AULA 1 - EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE

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Extração de DNA 
Dogma Central da Biologia Molecular
RNA ProteínaDNA 
Replicação
Transcrição Tradução
Transcrição
reversa
Macromoléculas formadas a partir de nucleotídeos
Grupo FosfatoGrupo Fosfato
Açúcar (uma pentose que 
pode variar)
Açúcar (uma pentose que 
pode variar)
Base Nitrogenada 
(pode variar)
Base Nitrogenada 
(pode variar)
Ácidos nucleicos
DNA
Ácido desoxirribonucleicoÁcido desoxirribonucleico
Dupla fitaDupla fita
Bases nitrogenadas: Adenina, Timina, 
Citosina e Guanina
Bases nitrogenadas: Adenina, Timina, 
Citosina e Guanina
Ligações químicas: Lig. fosfodiéster 
e Lig. de hidrogênio
Ligações químicas: Lig. fosfodiéster 
e Lig. de hidrogênio
Origem: ReplicaçãoOrigem: Replicação
Contém a informação genéticaContém a informação genética
RNA
Ácido ribonucleicoÁcido ribonucleico
Fita simplesFita simples
Bases nitrogenadas: Adenina, Uracila, 
Citosina e Guanina
Bases nitrogenadas: Adenina, Uracila, 
Citosina e Guanina
Ligação química: 
Lig. fosfodiéster
Ligação química: 
Lig. fosfodiéster
Origem: TranscriçãoOrigem: Transcrição
Transmite a informação genéticaTransmite a informação genética
Extração de DNA/RNA
Pode ser feita a partir das seguintes amostras: 
• Sangue, 
• Biópsias e esfregaços, 
• Fragmentos de tecidos, 
• Culturas de células,
• Cultivos microbiológicos, 
• Sêmen,
• Folhas, 
• Insetos, 
• Etc.
Extração de DNA/RNA
1) O DNA é mais estável.
2) O RNA é rapidamente degradado após a 
coleta - pode ser evitada com o 
congelamento das amostras em 
nitrogênio líquido, com o uso de reagentes 
conservantes e trabalhando no gelo!
3) Todo o material utilizado em técnicas de 
biologia molecular deve ser estéril, para 
evitar contaminação do DNA ou RNA.
IMPORTANTE:
Extração de DNA
Preparo da amostra:
• Acondicionamento adequado após a coleta – essencial para preserver a 
amostra. 
• Amostras líquidas (sangue, urina ou liquor) – centrifugação para a 
separação de células nucleadas, no precipitado, ou de partículas virais, no 
sobrenadante.
• Amostras sólidas (biópsias, fragmentos de tecidos, folhas, etc) – passam
por quebra das estruturas rígidas, por picotação ou maceração, para 
aumentar a superfície de contato com os reagentes. 
Extração de DNA
Lise celular:
Rompimento das células com soluções tamponadas contendo:
1. Detergente – rompimento das membranas e a liberação do 
conteúdo celular. 
2. Reagente Tris – mantém o pH da solução de lise estável
(próximo a 8,0), evitando ação de DNAses que poderiam
degradar o DNA.
3. NaCl – quebra ligações das cadeias peptídicas, auxiliando na
desnaturação de proteínas e promove a aglomeração do DNA.
4. EDTA – auxilia inibindo as DNAses. 
Extração de DNA
Separação dos constituintes celulares:
• Após a lise das membranas, o DNA é liberado na solução aquosa junto 
com outros componentes celulares. 
• A proteinase K fará a digestão de proteínas, auxiliando na separação do 
DNA dos demais dos constituintes celulares 
• Após a centrifugação, o DNA permanece na fase aquosa (sobrenadante), 
e deve ser transferido para um novo tubo, sendo separado de proteínas
e demais componentes. 
• A repetição dessa etapa pode elevar a pureza, entretanto pode resultar
em perdas de DNA.
Extração de DNA
Precipitação do DNA
• Em baixas temperaturas e 
elevada concentração salina
(NaCl presente no tampão de 
lise), a adição de etanol absoluto
resulta na precipitação do DNA, 
formando um aglomerado de 
filamentos esbranquiçados que 
podem ser visualizados no tubo. 
Extração de DNA
Lavagem e ressuspensão do DNA
• Geralmente a lavagem do DNA é realizada com etanol 70% para a 
remoção dos sais, detergentes e de outras impurezas. 
• Após a secagem por evaporação, o DNA é ressuspendido em água
ultrapura ou em solução tampão.
Concentração e Qualidade
do DNA
Após a extração do DNA, muitas vezes, é 
importante conhecer saber sobre o 
rendimento e qualidade do produto antes 
de utiliza-lo nas analises seguintes através
de dois métodos: 
• Espectrofotometria
(concentração/pureza da amostra)
• Eletroforese
(qualidade/integridade da amostra)
Espectrofotometria
• Técnica que utiliza a luz para medir as 
concentrações de soluções. 
• A interação da luz com a matéria permitirá 
a realização diversas análises. 
• Cada composto químico absorve, 
transmite ou reflete luz ao longo de um 
determinado intervalo de comprimento de 
onda. 
Espectrofotometria
Cubetas:
• Recipiente utilizado para 
colocar o material que será 
analisado. 
• Podem ser de vidro, quartzo 
(análise de DNA) ou plásticas.
• Cuidado ao manusear, pois 
mesmo uma ligeira 
impressão digital pode 
interferir nos resultados. 
cubetas
Espectrofotometria
• A concentração de 
DNA será medida a 
partir da quantidade
de luz absorvida no 
comprimento de onda
de 260 nm.
• Quanto maior a 
absorção de luz nesse
comprimento de 
onda, maior a 
concentração de DNA 
na solução. 
espectrofotometro
Espectrofotometria
• Devido ao volume das cubetas, é 
necessário diluir as amostras de 
DNA para a realizar a medição. 
• O fator de diluição deve ser levado
em consideração no cálculo da 
concentração (veja a seguir). 
• Existem aparelhos específicos
(nanodrop) utilizam apenas 1 μL
de amostra evitando a 
necessidade do fator de diluição.
nanodrop
O cálculo da concentração do DNA nas amostras e realizado utilizando a 
seguinte fórmula:
Concentração DNA (ng/uL) = Abs260nm × F.C. × F.D
Sendo:
• Abs260nm = absorbância da amostra em 260 nm (ver valor no aparelho)
• F.C = Fator constante – DNA=50; RNA= 40
• F.D. = fator de diluição
Espectrofotometria
Ex: Amostra com 10uL de DNA em 990uL de H2O
Na maioria das vezes utilizamos essa diluição =) 
• A espectrofotometria também é utilizada para a avaliação da 
qualidade das amostras de DNA.
• Calculada a partir dos valores de absorbâncias medidos nos 
comprimentos de onda de 260nm e 280 nm. 
• Valores entre 1,4 e 2,0 indicam pureza adequada das extrações de DNA, 
• Valores abaixo de 1,4 podem significar a presença de proteínas ou outros 
contaminantes.
Espectrofotometria
Amostra 2: 
Abs 260 nm = 0,065
Abs 280 nm = 0,035
Fator de diluição = 100
Fator constante = 50
Amostra 1: 
Abs 260 nm = 0,038
Abs 280 nm = 0,034
Fator de diluição = 100
Fator constante = 50
Lembrando que: 
Agora é sua vez...
Calcule a concentração e pureza das amostras 1 e 2: 
Eletroforese
• Método de separação de macromoléculas, como DNA, RNA 
e proteinas, em um gel, de acordo com seu peso molecular 
por meio da aplicação de um campo elétrico. 
• Quanto menor o tamanho da molécula, mais rápido será o 
seu deslocamento no gel. 
DNA = carga negativa migra para polo positivo
A eletroforese em gel pode ser 
realizada de forma horizontal ou 
vertical. 
Horizontal: 
• Em gel de agarose, em um 
recipiente (cuba) que 
apresenta os polos positivo 
e negativo e onde se 
adiciona solução tampão 
(TAE ou TBE).
• Separação de fragmentos de 
50pb até 50Kb.
Eletroforese
pb = pares de bases
1.000 pb = 1 Kb
Eletroforese
Vertical: 
• Em gel de poliacrilamida, e cada polo da cuba esta em um 
recipiente com tampão em níveis separados (o negativo 
acima e o positivo abaixo), conectados pelo gel. 
• Mais sensíveis, permitem a diferenciação de moléculas 
com variações no tamanho de ate 1 pb.
Eletroforese
Análise do gel: 
• O resultado é visualizado
pela adição, ao gel, às
amostras, ao tampão de 
corrida ou incubando o 
gel após a corrida com 
corantes fluorescentes de 
alta afinidade pelo DNA.
transiluminador
Eletroforese
Análise do gel: 
Gel de agarose: 
1) Brometo de etídeo – intercala-se 
entre as fitas duplas, e que sob luz 
ultravioleta (UV), emite
fluorescência alaranjada, formando
bandas visíveis nas regiões onde há
DNA; apresenta certa toxicidade
(cuidado ao manusear!) 
Eletroforese
Análise do gel: 
Gel de agarose: 
2) GelRed, GelGreen e 
SybrGreen – possuem
afinidade com DNA e 
não são tóxicos. 
Eletroforese
Análise do gel: 
Gel de poliacrilamida
1) Nitrato de prata–
liga-se ao DNA 
formando bandas
escuras no gel.
Eletroforese
Ao preparar as amostras para 
pipetar no gel adiciona-se uma 
solução tampão de migração 
constituída de um açúcar, 
como glicerol, para dar 
densidade e um corante, como 
o azul de bromofenol, para 
visualização durante a 
pipetagem e migração no gel.
IMPORTANTE:
Video
https://youtu.be/B2KLuzD_suQ?si=MwfjgCkS0q6z
MVBE
Referências Bibliográficas:
• ALBERTS, Bruces, JOHSON, Alexander, LEWIS, Julian, ROBERTS, Keith, WALTER, 
Peter, RAFF, Martin. (04/2011). Biologia Molecular da Célula. 5ª edição. Porto 
Alegre: Artmed.
• ALBERTS, Bruce, BRAY, Dennis, HOPKIN, Karen, JOHNSON, Alexander, LEWIS, 
Julian, RAFF, Martin, ROBERT. (01/2015). Fundamentos da Biologia Celular. 3ª 
edição. Porto Alegre: Artmed.
• LIPAY, Monica V. N; BIANCO, Bianca; Biologia molecular - métodos e interpretação 
1. ed. - Rio de Janeiro: Roca, 2015.
• LODISH, H.; BERK, A.; MATSUDAIRA, P.; KAISER, C.A.; KRIEGER, M.; SCOTT, M.P.; 
ZIPURSKY; DARNELL. Biologia Celular e Molecular. 5ª ed. Porto Alegre: Artmed, 
2005. 1054p.
• BRUNO, A. N. (Org.). Biotecnologia II: aplicações e tecnologias. Porto Alegre: 
Artmed, 2017.
1) Liste e explique brevemente as etapas da extração de DNA.
2) Qual é a importância da realização da técnica de
espectrofotometria após a extração do DNA?
3) Qual é a importância da realização da técnica de
eletroforese após a extração do DNA?
Estudo Dirigido