Ap1 - Genética Médica

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<p>Genética</p><p>Médica</p><p>Extração e Sequenciamento de DNA</p><p>Prof. Dr. Douglas Caldeira Giangarelli</p><p>Objetivos</p><p>• Compreender o processo básico da</p><p>técnica de extração de DNA de</p><p>material vegetal in natura;</p><p>• Conhecer o processo pós-extração</p><p>de DNA</p><p>• Entender a técnica de PCR</p><p>• Conhecer a lógica do processo de</p><p>sequenciamento de DNA.</p><p> Ácido desoxirribonucleico - DNA</p><p>O que é o DNA?</p><p>• Ácido Desoxirribonucleico</p><p>• Pentose + fosfato + bases nitrogenados</p><p> Unidade básica informacional do DNA é o gene.</p><p> Tamanho do genoma dos organismos é relativo</p><p>a sua complexidade.</p><p>• Vírus = 5 - 10 pares de bases</p><p>• E. Coli = 4.640 pb</p><p>• Humano = 2.900.000 pb</p><p> Ácido desoxirribonucleico - DNA</p><p>Onde se localizam as macromoléculas do DNA?</p><p> Núcleo das células eucariontes</p><p>Qual a composição das membranas celulares</p><p>Fonte: https://bit.ly/2E7G1cU</p><p>Lipoproteica e Fluida</p><p>• Bicamada fosfolipídica</p><p>• Glicoproteína + Glicolipídios</p><p>• Colesterol</p><p>Proteínas de membrana</p><p>• Integrais – intrínsecas</p><p>• Periféricas - extrínsecas</p><p>Glicocálice</p><p>• Glicoproteínas + glicolipídios –</p><p>• Reconhecimento celular</p><p>Fonte: https://bit.ly/2BNJexW</p><p> Tipos Celulares</p><p>• Morango</p><p>1) Primeiramente, os alunos deverão escolher 3 morangos, higieniza-los, retirar as folhas,</p><p>deixando somente o pseudofruto.</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p>2) Colocar o frasco do álcool absoluto na geladeira, ou se</p><p>possível, armazená-lo no freezer.</p><p>3) Colocar os morangos dentro</p><p>de um saco plástico limpo para</p><p>macerá-los com as mãos até</p><p>que resultem em uma pasta</p><p>homogênea.</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p> Procedimento 01</p><p>Laminário Digital</p><p>Vídeo 01:</p><p>Protocolo de Extração de</p><p>DNA vegetal</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p>Procedimento 1: Extração de DNA vegetal (morango)</p><p>4) Transferir a pasta homogênea resultante da</p><p>maceração dos morangos para um Becker.</p><p>5) Becker = misturar 150 mL de água destilada + uma colher de sopa de detergente</p><p>líquido neutro + uma colher de chá de sal de cozinha</p><p> Homogeneizar em baixa velocidade para não obter espuma.</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p> Solução de lise</p><p>Laminário Digital</p><p>Vídeo 02:</p><p>Protocolo de Extração de</p><p>DNA vegetal</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p> Solução de lise</p><p> Maceração = aumenta a superfície de contato com a solução de lise</p><p> Função de rompimento da membrana plasmática e outras membranas.</p><p> O detergente permite a desestruturação das moléculas de lipídios das membranas</p><p>biológicas.</p><p> O sal proporciona o ambiente favorável para a extração de</p><p>DNA, neutralizando a carga negativa dos grupos fosfatos</p><p>dessa molécula.</p><p> Morangos possuem muito DNA: 8 cópias de cada conjunto de cromossomos</p><p> Macios e fáceis de homogeneizar</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p>Procedimento 1: Extração de DNA vegetal (morango)</p><p>6) Adicionar 50 ml da solução tampão no Becker com a</p><p>pasta de morango e homogeneizar vagarosamente.</p><p>7) Incubar a solução por 30 minutos, durante esse período</p><p>homogeneizar lentamente a solução.</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p>Laminário Digital</p><p>Vídeo 03:</p><p>Protocolo de Extração de</p><p>DNA vegetal</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p>Procedimento 1: Extração de DNA vegetal (morango)</p><p>8) Após a incubação, filtrar a solução em um novo</p><p>Becker.</p><p>9) Inserir em um tubo de ensaio 15 mL da</p><p>solução filtrada.</p><p>10) Adicionar lentamente pela</p><p>parede do tubo de ensaio, 25 mL</p><p>de etanol (gelado), sem misturar</p><p>o álcool com a solução.</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p>Procedimento 1: Extração de DNA vegetal (morango)</p><p> Precipitação do DNA</p><p> Álcool gelado diminui a solubilidade do DNA com a ajuda do sal adicionado</p><p>inicialmente.</p><p> O DNA, menos solúvel em álcool, formará um aglomerado que precipitará</p><p>junto com outras moléculas.</p><p> Adicionar o álcool gelado em velocidade lenta</p><p>auxilia na eficiência de precipitação do DNA.</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p>Procedimento 1: Extração de DNA vegetal (morango)</p><p>11) Aguardar a precipitação do DNA</p><p>12) Observar o material</p><p>13) Passo opcional.</p><p>Usar um palito para enrolar as moléculas de DNA. Gire o palito na</p><p>interface entre a solução e o álcool.</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWaFonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p>Fonte: https://bit.ly/2GGztWa</p><p>Laminário Digital</p><p>Vídeo 04:</p><p>Protocolo de Extração de</p><p>DNA vegetal</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p> Observe o DNA precipitado</p><p>como uma nuvem</p><p>esbranquiçada no fundo da fase</p><p>alcoólica</p><p> A pectina ficará no topo da fase</p><p>alcoólica</p><p> Diferenciação do DNA e da Pectina</p><p>Fonte: Rodrigues et al. 2008. Disponível em: http://botanicaonline.com.br/geral/arquivos/bmaterial6.pdf.</p><p>Acessado 26 Fev. 2019</p><p> Procedimentos e instruções - 01</p><p> Diferenciação do DNA e da Pectina</p><p>Fonte: Rodrigues et al. 2008. Disponível em:</p><p>http://botanicaonline.com.br/geral/arquivos/bmaterial</p><p>6.pdf. Acessado 26 Fev. 2019</p><p> Pode-se observar bolhas na camada de</p><p>pectina.</p><p> Pectina apresenta consistência de geleia</p><p>quando retirada com um bastão de vidro,</p><p>pipeta Pasteur ou palito de dente.</p><p>Fonte: Rodrigues et al. 2008. Disponível em:</p><p>http://botanicaonline.com.br/geral/arquivos/bmaterial</p><p>6.pdf. Acessado 26 Fev. 2019</p><p>• Fenol - clorofórmio</p><p> Métodos de Extração laboratoriais</p><p>Fonte: https://bit.ly/2tCN1cI</p><p>Fonte: https://bit.ly/2Vk4KSa</p><p>Fonte: https://bit.ly/2SZiIw4</p><p>ChelexR</p><p>Fonte: https://ebay.to/2VmE9nF</p><p>Fonte: https://bit.ly/2Tbgmtr</p><p>Kit de extração</p><p> Procedimento pós-extração – Teste de integridade</p><p> DNA diluído</p><p> Ficoll – Azul de Bromofenol</p><p> Gel de agarose (08% - 1%)</p><p> Corrida 100 V – 90 minutos</p><p>Fonte: https://bit.ly/2KCjG9N</p><p>• Espectrofotometria (quantificação)</p><p>• Espectrofotometria - Princípios</p><p> Procedimento pós-extração</p><p>Fonte: Skorpion87/Wikimedia</p><p>Commons. Fonte: 1,2KhomchatK /Wikimedia Commons.</p><p>Fonte: Viv Rolfe /Wikimedia</p><p>Commons.</p><p>Fonte: 2Flickr.</p><p>Fonte de</p><p>luz</p><p>Colimador Prisma Cubeta</p><p>com</p><p>solução</p><p>DetectorFenda</p><p>seletora</p><p>Leitor</p><p>Fonte: Adaptado de Kasvi.</p><p>Procedimento</p><p>Sequenciamento</p><p>de DNA</p><p> Estrutura do DNA</p><p>Pontes de hidrogênio entre bases complementares;</p><p> Dupla hélice.</p><p>Ponte de hidrogênio</p><p>Adenina</p><p>Guanina</p><p>Timina</p><p>Citosina</p><p>Fonte: Adaptado de CNX OpenStax/Wikimedia Commons.</p><p> Replicação do DNA</p><p>Fonte: https://bit.ly/412odZk</p><p>DESNATURAÇÃO</p><p>ANELAMENTO</p><p>EXTENSÃO</p><p> Reação em cadeia da polimerase (PCR)</p><p>Fonte: Adaptado de New England Biolabs.</p><p> Reagentes usados na PCR</p><p> Água</p><p> Tampão</p><p> Iniciadores (primers)</p><p> Nucleotídeos (dNTPs)</p><p> Mg++ (cofator)</p><p> DNA Polimerase(Taq)</p><p> DNA molde</p><p> Procedimentos e instruções - 02</p><p>Nucleotídeos</p><p>A</p><p>T</p><p>C</p><p>G</p><p> Adenina</p><p> Timina</p><p> Citosina</p><p> Guanina</p><p>A</p><p>T</p><p>C</p><p>G</p><p> Relações de</p><p>complementaridade DNA:</p><p>A - T e C - G</p><p> Iniciar a cadeia a partir de um</p><p>primer (iniciador de cadeia)</p><p>Procedimentos e instruções - 02</p><p>A</p><p>T</p><p>C</p><p>C</p><p>G</p><p>T</p><p>G</p><p>Grupo A Grupo B</p><p>T</p><p>C</p><p>G</p><p>A</p><p>A</p><p>G</p><p>T</p><p>Iniciadores Iniciadores</p><p>A</p><p>T</p><p>C</p><p>G</p><p>Adenina</p><p>Timina</p><p>Citosina</p><p>Guanina</p><p>A</p><p>T</p><p>C</p><p>G</p><p>Laminário Digital</p><p>Vídeo 05:</p><p>Simulação do processo de</p><p>sequenciamento de DNA</p><p> Procedimentos e instruções - 02</p><p>A</p><p>T</p><p>C</p><p>C</p><p>G</p><p>T</p><p>G</p><p>Iniciadores</p><p>A</p><p>T</p><p>C</p><p>G</p><p>Adenina</p><p>Timina</p><p>Citosina</p><p>Guanina</p><p>A</p><p>T</p><p>C</p><p>G</p><p> Sorteio no saquinho da base complementar</p><p> Papel branco sorteado, adiciona o</p><p>nucleotídeo na cadeia e repete a operação</p><p> Papel colorido interrompe a síntese →</p><p>iniciar uma nova cadeia</p><p>Marcador de</p><p>pares de bases</p><p>Simulações da atividade</p><p> Fitas (barbantes) com</p><p>tamanhos diferentes</p><p> Ordenadas por tamanhos</p><p>(decrescente)</p><p> Simulando a separação dos</p><p>fragmentos por eletroforese</p><p> Procedimentos e instruções - 02</p><p>Laminário Digital</p><p>Vídeo 06:</p><p>Simulação do processo de</p><p>sequenciamento de DNA</p><p>Sequenciamento de DNA</p><p>• Determinação da sequência nucleotídica do DNA (ATGCs);</p><p>• Método de Sanger → “técnica de desoxi” → método mais usado</p><p> Dois tipos de marcadores nucleotídeos</p><p>• “Normais” – deoxi (polimerização)</p><p>• “Fluorescentes” – dideoxinucleotídeos (interrompe a sequencia)</p><p>Fonte: https://bit.ly/3zxhknf</p><p> Sequenciamento de DNA – técnica sequenciamento automático</p><p>Fonte: https://bit.ly/3m7WMP7</p><p>Eletroferograma</p><p> Sequenciamento de DNA – técnica sequenciamento automático</p><p>Alinhamento das sequencias</p><p>Resultados</p><p>- Como resultados dessa prática, espera-</p><p>se que o aluno tenha aplicado as</p><p>técnicas de extração de DNA e</p><p>compreendido a importância de todas as</p><p>etapas e a da utilização adequada dos</p><p>reagentes.</p><p>- Outro ponto de abordagem dessa</p><p>pratica visa aproximar o conhecimento</p><p>científico dos alunos de graduação,</p><p>tornando a técnica de sequenciamento</p><p>de DNA compreensível.</p><p>Resultados</p><p>- Ao final da aula, os alunos deverão</p><p>elaborar um relatório básico que deverá</p><p>conter os procedimentos realizados,</p><p>materiais e resultados obtidos.</p><p>- O relatório deve conter: Título;</p><p>Introdução sobre o tema da aula,</p><p>Objetivos; Resultados; Discussão dos</p><p>resultados; Conclusão.</p>