Aula 18 - Separação em sistema aquoso bifásico

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<p>Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Alagoas</p><p>Curso Técnico em Biotecnologia</p><p>Prof. Me. Elias Silva Gallina</p><p>Aula 17.1</p><p>CC: Separação e Recuperação de Bioprodutos</p><p>Separação por membranas:</p><p>diálise</p><p>2</p><p>Diálise</p><p>A diálise é um processo de separação</p><p>por membranas muito utilizado na</p><p>proteômica após a precipitação em</p><p>sulfato de amônio.</p><p>Na hemodiálise, a transferência de</p><p>massa ocorre entre o sangue e o</p><p>líquido de diálise através de uma</p><p>membrana semipermeável artificial (o</p><p>filtro de hemodiálise ou capilar).</p><p>Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Alagoas</p><p>Curso Técnico em Biotecnologia</p><p>Prof. Me. Elias Silva Gallina</p><p>Aula 17.2</p><p>CC: Separação e Recuperação de Bioprodutos</p><p>Separação líquido-líquido</p><p>Separação baseada na partição entre fases</p><p>• Migração de moléculas de um fase para outra</p><p>que tenha maior afinidade;</p><p>• Duas fases imiscíveis;</p><p>• Na maioria dos casos uma fase é aquosa e a outra</p><p>fase é um solvente orgânico.</p><p>• Baseia-se nas diferenças nas propriedades químicas</p><p>dos componentes: polaridade e caráter</p><p>hidrofóbico/hidrofílico.</p><p>• Pode ser realizada de modo sucessivo para</p><p>elevar eficiência do processo;</p><p>• O Solvente deve ser seletivo, recuperável e</p><p>denso;</p><p>• Barato + atóxico + não inflamável + Baixa</p><p>viscosidade + Baixa temperatura de fusão e</p><p>pressão de vapor + Inerte</p><p>Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Alagoas</p><p>Curso Técnico em Biotecnologia</p><p>Prof. Me. Elias Silva Gallina</p><p>Aula 18</p><p>CC: Separação e Recuperação de Bioprodutos</p><p>Sistema aquoso bifásico</p><p>Sistema aquoso bifásico</p><p>• A separação líquido-líquido tem sido utilizada há</p><p>mais de 70 anos para extração de antibióticos e</p><p>ácidos orgânicos.</p><p>• Fase aquosa e solvente orgânico.</p><p>• Solventes orgânicos não são adequados para proteínas.</p><p>Por quê?</p><p>• Proteínas podem ser extraídas em sistemas</p><p>constituídos por duas fases aquosas imiscíveis:</p><p>• Sistema Aquoso de Duas Fases (SDFA);</p><p>• Partição diferenciada da molécula-alvo e impurezas</p><p>entre as duas fases líquidas.</p><p>• O elevado teor de água (70 – 80%) garante a</p><p>manutenção das propriedades biológicas.</p><p>Sistema aquoso bifásico</p><p>• Desenvolvida em 1976, a SDFA tem sido</p><p>estudada para:</p><p>• Purificação de produtos obtidos em células de animais,</p><p>de vegetais e microbianas;</p><p>• Extração de vírus, organelas e ácidos nucleicos;</p><p>• Purificação de enzimas.</p><p>• Baixa resolução;</p><p>• Não suficiente para elevados graus de pureza, de</p><p>modo ser sucedida por aplicações</p><p>cromatográficas.</p><p>Fundamentos</p><p>• A molécula migrará para o líquido que</p><p>ela tiver mais atividade.</p><p>• A solubilidade da molécula-alvo deve</p><p>ser diferente da dos contaminantes para</p><p>que funcione;</p><p>• A fase do topo é a menos densa;</p><p>• A fase de fundo tem maior densidade;</p><p>Tipos de SAB</p><p>• Dois polímeros não iônicos:</p><p>• Polietilenoglicol (PEG)/Dextrana (Dx);</p><p>• Polieletrólito e um polímero não iônico:</p><p>• Sulfato dextrana de sódio/polipropileno glicol (PPG)</p><p>• Dois polieletrólitos:</p><p>• Sulfato dextrana de sódio/carboximetildextrana de sódio;</p><p>• Polímero não iônico e um composto de baixa massa</p><p>molar:</p><p>• PEG/sulfato de magnésio</p><p>• PEG/citrato de sódio.</p><p>Esclarecimentos sobre estes compostos</p><p>• Polímero não-iônico: molécula longa que</p><p>não contém grupos funcionais com carga</p><p>elétrica.</p><p>• Não se ioniza (não adquire cargas positivas</p><p>ou negativas) quando dissolvido em água ou</p><p>em outros solventes.</p><p>• Geralmente apolares ou levemente polares,</p><p>e sua solubilidade depende de interações</p><p>de forças de van der Waals ou de pontes de</p><p>hidrogênio.</p><p>• Poliacrilamida não iônica</p><p>• Polietilenoglicol</p><p>Esclarecimentos sobre estes compostos</p><p>• Dextrana: polissacarídeo ramificado formado por</p><p>unidades de glicose ligadas por ligações</p><p>glicosídicas α(1→6).</p><p>• Sintetizada por bactérias: Leuconostoc mesenteroides.</p><p>• Tem diferentes pesos moleculares, variando desde</p><p>pequenas frações até grandes polímeros.</p><p>• Sulfato de dextrana: dextrana com grupos sulfatos</p><p>– isso confere características distintas em relação</p><p>à sua solubilidade, carga elétrica e interações</p><p>biológicas.</p><p>• Maior interação eletrostática devido às suas cargas</p><p>negativas, aumentando sua capacidade de se ligar a</p><p>moléculas ou íons carregados positivamente</p><p>Tipos de SAB</p><p>• Dois polímeros não iônicos:</p><p>• Polietilenoglicol (PEG)/Dextrana (Dx);</p><p>• Polieletrólito e um polímero não iônico:</p><p>• Sulfato dextrana de</p><p>sódio/polipropileno glicol (PPG)</p><p>• Dois polieletrólitos:</p><p>• Sulfato dextrana de</p><p>sódio/carboximetildextrana de sódio;</p><p>• Polímero não iônico e um composto de</p><p>baixa massa molar:</p><p>• PEG/sulfato de magnésio</p><p>• PEG/citrato de sódio.</p><p>PEG</p><p>PEG</p><p>PEG</p><p>PEG</p><p>PEG</p><p>Dextrana</p><p>Amido</p><p>Fosfato de potássio</p><p>Sulfato de magnésio</p><p>Citrato de sódio</p><p>Fase</p><p>superior</p><p>(Top fase)</p><p>Fase inferior (Bottom fase)</p><p>PEG Sal</p><p>Rápida separação das fases</p><p>Baixo custo;</p><p>Seletividade na separação de moléculas</p><p>com base na solubilidade</p><p>• Em qualquer ponto da linha de amarração haverá duas fases imiscíveis, quanto mais perto de T for o</p><p>ponto, maior será a fase leve. Quanto mais próxima de B, maior será a fase pesada. Entretanto se</p><p>forem usadas misturas de acordo com a curva binodal (a curva do gráfico) há maior probabilidade</p><p>das fases se misturarem.</p><p>Curva de equilíbrio</p><p>• Quanto maior a massa molar do polímero, menor a concentração necessária para a formação de</p><p>duas fases líquidas aquosas em equilíbrio. A redução do valor do pH do meio desloca a curva de</p><p>equilíbrio significativamente para o lado direito, de tal forma que as concentrações necessárias à</p><p>formação das duas fases líquidas, em um sistema polímero e sal, como PEG/sal, aumentam.</p><p>Curva de equilíbrio</p><p>O conhecimento da curva binodal, ou curva de equilíbrio, é, portanto,</p><p>fundamental aos seguintes aspectos:</p><p>• seleção da condição de trabalho que resultará na formação de duas fases;</p><p>• seleção das composições iniciais que permitam variações de composição das</p><p>fases;</p><p>• variações nos volumes das fases.</p><p>• A literatura apresenta curvas de equilíbrio para diversos SDFA,</p><p>principalmente PEG/dextrana e PEG/sal, considerando valores de pH,</p><p>temperatura e massa molar dos polímeros. Na falta dessas curvas de</p><p>equilíbrio previamente estabelecidas, será necessário determiná-las</p><p>Curva de equilíbrio</p><p>• Depende muito da molécula que se quer extrair. Proteínas</p><p>apresentam cargas e conformações distintas em função do pH e da</p><p>força iônica (efeito dos sais – salting out) do meio.</p><p>• Tamanho do polímero: se o polímero tiver alta massa molecular a</p><p>proteína pode ficar na fase salina por não conseguir penetrar a</p><p>solução do polímero – exclusão molecular;</p><p>• Proteínas com mais aa hidrofóbicos tendem a preferir a fase de topo;</p><p>• Glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina,</p><p>triptofano e prolina.</p><p>• Concentrações elevadas de proteína (>1 g/L) pode alterar a formação</p><p>das fases;</p><p>• A composição da mistura (contaminantes) pode interagir com os</p><p>polímeros e alterar a formação das fases.</p><p>O que influi no processo?</p><p>Coeficiente de partição (K) para a enzima amiloglicosidase na extração</p><p>em sistema PEG/fosfato, em função do valor do pH e massa molar de</p><p>PEG. Aspergillus awamori NRRL 3112.</p><p>O que influi no processo?</p><p>1 – Soluções estoque – os polímeros são pesados e devem estar na</p><p>temperatura de operação;</p><p>Sais – 40% m/v</p><p>PEG – 50% m/v</p><p>Dextrana – 20 a 30% m/v</p><p>2 – Ordem de adição: solução de Dextrana ou solução de PEG, solução</p><p>do sal e água (extrato bruto - aquoso).</p><p>3 – Mistura tudo no vórtex.</p><p>4 – espera as fases se formarem.</p><p>Como proceder</p><p>As separações podem ser feitas em série e com</p><p>diversas composições de fase</p><p>Adiciona-se um ligante para a molécula de interesse, de modo a</p><p>captura-la e mantê-la na fase desejada.</p><p>Extração baseada em afinidade</p><p>PEG Ligante Biomolécula Contaminante</p><p>Existem diversos ligantes</p><p>Existem diversos ligantes</p><p>Existem diversos ligantes</p><p>Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Alagoas</p><p>Curso Técnico em Biotecnologia</p><p>Prof. Me. Elias Silva Gallina</p><p>Aula 18</p><p>CC: Separação e Recuperação de Bioprodutos</p><p>Sistema aquoso bifásico</p><p>Slide 1</p><p>Slide 2</p><p>Slide 3</p><p>Slide 4: Separação baseada na partição entre fases</p><p>Slide 5</p><p>Slide 6: Sistema aquoso bifásico</p><p>Slide 7: Sistema aquoso bifásico</p><p>Slide 8: Fundamentos</p><p>Slide 9: Tipos de SAB</p><p>Slide 10: Esclarecimentos sobre estes compostos</p><p>Slide 11: Esclarecimentos sobre estes compostos</p><p>Slide 12: Tipos de SAB</p><p>Slide 13: Curva de equilíbrio</p><p>Slide 14: Curva de equilíbrio</p><p>Slide 15: Curva de equilíbrio</p><p>Slide 16: O que influi no processo?</p><p>Slide 17: O que influi no processo?</p><p>Slide 18: Como proceder</p><p>Slide 19: As separações podem ser feitas em série e com diversas composições de fase</p><p>Slide 20: Extração baseada em afinidade</p><p>Slide 21: Existem diversos ligantes</p><p>Slide 22: Existem diversos ligantes</p><p>Slide 23: Existem diversos ligantes</p><p>Slide 24</p>