Relatório - Espectrofotômetro para Determinar Teor de Proteínas

Prévia do material em texto

<p>Piracicaba</p><p>2022</p><p>ALEKSANDRO ORLANDINI DA SILVA</p><p>CRISTIAN BOLUTAVICIUS</p><p>FABIO DA SILVA FRANCO</p><p>MARIA LIVIA BANZATO SRAIR</p><p>FATEC PIRACICABA</p><p>TECNOLOGIA EM ALIMENTOS</p><p>Bioquímica de Processos</p><p>Relatório Laboratorial – Proteínas</p><p>Piracicaba</p><p>2022</p><p>ALEKSANDRO ORLANDINI DA SILVA</p><p>CRISTIAN BOLUTAVICIUS</p><p>FABIO DA SILVA FRANCO</p><p>MARIA LIVIA BANZATO SRAIR</p><p>Relatório Laboratorial – Uso de Espectrofotômetro para Determinar Teor</p><p>de Proteínas no Leite e no Ovo e Preparo de Curva Padrão.</p><p>Relatório da atividade laboratorial para determinar a</p><p>concentração de proteínas, em como a influência do</p><p>aquecimento e do pH, e elaborar curvas de calibração.</p><p>Orientadora: Profª Drª Eliana Mª G. Rodrigues de Siqueira</p><p>SUMÁRIO</p><p>1 INTRODUÇÂO ..................................................................................................... 1</p><p>2 OBJETIVO ........................................................................................................... 3</p><p>3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 4</p><p>3.1 VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS ................................................................. 4</p><p>3.2 SOLUÇÕES .................................................................................................. 4</p><p>3.3 PROCEDIMENTO ......................................................................................... 4</p><p>4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................... 9</p><p>5 CONCLUSÃO .................................................................................................... 13</p><p>6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 14</p><p>1</p><p>1 INTRODUÇÂO</p><p>As proteínas desempenham papel extremamente importante, na maioria dos</p><p>processos biológicos, atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores,</p><p>transportadores através das membranas celulares, além de compor a estrutura de</p><p>tecidos, coagulação sanguínea e realizar diversas atividades como catálise de</p><p>reações metabólicas. São formadas por aminoácidos ligados entre si por ligações</p><p>peptídicas. Uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-N) e de um aminoácido,</p><p>como o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma</p><p>amida.</p><p>A estrutura terciaria da proteína é a formação tridimensional, formada por</p><p>ligações polipeptídicas, que garante a ela a estabilidade. A desnaturação proteica</p><p>acontece quando algum fator como pH, temperatura, ácidos, bases e solventes</p><p>orgânicos, atingem a formação terciaria da proteína, fatores esses que podem causar</p><p>a desnaturação irreversível ou reversível. A proteína desnaturada tem a mesma</p><p>estrutura primária da proteína original, ou nativa.</p><p>A ação do calor, faz com que as proteínas percam sua estrutura terciaria e</p><p>quaternária, há um aumento da hidrofobicidade superficial, ou seja, quanto maior o</p><p>tempo e temperatura de exposição no tratamento térmico dessa proteína, maior a</p><p>agregação da mesma e com isso menor a sua solubilidade. (POMENAZ, 1991 apud</p><p>SANTOS, 2008)</p><p>Segundo (MORRISEY et al., apud 1982PELEGRINI E GASPARETTO,2009) a</p><p>solubilidade proteica pode ser definida através de parâmetros operacionais como a</p><p>centrifugação de uma solução proteica, para poder determinar a retenção de proteína,</p><p>através de um período de tempo e força centrífuga.</p><p>O Ph do meio influencia diretamente a solubilidade das proteínas, alterações</p><p>de pH alteram os sítios catiônicos, aniônicos e não-iônicos das moléculas, afetando</p><p>interações como proteína-agua e proteína-proteína, onde, o ponto isoelétrico da</p><p>proteína, que é caracterizado pelo pH em torno de 5,5, que é o pH onde a proteína</p><p>tem a menor interação com a molécula de água, ou seja, pH mais ácidos ou pH mais</p><p>alcalinos, mantem a interação com a água maior, pois o excesso de cargas iguais ,</p><p>faz com que aumente a solubilidade proteína-água. (PELEGRINI E</p><p>GASPARETTO,2005 apud SANTOS,2008).</p><p>A espectrofotometria de soluções proteicas é útil dentro da faixa de luz visível</p><p>https://www.britannica.com/science/spectrophotometry</p><p>2</p><p>apenas com proteínas que contêm grupos protéticos coloridos, as ligações de</p><p>peptídeos, por causa de seus grupos carbonilas, absorvem energia leve em</p><p>comprimentos de onda muito curtos (185-200 nanômetros).</p><p>O método de Biureto é o mais utilizado para detectar a presença de proteínas.</p><p>O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura</p><p>de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em solução,</p><p>sendo o tartarato de sódio o mais recomendado. O cobre, em meio alcalino, reage</p><p>com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O</p><p>produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em</p><p>540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a</p><p>sensibilidade do método do biureto, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada</p><p>para fins analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria.</p><p>O desenvolvimento de metodologias para determinar proteínas tem cada vez</p><p>mais se tornando de fundamental relevância em várias áreas do conhecimento, como</p><p>por exemplo em tecnologia e ciências de alimentos, objetivando o aproveitamento</p><p>racional da matéria prima e o melhoramento dos produtos novos e já existentes.</p><p>Os métodos para a determinação da concentração de proteínas são muito</p><p>variados, no entanto, as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no</p><p>ultravioleta e no visível (UV-vis). Na presença da radiação UV-vis, os elétrons de</p><p>valência das espécies atômicas ou moleculares absorvem a energia eletromagnética</p><p>e como resultado os elétrons são promovidos de um orbital ocupado de menor</p><p>energia, para um orbital desocupado de maior energia, ou seja, os elétrons passam</p><p>do estado menor energia (fundamental) para um estado maior de energia (excitado).</p><p>3</p><p>2 OBJETIVO</p><p>Determinar a concentração de proteínas, em como a influência do aquecimento</p><p>e do pH, e elaborar curvas de calibração.</p><p>4</p><p>3 MATERIAIS E MÉTODOS</p><p>3.1 VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS</p><p>Béquer;</p><p>Pipeta graduada 1, 5 e 10 ml;</p><p>Pipetador;</p><p>Cubetas;</p><p>Vórtice;</p><p>Espectrofotômetro;</p><p>Balão volumétrico 100 mL;</p><p>Papel de Filtro;</p><p>Erlenmeyer;</p><p>Funil;</p><p>Tubos de Ensaio;</p><p>Tubos de Centrífuga;</p><p>Banho-Maria (65, 75 e 85 ºC).</p><p>3.2 SOLUÇÕES</p><p>Solução Padrão de Proteína: Albumina de Soro Bovino (BSA) 5mg/mL;</p><p>Solução de Proteína (BSA) de Concentração Desconhecida;</p><p>Reagente de Biureto;</p><p>10L Água destilada;</p><p>Solução de HCl e NaOH 0,1N;</p><p>Clara de ovo;</p><p>Carne moída.</p><p>3.3 PROCEDIMENTO</p><p>Para o primeiro experimento, identificou-se os seis tubos de ensaio com</p><p>números de 1 a 6. Em seguida, pipetou-se 5 ml do reagente de biureto, água destilada</p><p>no volume de 1 ml para o tubo 1; 0,8 ml para o tubo 2; 0,6 ml para o tubo 3; 0,4 ml</p><p>para o tubo 4 e 0,2 ml para o tubo 5. O tubo 6 não teve adição de água destilada. Por</p><p>5</p><p>fim, não foi adicionado nenhum volume da solução padrão de proteína ao tubo 1. Já</p><p>para os outros, pipetou-se 0,2 ml para o tubo 2; 0,4 ml para o tubo 3; 0,6 ml para o</p><p>tubo 4; 0,8 ml para o tubo 5 e 1 ml para o tubo 6.</p><p>Tabela 1 – Reagentes Utilizados Para das Soluções Utilizadas para a Curva Padrão</p><p>Reagentes (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6</p><p>Solução Padrão de proteína ---- 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0</p><p>Água destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 ----</p><p>Reagente de biureto 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0</p><p>Após a adição dos reagentes, agitou-se os seis tubos de ensaio no vórtice e</p><p>deixou-se de repouso por 10 minutos. Em seguida, utilizou-se de uma alíquota da</p><p>solução do tubo 1 para a calibração do espectrofotômetro na faixa de 540 nm. Depois</p><p>de calibrado, determinou-se a absorbância das soluções do tubo 2 a</p><p>6. Anotou-se a</p><p>absorbância das soluções dos 6 tubos.</p><p>Tabela 2 – Absorbância das soluções nos tubos de 1 a 6.</p><p>Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6</p><p>Absorbância 0 0,035 0,075 0,125 0,158 0,238</p><p>Para o preparo das amostras analisadas, separou-se e identificou-se 2 tubos</p><p>de ensaio por A e B, onde pipetou-se 1 ml da amostra de clara de ovo no tubo A e 0,5</p><p>ml da mesma amostra no tubo B. Em seguida, pipetou-se 5 ml do reagente de biureto</p><p>no tubo A e B e apenas pipetou-se 0,5 ml de água destilada no tubo B.</p><p>Tabela 3 – Reagentes Utilizados Para o Preparo das Amostras Analisadas</p><p>Reagentes (mL) Tubo A Tubo B</p><p>Amostra 1,0 0,5</p><p>Água destilada ---- 0,5</p><p>Reagente de biureto 5,0 5,0</p><p>6</p><p>Após a adição dos reagentes, agitou-se os dois tubos de ensaio no vórtice em</p><p>seguida deixando em repouso por 10 minutos. Em seguida utilizou-se de uma alíquota</p><p>da solução do tubo A para a identificação da absorbância da amostra</p><p>espectrofotômetro na faixa de 540 nm. O mesmo processo foi realizado para o tubo</p><p>B.</p><p>Tabela 4 – Absorbância das amostras nos tubos A e B.</p><p>Tubo A Tubo B</p><p>Absorbância 0,124 0,066</p><p>Para o segundo experimento, preparou-se 100 ml de uma solução 10% (v/v) de</p><p>clara de ovo em água destilada, pipetando 10 ml de clara de ovo em um balão</p><p>volumétrico de 100 ml e completando com água destilada até a marcação do menisco.</p><p>Em seguida, filtrou-se a solução em um Erlenmeyer com um funil e um papel filtro.</p><p>Em sete tubos de ensaio, pipetou-se 5 ml da solução filtrada. Levou-se três</p><p>tubos para o aquecimento em banho-maria por 5 min. Cada tubo em uma temperatura</p><p>diferente (65,75 e 85°C). Repetiu-se o procedimento para outros três tubos com a</p><p>diferença que esses ficaram em banho-maria por 7 minutos. Após o fim do tempo de</p><p>aquecimento, os seis tubos foram resfriados em água fria corrente.</p><p>Para a calibração do espectrofotômetro na faixa de 450 nm, utilizou-se o tubo</p><p>com a amostra que não foi aquecida. A determinação da absorbância foi realizada</p><p>com uma alíquota das seis amostras que foram aquecidas e resfriadas, agitando-as</p><p>antes de realizar a leitura no espectrofotômetro.</p><p>Tabela 5 – Absorbância das Amostras Aquecidas por 5 Minutos</p><p>Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3</p><p>Absorbância 1,174 1,091 0,983</p><p>.</p><p>Tabela 6 – Absorbância das Amostras Aquecidas por 7 Minutos</p><p>Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3</p><p>Absorbância 1,070 1,079 1,007</p><p>7</p><p>Identificou-se e pesou-se seis tubos plásticos de centrífuga. Transferiu-se 1,5g</p><p>de carne moída e adicionou-se 7,5 ml de água destilada para cada tubo,</p><p>homogeneizando-os. Para a aferição do pH das amostras, utilizou-se de fitas de pH.</p><p>O pH foi ajustado de acordo com os dados informados na tabela 7, utilizando de uma</p><p>solução de hidróxido de sódio (NaOH) e de uma solução de ácido clorídrico (HCl)</p><p>quando necessário. Deixou-se as amostras de repouso por alguns, checando o pH de</p><p>cada tubo após 10 minutos.</p><p>Tabela 7 – Faixa de pH das Amostras no Tubo de 1 a 6</p><p>pH</p><p>Tubo 1 4,0</p><p>Tubo 2 4,5</p><p>Tubo 3 5,0</p><p>Tubo 4 5,5</p><p>Tubo 5 6,0</p><p>Tubo 6 7,0</p><p>Centrifugou-se as seis amostras por 10 minutos a 2000 rpm. Após a</p><p>centrifugação, decantou-se o sobrenadante e pesou-se o precipitado de cada tubo.</p><p>Tabela 8 – Massa dos Tubos Plásticos de Centrifuga</p><p>Massa (g)</p><p>Tubo 1 6,3528</p><p>Tubo 2 6,3342</p><p>Tubo 3 6,2934</p><p>Tubo 4 6,3557</p><p>Tubo 5 6,3857</p><p>Tubo 6 6,3810</p><p>8</p><p>Tabela 9 – Massa da Proteína e do Tubo com a Proteína Junto</p><p>Massa Proteína (g) Tubo + Proteína(g)</p><p>Tubo 1 1,5312 Tubo 1 7,8840</p><p>Tubo 2 1,5194 Tubo 2 7,8536</p><p>Tubo 3 1,5090 Tubo 3 7,8024</p><p>Tubo 4 1,5313 Tubo 4 7,8870</p><p>Tubo 5 1,5602 Tubo 5 7,9459</p><p>Tubo 6 1,5004 Tubo 6 7,8814</p><p>Tabela 10 – Massa Tubos Plásticos de Centrifuga mais a precipitado e a Diferença</p><p>entre o Peso dos Tubos Plásticos de Centrifuga Mais Precipitado, Pelo Tubos</p><p>Plásticos de Centrifuga Mais a Proteína.</p><p>Tubo +</p><p>Precipitado(g)</p><p>Diferença(g)</p><p>Tubo 1 8,9989 Tubo 1 1,1149</p><p>Tubo 2 9,0507 Tubo 2 1,1971</p><p>Tubo 3 9,7070 Tubo 3 1,9046</p><p>Tubo 4 8,8195 Tubo 4 0,9325</p><p>Tubo 5 9,0339 Tubo 5 1,0880</p><p>Tubo 6 8,9049 Tubo 6 1,0235</p><p>9</p><p>4 RESULTADOS E DISCUSSÕES</p><p>Experimento 1: Elaboração da Curva de Calibração e Determinação da</p><p>Concentração dos Tubos A e B pelo Método de Biureto.</p><p>Com os resultados das leituras das absorbâncias e as concentrações,</p><p>calculadas matematicamente, foi elaborado a curva de calibração conforme o gráfico</p><p>1.</p><p>Através do valor do coeficiente de determinação R² encontrado, ficou evidente</p><p>que a curva apresentou uma grande variação entre os resultados. Atribuindo a esse</p><p>resultado falhas no preparo e na leitura das absorbâncias das amostras.</p><p>Gráfico 1</p><p>Baseado nos resultados da curva de calibração e utilizando a equação da reta</p><p>y=mX=b foi determinado a concentração do tubo A e B, conforme a tabela 3.</p><p>Os resultados apresentados na tabela 3 não reproduziram a realidade das</p><p>concentrações dos tubos, pois no tubo A era esperado uma concentração de 5 mg/ml</p><p>e no tubo B era esperado uma concentração de 2,5 mg\ml, pois a concentração da</p><p>solução de proteína utilizada nesse experimento foi de 5mg/ml.</p><p>10</p><p>Tabela 11 – Concentração de Proteína nas Amostras do Tubo A e B.</p><p>Tubo A Tubo B</p><p>Concentração (mg/mL) 2,91 1,67</p><p>Assim concluímos que os resultados obtidos na leitura das amostras no</p><p>espectrofotômetro, tanto para confecção da curva de calibração quanto dos tubos A e</p><p>B não replicaram os valores calculados matematicamente e esperado para a</p><p>concentração da solução de proteínas utilizada. Porém a teoria da reação de biureto</p><p>foi confirmada nos experimentos.</p><p>Experimento 2. Avaliar o efeito do aquecimento sobre as proteínas e o efeito do</p><p>pH na hidratação das proteínas.</p><p>Desnaturação proteica a temperatura de 65, 75 e 85 com tempo de residência</p><p>variando entre 5 e 7 minutos.</p><p>Conforme evidenciado nos gráficos 2 e 3, à medida que as amostras de ovo</p><p>albumina eram submetidas a temperaturas mais elevadas e a maior tempo de</p><p>retenção, suas absorbâncias foram diminuindo, evidenciando assim que quanto maior</p><p>a temperatura maior é desnaturação proteica.</p><p>Gráfico 2</p><p>11</p><p>Gráfico 3</p><p>Além da alteração na absorbância foi verificado alterações físicas e de cor nas</p><p>amostras, mais uma evidência da ocorrência da desnaturação da proteína ovo</p><p>albumina.</p><p>Efeito do pH na hidratação das proteínas.</p><p>Conforme evidenciado no gráfico 4, verificou-se neste experimento</p><p>que, com exceção do pH 5,5, na faixa entre o pH 4,0 e 7,0 foram encontrados os</p><p>maiores valores de retenção de água pela carne e no pH 5,5 o valor mais baixo. Esse</p><p>fenômeno ocorreu devido ao ponto isoelétrico da carne (ponto onde a molécula se</p><p>encontra eletricamente neutra) ocorrer entre o pH 5,5.</p><p>Gráfico 4</p><p>12</p><p>13</p><p>5 CONCLUSÃO</p><p>As práticas confirmaram a teoria apresentada durantes as aulas teóricas.</p><p>Evidenciaram a importância do preparo das amostras para replicação de dados</p><p>confiáveis. Demonstraram a importância para o tecnólogo em alimentos do</p><p>conhecimento sobre desnaturação proteica e a reação de Biureto para identificação</p><p>de proteínas.</p><p>14</p><p>6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS</p><p>Experiência - Detectar proteínas com o teste do biureto, Explicatorium.</p><p>Disponível em: http://www.explicatorium.com/experiencias/detetar-proteinas.html</p><p>Acesso em: 02/04/2022.</p><p>Espectroscopia de Absorção Molecular na Região do Ultravioleta e Visível | UV-</p><p>VIS, CSA Educacional. Disponível em:</p><p>https://csaeducacional.com.br/materias/espectroscopia-de-absorcao-molecular-na-</p><p>regiao-do-ultravioleta-e-visivel-uv-vis. Acesso em: 02/04/2022</p><p>Métodos espectrofotométricos mais utilizados para a determinação de</p><p>proteínas totais, Portal do Conhecimento do Departamento de Bioquímica. Disponível</p><p>em:</p><p>http://cursobioquimica.iq.usp.br/paginas_view.php?idPagina=503&idTopico=1060#.Y</p><p>kmkDCjMLIU. Acesso em: 02/04/2022.</p><p>PELEGRINE, Daniela Helena Guimarães; GASPARETTO, Carlos Alberto. Estudo da</p><p>solubilidade das proteínas da clara do ovo em função da temperatura e do</p><p>pH. RECEN-Revista Ciências Exatas e Naturais, v. 5, n. 2, p. 169-178, 2003.</p><p>Ribeiro, A.J.M., (2014) Proteína, Rev. Ciência Elem., V2(3):229. Disponível em:</p><p>https://rce.casadasciencias.org/rceaap/art/2014/229/ acesso em 16/09/2022</p><p>SANTOS, Daniela Oliveira dos. Functional properties of egg white proteins of quail</p><p>egg. 2008. 93 f. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos; Tecnologia de</p><p>Alimentos; Engenharia de Alimentos) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2008.</p><p>https://rce.casadasciencias.org/rceapp/art/2014/229/</p><p>https://rce.casadasciencias.org/rceapp/art/2014/229/</p>