪2010 - Farmacopeia Europeia: Teste de ativação de monócitos (MAT)</p><p>como teste de pirogênio recomendado</p><p>▪Leitura recomendada:</p><p>PIROGÊNIOS IN VITRO</p><p>UNIDADE 2</p><p>Análise de agentes antimicrobianos e vitaminas</p><p>Doseamento de Antibióticos</p><p>• Ensaio de difusão em ágar</p><p>• Ensaio turbidimétrico</p><p>• Comparação entre diferentes métodos para doseamento de antibióticos</p><p>• Exemplo de Monografias</p><p>Doseamento de Vitaminas/Fatores de crescimento</p><p>Conservantes</p><p>• O que são os conservantes?</p><p>• Tipos de conservante/Mecanismo de ação</p><p>• Teste de eficácia do sistema conservante</p><p>▪MÉTODOS GERAIS:</p><p>▪ Ensaios Microbiológicos</p><p>▪ Ensaio Iodimétrico</p><p>▪ Espectrofotometria</p><p>▪ Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE/HPLC)</p><p>▪Farmacopéia:</p><p>ANÁLISE DE AGENTES ANTIMICROBIANOS</p><p>E VITAMINAS</p><p>Teste e Especificações</p><p>Monografias</p><p>▪MÉTODOS GERAIS:</p><p>▪ Ensaios Microbiológicos</p><p>▪ Ensaio Iodimétrico</p><p>▪ Espectrofotometria</p><p>▪ Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE/HPLC)</p><p>▪Farmacopéia:</p><p>ANÁLISE DE AGENTES ANTIMICROBIANOS</p><p>E VITAMINAS</p><p>Teste e Especificações</p><p>Monografias</p><p>Doseamento</p><p>Diluição em série</p><p>5.5.3.3 ENSAIO MICROBIOLÓGICO</p><p>DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪O que é o doseamento de antibióticos?</p><p>Avaliação da POTÊNCIA dos antibióticos.</p><p>▪Por que realizar o doseamento?</p><p>▪ Eficácia terapêutica → concentração mínima inibitória → curva de concentração</p><p>plasmática</p><p>▪ Janela terapêutica pequena: dose ineficaz x dose tóxica</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>(Formas farmacêuticas a base de antibióticos e antifúngicos</p><p>estéreis e não estéreis.)</p><p>“A atividade (potência) dos antibióticos pode ser demonstrada sob</p><p>condições específicas através de seu efeito sobre o crescimento de</p><p>microrganismo-padrão sensível.”</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Em condições analíticas apropriadas, uma</p><p>redução da atividade antimicrobiana</p><p>pode revelar alterações não detectadas</p><p>por métodos físico-químicos.</p><p>▪FUNDAMENTO:</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Determina-se a potência (atividade) de um antimicrobiano através</p><p>da comparação entre a dose da amostra que inibe o crescimento</p><p>do microrganismo sensível com a dose do padrão do antibiótico</p><p>que produz inibição similar.</p><p>Padrão secundário</p><p>• Matéria-prima de boa procedência.</p><p>• Ensaios comparativos em relação a um padrão</p><p>farmacopeico.</p><p>• Validados por análise estatística apropriada.</p><p>Substâncias Químicas de Referência (Padrões Farmacopeicos)</p><p>• Produtos de uniformidade reconhecida, estabelecidos e</p><p>distribuídos pelas farmacopeias.</p><p>• Usados como referência analítica, sem requerer</p><p>comparação com outra substância química.</p><p>A quantificação microbiológica de substâncias ativas demanda sempre o emprego de uma avaliação comparativa frente a um padrão</p><p>biológico de referência.</p><p>▪ORIENTAÇÕES DA FARMACOPÉIA:</p><p>▪Capítulo “5.5.3.3 ENSAIO MICROBIOLÓGICO DE ANTIBIÓTICOS” (FB 6, 2019)</p><p>▪ Meios de cultura, soluções, microorganismos e procedimentos de preparo e</p><p>padronização da suspensão para a realização dos testes.</p><p>▪ Orientações específicas para cada tipo de técnica.</p><p>▪MICRO-ORGANISMOS EMPREGADOS:</p><p>▪ padronizados, obtidos de centros de referência</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>American Type</p><p>Culture Collection</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>→ FUNDAMENTO:</p><p>▪ Dois fenômenos ocorrem simultaneamente:</p><p>▪ 1. Difusão do antibiótico</p><p>▪ 2. Crescimento microbiano</p><p>▪ É fundamentalmente um método físico, que emprega o microrganismo-teste como</p><p>revelador</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Resulta na zona de inibição de crescimento.</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>→ FUNDAMENTO:</p><p>▪ Dois fenômenos ocorrem simultaneamente:</p><p>▪ 1. Difusão do antibiótico</p><p>▪ 2. Crescimento microbiano</p><p>▪ Relaciona o tamanho do halo de inibição de crescimento com a dose de antibiótico</p><p>ensaiado → quanto maior a dose de antibiótico ensaiada, maior o tamanho do halo</p><p>de inibição.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Resulta na zona de inibição de crescimento.</p><p>RELAÇÃO DOSE-RESPOSTA</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar - PREPARO DAS PLACAS</p><p>▪ As placas, previamente esterilizadas, devem apresentar uma CAMADA BASE e</p><p>CAMADA SEMEADA de meio de cultura.</p><p>▪ A CAMADA BASE é preparada com o meio determinado na monografia e deixada</p><p>solidificar.</p><p>▪ Sobre ela é adicionada a CAMADA SEMEADA no dia do ensaio e se espera solidificar</p><p>em capela de fluxo laminar.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar - FATORES DE INFLUÊNCIA</p><p>▪Meio de cultura: Composição e pH</p><p>▪Microrganismo, meio de cultura e inóculo</p><p>▪Método de aplicação das soluções</p><p>▪ Incubação: Tempo e temperatura</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar - FATORES</p><p>DE INFLUÊNCIA</p><p>▪Meio de cultura: Composição e pH</p><p>▪ Monocamada ou bicamada (visualiza-se melhor os halos).</p><p>▪ Espessura da camada (+ fina = halos maiores).</p><p>▪ pH do meio que deve ser ideal para o crescimento do MO e estabilidade do</p><p>fármaco testado.</p><p>▪ Alterações no pH do meio de cultura e/ou do diluente podem modificar estado de</p><p>ionização do antibiótico e reduzir a atividade antimicrobiana.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar - FATORES DE INFLUÊNCIA</p><p>▪Microrganismo, meio de cultura e inóculo</p><p>▪ Volume de amostra e padrão</p><p>▪ Densidade do inóculo.</p><p>▪ Microrganismo-teste: espectro de ação do antibiótico e da relevância clínica do</p><p>mesmo.</p><p>▪ O padrão deve ser dessecado, pois a presença de água dificulta a difusão através</p><p>do meio.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar - FATORES DE INFLUÊNCIA</p><p>▪Método de aplicação das soluções</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>O ensaio do DISCO é mais simples e rápido e</p><p>permite o uso de soluções com solvente</p><p>orgânico, já que o mesmo evapora ficando só</p><p>o fármaco a ser analisado → padronizar o</p><p>tempo de imersão do disco na solução</p><p>amostra e esperar secar antes de colocar na</p><p>placa.</p><p>O ensaio com CILINDROS e POÇOS é mais</p><p>trabalhoso, mas mais sensível às pequenas</p><p>concentrações que o do disco → deve-se ter</p><p>um cuidado maior no manuseio das placas.</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar - FATORES DE INFLUÊNCIA</p><p>▪ Incubação: Tempo e temperatura</p><p>▪ Variação da carga final</p><p>▪ Pré-difusão / Pré-incubação</p><p>▪ Pré-difusão: manter as placas sob refrigeração.</p><p>▪ halos maiores, útil para a análise de antibióticos de baixa difusão.</p><p>▪ Pré-incubação: incubar as placas antes de distribuir as soluções de antibiótico.</p><p>▪ halos menores, útil quando o microrganismo-teste apresenta longo tempo de fase lag.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>▪ Técnicas de execução:</p><p>▪ Técnica de cilindros em placas</p><p>▪ Técnica de orifícios ou pocinhos</p><p>▪ Técnica de discos de papel</p><p>▪ Técnica de gotas ou depósito em superfície</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>▪ Técnica de cilindros em placas</p><p>▪ Placas de Petri (20 x 100 mm)</p><p>▪ Cilindros de aço inoxidável, vidro, porcelana, alumínio.</p><p>▪ diâmetro interno: 6,0 mm + 0,1 mm</p><p>▪ diâmetro externo: 8,0 mm + 0,1 mm</p><p>▪ altura:10,0 mm + 0,1 mm</p><p>▪ Tempo de incubação: 16 a 18 horas</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>▪ Técnica de orifícios ou pocinhos</p><p>▪ Usam-se placas de 20 a 150 mm de diâmetro;</p><p>▪ Pocinhos de 5 a 8 mm, no meio inoculado.</p><p>▪ As soluções padrão e amostra são inseridas dentro do pocinho, com pipeta automática, e se</p><p>difundem no ágar</p><p>▪ Os halos podem ser irregulares se o instrumento de perfuração não for padronizado.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>▪ Técnica de discos de papel</p><p>▪ Usado no doseamento de amostras com alta concentração de solvente orgânico</p><p>▪ Placas de 20 a 150 mm de diâmetro;</p><p>▪ Usam-se discos de papel tipo Whatman SS (13 mm de diâmetro).</p><p>▪ As soluções padrão e amostra são colocados sobre o papel, com pipeta automática;</p><p>▪ Aguarda-se evaporação do solvente para depois depositar os discos sobre o meio inoculado</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>▪ Técnica de gotas ou depósito em superfície</p><p>▪ Adiciona-se 2 a 3 µL da solução padrão e amostra na superfície do ágar</p><p>▪ Permite automação</p><p>▪ Pouco utilizado</p><p>▪ A superfície do gel deve estar seca</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Adicionar:</p><p>Placa C-</p><p>(meio de cultura)</p><p>Placa C+</p><p>(meio de cultura + MO)</p><p>▪Ensaio de difusão em ágar</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Adicionar:</p><p>Placa C-</p><p>(meio de cultura)</p><p>Placa C+</p><p>(meio de cultura + MO)</p><p>Paralelismo</p><p>Lineaaridade</p><p>▪Ensaio turbidimétrico</p><p>→ FUNDAMENTO:</p><p>▪ Concentrações do antibiótico são adicionadas a</p><p>uma série de tubos ou frascos contendo meio de</p><p>cultura líquido + MO, incubados em temperatura e</p><p>tempo determinados.</p><p>▪ A turvação produzida pelo crescimento bacteriano</p><p>é quantificada por espectrofotometria.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio turbidimétrico</p><p>▪ Método geral:</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>meio estéril</p><p>Incubar</p><p>3 a 4 horas na</p><p>temperatura</p><p>especificada</p><p>0,5 mL</p><p>Formaldeído 12%</p><p>ou</p><p>Incubar em</p><p>banho-maria a</p><p>80°C.</p><p>Inóculo</p><p>meio + MO</p><p>Amostra ou padrão</p><p>meio + MO +</p><p>amostra</p><p>Leitura em</p><p>espectrofôtometro a 530 nm.</p><p>Zerar com o Branco</p><p>(meio + formaldeído 15%).</p><p>Quanto mais turvo o meio maior a</p><p>concentração de MO.</p><p>Calcular a potência do antibiótico através</p><p>de métodos estatísticos.</p><p>▪Ensaio turbidimétrico</p><p>▪ Método geral:</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Ensaio turbidimétrico</p><p>▪ Delineamento e análise dos resultados:</p><p>▪ Preparar 3 concentrações do padrão e da amostra, em triplicata (3x3)</p><p>▪ Branco: Meio de cultura + formaldeído, nas mesmas quantidades empregadas no</p><p>ensaio</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Padrões Amostra</p><p>Em ensaios de rotina, (linearidade do</p><p>sistema comprovada) pode ser</p><p>empregado ensaio de dois pontos (2x2).</p><p>O delineamento 5x1 também é aceito.</p><p>▪Ensaio turbidimétrico</p><p>▪ Delineamento e análise dos resultados:</p><p>▪ Calcula-se a potência do antibiótico através de métodos estatísticos.</p><p>▪ Se a técnica não for Farmacopeica deve ser validada.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>M = [ ] Padrão/[ ] Amostra</p><p>POTÊNCIA = antilog M x 100%</p><p>Equação de Hewitt</p><p>Potência dentro dos limites</p><p>farmacopeicos = produto aprovado.</p><p>A validação do</p><p>método analítico é</p><p>sempre</p><p>fundamental para</p><p>garantir a qualidade</p><p>dos resultados.</p><p>%</p><p>T</p><p>ra</p><p>n</p><p>sm</p><p>it</p><p>â</p><p>n</p><p>ci</p><p>a</p><p>LOG [ ] Padrão</p><p>LOG [ ] Amostra</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Difusão em ágar</p><p>Vantagens</p><p>• Não necessita de equipamentos</p><p>específicos para sua realização</p><p>Desvantagens</p><p>• Maior tempo de incubação</p><p>• Cuidado extremo no manuseio das placas</p><p>Turbidimétrico</p><p>Vantagens</p><p>• Fornece medida objetiva da resposta</p><p>• Mais rápido (3 a 5 horas)</p><p>Desvantagens</p><p>• Amostras não devem apresentar contaminação</p><p>grosseira, turbidez ou cor que interfira na leitura</p><p>fotométrica</p><p>• Substâncias devem ser estéreis</p><p>• Substâncias termolábeis</p><p>• O pH pode influenciar o crescimento do micro-</p><p>organismo.</p><p>▪Comparação entre diferentes métodos para doseamento de antibióticos</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Difusão em ágar Turbidimétrico CLAE</p><p>Equipamento Básico Básico Especializado</p><p>Treinamento Moderado Moderado Moderado</p><p>Habilidades técnicas Alta Alta Moderada</p><p>Tempo para avaliação do</p><p>resultado (horas)</p><p>24 5 ≤1</p><p>Custo do equipamento Baixo Baixo Alto</p><p>Precisão do método Moderada Variável Alta</p><p>Relação com uso clínico Moderada Alta Baixa</p><p>Robustez Moderada Alta Baixa</p><p>▪Comparação entre diferentes métodos para doseamento de antibióticos</p><p>▪Exemplo de Monografias</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Método de diluição em série</p><p>→ FUNDAMENTO:</p><p>▪Padrão e amostra são diluídos em série em tubos ou micro poços e</p><p>incubados em temperatura e tempo determinados.</p><p>▪Observa-se o crescimento bacteriano, e a avaliação do teste baseia-se</p><p>numa “resposta tudo ou nada”.</p><p>▪ Macrodiluição</p><p>▪ Microdiluição</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>▪Método de diluição em série</p><p>▪ Macrodiluição x Microdiluição</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Sem</p><p>crescimento</p><p>Com</p><p>crescimento</p><p>▪ Falta algum controle aqui?</p><p>▪Método de diluição em série</p><p>▪ Testa-se concomitantemente padrão e</p><p>amostra:</p><p>▪ Para maior precisão, ensaia-se concentrações</p><p>intermediárias entre o tubo com concentração</p><p>inibitória mínima e o imediatamente anterior.</p><p>DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS</p><p>Vantagens</p><p>• Mais sensível a baixas concentrações</p><p>que outros métodos</p><p>• Fornece a CIM ativa da substância</p><p>analisada</p><p>Desvantagens</p><p>• A precisão está relacionada ao</p><p>intervalo de concentração utilizada</p><p>• Há interferência de soluções turvas ou</p><p>coradas</p><p>• Há necessidade do padrão e amostra</p><p>serem estéreis</p><p>• Não é farmacopeico</p><p>▪Fatores de Crescimento</p><p>▪Vitaminas e aminoácidos</p><p>▪Medicamentos</p><p>▪Cosméticos</p><p>▪Nutracêuticos</p><p>DOSEAMENTO DE VITAMINAS/FATORES DE</p><p>CRESCIMENTO</p><p>▪Doseamento de Fatores de Crescimento</p><p>→ FUNDAMENTO:</p><p>▪O crescimento microbiano será proporcional à concentração</p><p>desta</p><p>substância → mede-se a ZONA OU HALO DE EXIBIÇÃO DE CRESCIMENTO</p><p>▪Atividade biológica oposta à de antimicrobianos.</p><p>▪MO escolhido: O desenvolvimento do micro-organismo deve apresentar</p><p>dependência total em relação à substância sob teste que está ausente</p><p>no meio de cultura.</p><p>DOSEAMENTO DE VITAMINAS/FATORES DE</p><p>CRESCIMENTO</p><p>▪Doseamento de Fatores de Crescimento</p><p>▪ A avaliação quantitativa de fatores de crescimento</p><p>pela técnica de difusão em gel segue, basicamente,</p><p>todas as orientações e os princípios relatados para os</p><p>antibióticos.</p><p>▪ O fenômeno da difusão no gel é o mesmo, com</p><p>multiplicação da população inicial à medida que</p><p>ocorre a transferência do elemento ausente no meio de</p><p>cultura.</p><p>▪ O tamanho da zona de exibição de crescimento será</p><p>definido em função do esgotamento total da substância</p><p>em análise, uma vez que o microrganismo é</p><p>integralmente dependente do mesmo.</p><p>DOSEAMENTO DE VITAMINAS/FATORES DE</p><p>CRESCIMENTO</p><p>▪Doseamento de Fatores de Crescimento</p><p>▪ DIFUSÃO EM GEL – OBSERVAÇÕES</p><p>▪ Necessidade de contraste na zona limítrofe entre crescimento e não crescimento → espessura</p><p>suficiente do meio sólido → cerca de 20 mL por placa de 10 cm de diâmetro</p><p>▪ Quantidades muito reduzidas destes fatores de crescimento são suficientes para manifestação</p><p>do crescimento → cuidados com a limpeza da vidraria e uso de água bidestilada.</p><p>▪ Antes do teste: lavagens do MO com solução fisiológica livre de fatores de crescimento.</p><p>▪ Delineamento experimental, leitura e cálculos do teor são os mesmos descritos para</p><p>antibióticos.</p><p>DOSEAMENTO DE VITAMINAS/FATORES DE</p><p>CRESCIMENTO</p><p>▪Doseamento de Fatores de Crescimento</p><p>▪ Outros métodos:</p><p>▪ Titulação iodométrica</p><p>▪ Reações colorimétricas</p><p>▪ Cromatografia Gasosa</p><p>▪ Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE/HPLC)</p><p>DOSEAMENTO DE VITAMINAS/FATORES DE</p><p>CRESCIMENTO</p><p>▪Doseamento de Fatores de Crescimento</p><p>▪ Exemplo: Vitamina C</p><p>DOSEAMENTO DE VITAMINAS/FATORES DE</p><p>CRESCIMENTO</p><p>▪Doseamento de Fatores de Crescimento</p><p>▪ RECOMENDAÇÃO:</p><p>Ler os artigos disponíveis nos “Materiais Complementares”</p><p>DOSEAMENTO DE VITAMINAS/FATORES DE</p><p>CRESCIMENTO</p><p>▪Doseamento de Fatores de Crescimento</p><p>▪ RECOMENDAÇÃO:</p><p>Ler os artigos disponíveis nos “Materiais Complementares”</p><p>Assistir aos vídeos:</p><p>▪ Volumetria de Oxirredução - Determinação de Ácido Ascórbico na Vitamina C - Parte 1:</p><p>https://youtu.be/uYKZ7ucCkJY</p><p>▪ Volumetria de Oxirredução - Determinação de Ácido Ascórbico na Vitamina C - Parte 2:</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=z60ImsRNisY</p><p>DOSEAMENTO DE VITAMINAS/FATORES DE</p><p>CRESCIMENTO</p><p>https://youtu.be/uYKZ7ucCkJY</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=z60ImsRNisY</p><p>▪O que são os conservantes?</p><p>▪ Substâncias com efeito antimicrobiano utilizadas para conservação microbiana de</p><p>produtos farmacêuticos e cosméticos</p><p>▪ São substâncias intrinsecamente tóxicas, portanto a concentração utilizada deve</p><p>ser pequena</p><p>▪ Tipos de conservante/Mecanismo de ação</p><p>CONSERVANTES</p><p>Biostáticos</p><p>x</p><p>Biocidas</p><p>Combinação com</p><p>grupamentos químicos dos</p><p>conservantes com as</p><p>proteínas microbianas</p><p>Ação competitiva</p><p>com determinados</p><p>processos</p><p>enzimáticos</p><p>Destruição ou</p><p>inativação</p><p>funcional de</p><p>material genético</p><p>Reação ou</p><p>desorganização</p><p>da membrana</p><p>celular</p><p>▪Escolha do sistema conservante</p><p>▪Associações de conservantes</p><p>▪ Aumento do espectro de ação</p><p>▪ Utilização de concentrações mais baixas, podendo resultar em redução dos efeitos tóxicos.</p><p>▪ Prevenção do desenvolvimento de resistência microbiana em relação aos componentes</p><p>individuais.</p><p>▪ Possibilidade de efeito sinérgico</p><p>CONSERVANTES</p><p>Conhecimento das propriedades dos</p><p>antimicrobianos - estrutura química, aspectos</p><p>legais, combinações</p><p>Conhecimento dos</p><p>componentes da formulação</p><p>Compatibilidade com o</p><p>material de acondicionamento</p><p>▪Quais produtos precisam de um sistema conservante??</p><p>CONSERVANTES</p><p>▪Quais produtos precisam de um sistema conservante??</p><p>Produtos multidose!!!</p><p>CONSERVANTES</p><p>O uso de conservantes não é recomendado em produtos de dose única.</p><p>▪Qual o objetivo de usar um sistema conservante??</p><p>▪ Inibir o crescimento de microrganismos que, eventualmente, sejam</p><p>introduzidos ao produto durante seu uso pelo paciente.</p><p>Produtos não estéreis</p><p>▪ Importância:</p><p>▪ Garantir a estabilidade, segurança e eficácia de medicamentos e cosméticos.</p><p>▪ Evitar que o uso inadequado destes produtos acarrete doenças no consumidor</p><p>CONSERVANTES</p><p>▪ Teste de eficácia do sistema conservante</p><p>▪Desafio do sistema conservante do produto: contaminação intencional</p><p>com quantidades altas de microrganismos específicos e avaliação da</p><p>carga sobrevivente em intervalos de tempo definidos</p><p>▪POR QUE REALIZAR O TESTE?</p><p>CONSERVANTES</p><p>Quantidade insuficiente:</p><p>pode resultar em crescimento</p><p>microbiano, comprometendo a</p><p>estabilidade do produto</p><p>Quantidade excessiva:</p><p>Pode causar reações</p><p>indesejáveis, comprometendo a</p><p>segurança do paciente</p><p>▪ Teste de eficácia do sistema conservante</p><p>▪PROCEDIMENTO PARA O TESTE DE EFICÁCIA</p><p>CONSERVANTES</p><p>▪ Teste de eficácia do sistema conservante</p><p>▪Desafio do sistema conservante do produto: contaminação intencional</p><p>com quantidades altas de microrganismos específicos e avaliação da</p><p>carga sobrevivente em intervalos de tempo definidos</p><p>▪QUANDO REALIZAR O TESTE?</p><p>▪ Produtos em desenvolvimento/novos</p><p>▪ Estabilidade do produto</p><p>▪ Alteração da fórmula</p><p>▪ Alteração do sistema conservante</p><p>CONSERVANTES</p><p>▪ Teste de eficácia do sistema conservante</p><p>▪CONDIÇÕES PARA O TESTE DE EFICÁCIA</p><p>▪Quantidade da amostra: não menos que 20 g ou mL</p><p>▪Carga do inóculo: 105-106 UFC/ g ou mL</p><p>(não mais que 1% do volume da amostra)</p><p>▪ Intervalo de tempo após a inoculação: inicial, 6 horas, 1 dia, 2 dias, 7</p><p>dias, 14 dias e 28 dias</p><p>CONSERVANTES</p><p>▪ Teste de eficácia do sistema conservante</p><p>▪MICRORGANISMOS EMPREGADOS NO TESTE</p><p>▪ Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)</p><p>▪ Escherichia coli (ATCC 8739)</p><p>▪ Staphylococcus aureus (ATCC 6538)</p><p>▪ Candida albicans (ATCC 10231)</p><p>▪ Aspergillus niger (ATCC 16404)</p><p>▪ MO isolados de área produtiva</p><p>CONSERVANTES</p><p>OBRIGADA!!</p><p>NOME DO</p><p>APRESENTADOR</p><p>CONTATOSCARGO</p><p>Slide 1</p><p>Slide 2</p><p>Slide 3</p><p>Slide 4</p><p>Slide 5</p><p>Slide 6</p><p>Slide 7</p><p>Slide 8</p><p>Slide 9</p><p>Slide 10</p><p>Slide 11</p><p>Slide 12</p><p>Slide 13</p><p>Slide 14</p><p>Slide 15</p><p>Slide 16</p><p>Slide 17</p><p>Slide 18</p><p>Slide 19</p><p>Slide 20</p><p>Slide 21</p><p>Slide 22</p><p>Slide 23</p><p>Slide 24</p><p>Slide 25</p><p>Slide 26</p><p>Slide 27</p><p>Slide 28</p><p>Slide 29</p><p>Slide 30</p><p>Slide 31</p><p>Slide 32</p><p>Slide 33</p><p>Slide 34</p><p>Slide 35</p><p>Slide 36</p><p>Slide 37</p><p>Slide 38</p><p>Slide 39</p><p>Slide 40</p><p>Slide 41</p><p>Slide 42</p><p>Slide 43</p><p>Slide 44</p><p>Slide 45</p><p>Slide 46</p><p>Slide 47</p><p>Slide 48</p><p>Slide 49</p><p>Slide 50</p><p>Slide 51</p><p>Slide 52</p><p>Slide 53</p><p>Slide 54</p><p>Slide 55</p><p>Slide 56</p><p>Slide 57</p><p>Slide 58</p><p>Slide 59</p><p>Slide 60</p><p>Slide 61</p><p>Slide 62</p><p>Slide 63</p><p>Slide 64</p><p>Slide 65</p><p>Slide 66</p><p>Slide 67</p><p>Slide 68</p><p>Slide 69</p><p>Slide 70</p><p>Slide 71</p><p>Slide 72</p><p>Slide 73</p><p>Slide 74</p><p>Slide 75</p><p>Slide 76</p><p>Slide 77</p><p>Slide 78</p><p>Slide 79</p><p>Slide 80</p><p>Slide 81</p><p>Slide 82</p><p>Slide 83</p><p>Slide 84</p><p>Slide 85</p><p>Slide 86</p><p>Slide 87</p>