Avaliacaobiomarcadorescardiomiopatia_Orozco_2021

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA 
 
 
 
 
 
 
Victoria Ramírez Orozco 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES PARA A CARDIOMIOPATIA CHAGÁSICA 
CRÔNICA 
 
 
 
 
 
 
Natal/RN 
2021 
 
 
 
2021 PPGBP Victoria Ramírez Orozco CB/UFRN 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VICTORIA RAMÍREZ OROZCO 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES PARA A CARDIOMIOPATIA CHAGÁSICA 
CRÔNICA 
 
Dissertação apresentada ao Programa de 
Pós-graduação em Biologia Parasitária da 
Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, como requisito à obtenção do título de 
Mestre em Biologia Parasitária. 
 
Área de concentração: Biologia Parasitária 
 
 
Orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes 
 
 
 
 
 
 
 
 
Natal/RN 
2021 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orozco, Victoria Ramírez. 
 Avaliação de biomarcadores para a cardiomiopatia chagásica 
crônica / Victoria Ramírez Orozco. - Natal, 2021. 
 63 f.: il. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Biologia 
Parasitária. 
 Orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes. 
 
 
 1. Cardiomiopatia chagásica crônica - Dissertação. 2. CTLA-4 - 
Dissertação. 3. Doença de Chagas - Dissertação. 4. Mioglobina - 
Dissertação. 5. Pacientes - Dissertação. 6. Troponina-I - 
Dissertação. I. Guedes, Paulo Marcos da Matta. II. Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. 
 
RN/UF/BSCB CDU 616.12 
 
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB 
 
 
VICTORIA RAMÍREZ OROZCO 
 
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES PARA A CARDIOMIOPATIA CHAGÁSICA 
CRÔNICA 
 
Dissertação apresentada ao Programa de 
Pós-graduação em Biologia Parasitária da 
Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, como requisito à obtenção do título de 
Mestre em Biologia Parasitária. 
 
Área de concentração: Biologia Parasitária 
 
 
Natal, 26 de fevereiro de 2021. 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
______________________________________________________ 
Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes 
Departamento de Microbiologia e parasitologia-UFRN 
 
 
______________________________________________________ 
Profa. Dra. Antônia Cláudia Jácome da Câmara 
Departamento de Microbiologia e parasitologia-UFRN 
 
 
______________________________________________________ 
Prof. Dr. Jonilson Berlink Lima 
Universidade Federal do Oeste da Bahia-UFOB 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de 
Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. 
This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal 
de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Finance Code 001. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
A cardiomiopatia chagásica crônica é observada em 17-50% dos pacientes 
chagásicos crônicos contribuindo para morbidade e mortalidade da doença de 
Chagas. Até o momento não existem biomarcadores de evolução clínica descritos 
para a doença de Chagas, sendo necessário a realização de exames clínicos de alto 
custo (eletrocardiograma, ecocardiograma, raio X, enema opaco), que necessitam da 
presença de profissionais especializados e em muitos casos são invasivos e 
desconfortáveis aos pacientes. A molécula CTLA-4 tem sua expressão influenciada 
por infecções, é expressa em células T reguladoras e encontra-se solúvel no plasma 
sanguíneo. Proteínas cardíacas liberadas após lesão tecidual podem gerar a 
produção de autoanticorpos que contribuem para o processo de dano cardíaco. Esse 
estudo teve como objetivo avaliar autoanticorpos anti-troponina I, anti-mioglobina e a 
molécula CTLA-4 solúvel no soro como biomarcadores clínicos não invasivos para a 
cardiopatia chagásica crônica. A produção de IgG anti-T. cruzi, autoanticorpos IgG 
total anti-troponina I, anti-mioglobina, e a concentração de CTLA-4 solúvel foram 
determinados por ELISA no soro de 90 pacientes chagásicos crónicos portadores das 
formas indeterminada (n=30), cardíaca (n=30), digestiva (n=14) e cardiodigestiva 
(n=16), e correlacionados com à fração de ejeção do ventrículo esquerdo, índice 
cardiotorácico e diâmetro do átrio. Foram utilizados soros de indivíduos não infetados 
(n=30) como controles. Pacientes chagásicos portadores das formas clínicas 
indeterminada, cardíaca, digestiva e cardiodigestiva apresentaram maior produção de 
anticorpos IgG total anti-T cruzi, autoanticorpos IgG anti-troponina I e autoanticorpos 
anti-mioglobina, quando comparados aos indivíduos não infectados. Ademais, 
pacientes com a forma cardíaca da doença apresentaram maior produção de 
autoanticorpos IgG anti-mioglobina comparado a pacientes com a forma 
indeterminada. De maneira interessante, pacientes indeterminados apresentaram 
níveis normais de CTLA-4 solúvel, quando comparado a indivíduos portadores das 
formas clínicas cardíaca, digestiva e cardiodigestiva que apresentaram níveis 
reduzidos. Nossos resultados indicam que a produção elevada de autoanticorpos anti-
troponina-I e anti-mioglobina associada a baixa quantidade de CTLA-4 sérico podem 
estar associadas ao desenvolvimento da forma cardíaca da doença de Chagas. 
Palavras-chave: Cardiomiopatia chagásica crônica; CTLA-4; doença de Chagas; 
mioglobina; pacientes; troponina-I. 
 
 
ABSTRACT 
 
Chronic chagasic cardiomiopathy is observed in 17-50% of patients, contributing to 
morbidity and mortality of Chagas disease. There are no biomarkers of clinical 
evolution described for Chagas disease, requiring high-cost clinical examinations 
(electrocardiogram, echocardiogram, X-ray, opaque enema), which require the 
presence of specialized professionals and many cases are invasive and uncomfortable 
to patients. CTLA-4 is expressed in regulatory T cells and is soluble in blood plasma, 
CTLA-4 expression is influenced by infections. Cardiac proteins released after tissue 
damage can generate the production of autoantibodies that contribute to the process 
of cardiac damage. This study aimed to evaluate anti-troponin I, anti-myoglobin 
autoantibodies and CTLA-4 soluble in serum as non-invasive clinical biomarkers for 
chronic chagasic cardiophaty. Specific IgG production anti-T. cruzi and autoantibodies 
anti-troponin I, anti-myoglobin, and soluble CTLA-4 concentration were determined by 
ELISA in the serum of 90 chronic chagasic patients with indeterminate (n = 30), cardiac 
(n = 30), digestive (n = 14) and cardiodigestive (n = 16) clinical forms, and correlated 
with left ventricular ejection fraction, cardiothoracic index and atrial diameter. Sera from 
uninfected individuals (n = 30) were used as controls. Chagasic patients with 
indeterminate, cardiac, digestive and cardiodigestive clinical forms had higher 
production of total IgG anti-T cruzi and anti-troponin I and anti-myoglobin 
autoantibodies, when compared to uninfected individuals. In addition, cardiac patients 
showed higher production of anti-myoglobin IgG autoantibodies compared to 
indeterminate patients. Interestingly, indeterminate patients had normal levels of 
soluble CTLA-4, when compared to individuals with clinical cardiac, digestive and 
cardio-digestive forms that had reduced levels. Our results indicate that the high 
production of anti-troponin-I and anti-myoglobin autoantibodies associated with low 
soluble CTLA-4 may be associated with the development of the cardiac form of Chagas 
disease.Keywords: Chagas disease; chronic chagasic cardiomiopathy; CTLA-4; myoglobin; 
patients; troponin-I. 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 – Mecanismos de dano cardíaco que levam a progressão da cardiopatia 
chagásica crônica. .................................................................................................... 19 
Figura 2 – Delineamento experimental ..................................................................... 28 
Figura 3 – Localização dos municípios de procedência dos pacientes .................... 29 
Figura 4 – Pacientes chagásicos produzem altos níveis de anticorpos IgG 
específicos anti-Trypanosoma cruzi .......................................................................... 34 
Figura 5 – Pacientes chagásicos crônicos produzem altos níveis de autoanticorpos 
anti-Troponina-I ......................................................................................................... 35 
Figura 6 – Pacientes chagásicos crônicos portadores da forma cardíaca produzem 
altos níveis de autoanticorpos anti-Mioglobina .......................................................... 36 
Figura 7 – Pacientes chagásicos crônicos portadores das formas cardíaca, digestiva 
e cardiodigestiva apresentam reduzida concentração de CTLA-4 solúvel no soro ... 37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 – Características clínicas dos pacientes chagásicos crônicos provenientes 
do Estado do Rio Grande do Norte ........................................................................... 31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
ADCC “Antibody Dependent Celular Cytotoxicity” Citotoxicidade celular 
dependente de anticorpos 
ATP “Adenosine triphosphate” Adenosín trifosfato 
C3 Convertasa 3 
C4 Convertasa 4 
CCC Cardiomiopatia Chagásica Crônica 
CDC “Center for Disease Control and Prevention” Centro para o controle e 
prevenção de doenças 
cTnI Troponina I 
cTnT Troponina T 
CRP “Complement regulatory protein” Proteína reguladora do complemento 
CTLA-4 “Citotoxic T lymphocyte associated protein 4” Antígeno- 4 associado a 
linfócito T citotóxico 
DNA “Deoxyribonucleic acid” Ácido Desoxirribonucleico 
DTU “Discrete Typing Units” Unidades Discretas de Tipagem 
ELISA “Enzime-linked immunosorvent assay” Ensaio Imunoabsorbente Ligado 
a Enzimas 
GIPL “Glycoinositolphospholipid” Glicoinositolfosfolipideo 
GPI “Glycosylphosphatidylinositol” Glicosilfosfatidilinositol 
IAM Infarto Agudo do Miocárdio 
IFI Imunofluorescencia Indireta 
IgG Imunoglobulina do isotipo G 
iNOS “Inducible nitric oxid synthase” Oxido nítrico sintase induzível 
IP3 “Inositol triphosphate” Trifosfato de inositol 
 
 
MAC “Membrane attack complex” Complexo de ataque a membrana 
MASP “MBL-associated serine protease” Serina proteases associadas a MBL 
MBL “Mannose-binding lectin” Lectina de união a manose 
MYO Mioglobina 
NF-kB “Nuclear factor-kB” Fator nuclear kB 
NK “Natural Killer” Matadora Natural 
PAMPs “Pathogen-associated molecular patterns” Padrões moleculares 
associados a patógenos 
PCR Reação em Cadeia da Polimerase 
RNA “Ribonucleic acid” Ácido Ribonucleico 
SCA Síndrome Coronário Agudo 
TcCRT Calreticulina 
T. cruzi Trypanosoma cruzi 
T-DAF “Trypanosoma- decay accelerating fator” Fator de aceleração de 
descomposição de tripomastigote 
TGF-β “Transforming growth factor beta” Fator de crescimento transformante 
beta 
TLRs “Toll-like receptors” receptores semelhantes ao Toll 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 14 
 1.1 Trypanosoma cruzi e doença de Chagas ..................................................... 14 
 1.2 Patogenia da doença de Chagas ................................................................. 17 
 1.3 Resposta imunológica na infecção pelo Trypanosoma cruzi ........................ 20 
 1.4 Diagnóstico etiológico e clínico da Doença de Chagas..................................22 
 1.5 Biomarcador ................................................................................................. 23 
 1.5.1 Mioglobina, Troponina I ........................................................................ 24 
 1.5.2 CTLA-4 ................................................................................................. 25 
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 27 
 2.1 Objetivo geral ................................................................................................ 27 
 2.2 Objetivos específicos .................................................................................... 27 
3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 28 
 3.1 Delineamento experimental .......................................................................... 28 
 3.2 População de estudo .................................................................................... 28 
 3.3 Avaliação clínica ........................................................................................... 30 
 3.4 Testes ELISA ............................................................................................... 31 
 3.5 Analise estatística ........................................................................................ 33 
4. RESULTADOS ..................................................................................................... 34 
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................ 38 
6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 42 
7. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 43 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 
 
1.1 Trypanosoma cruzi e doença de Chagas 
 
 
 
 O Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é um protozoário intracelular e flagelado, agente 
etiológico da doença de Chagas, identificado pelo médico sanitarista brasileiro Carlos 
Justiniano Ribeiro das Chagas (CHAGAS, 1909; LIDANI et al., 2019). Em revisão mais 
recente sobre a classificação de organismos eucariontes com ênfase em protistas 
eucariotos, foi proposta a reunião de diferentes táxons em grupos genéticos similares, 
baseada em analises moleculares e filogenéticas, indicando que o T. cruzi, integrante 
do grupo dos organismos que ocupam os níveis mais altos dos protistas eucariotos 
dentro de uma topologia hierárquica, classifica-se da seguinte maneira (ADL et al., 
2012): Excavata (CAVALIER-SMITH, 2002; corrigido por SIMPSON, 2003); Discoba, 
ribogrupo montado a partir de estudos filogenéticos (HAMPL et al., 2009); Discicristata 
(CAVALIER-SMITH, 1998); Euglenozoa (CAVALIER-SMITH, 1981, corrigido por 
SIMPSON, 1997); Kinetoplastea (HONIGBERG, 1963); Metakinetoplastina, ribogrupo 
(MOREIRA, LÓPEZ-GARCÍA e VICKERMAN, 2004); Trypanosomatida (KENT, 1880; 
corrigido por MOREIRA, LÓPEZ-GARCÍA e VICKERMAN, 2004) que contém a 
espécie T. cruzi (Revisado por ADL et al., 2012). 
O T. cruzi apresenta alta variabilidade populacional e é classificado em grupos 
genéticos ou genótipos, denominados Unidades Discretas de Tipagem (DTU) as quais 
enumeram-se TcI, TcII, TcIII, TcVI, TcV e TcVI, baseado em padrões genéticos, 
bioquímicos e marcadores biológicos (ZINGALES et al., 2014). Além do Tcbat, que é 
uma DTU inicialmente descrita como restrita à morcegos, mas que já foi encontrada 
infectando humanos (MARCILI et. al., 2009; ZINGALES et. al., 2009; RAMIREZ et. al., 
2014; LIMA et al., 2015; ZINGALES, 2018). Atualmente os estudosque avaliaram a 
correlação entre DTUs e as formas clínicas da doença de Chagas não têm 
demonstrado associações (DEL PUERTO et al., 2010), embora algumas evidências 
indicam caráter mais patogênico das DTUs I, II, V e VI, quando comparado as DTUs 
III e IV (CURA et al., 2012; MEZA et al., 2014; MARTINS et al., 2015). Em estudo 
experimental comparativo de TcIV proveniente do Norte do Brasil e TcII do Sul, foi 
15 
 
verificada elevada patogenicidade de TcII (MEZA et al., 2014). No Estado do Rio 
Grande do Norte foi identificada a presença de TcIII em seres humanos com a forma 
indeterminada da doença, enquanto o TcI estava associado em 50% dos casos com 
forma indeterminada, 25% cardíaca e 25% digestiva, e TcII em 16,7% dos pacientes 
com a forma indeterminada, 50% com forma cardíaca e 33,3% com a forma digestiva 
da doença de Chagas (MARTINS et al., 2015). 
O parasito apresenta um ciclo biológico complexo do tipo heteroxênico 
desenvolvendo três formas evolutivas (epimastigota, amastigota e tripomastigota) que 
diferem quanto a estrutura, antigenicidade, metabolismo e capacidade de replicação 
(TYLER e ENGMAN, 2001; DE SOUZA, 2002). Os hospedeiros invertebrados são 
insetos triatomíneos, da subfamília Triatominae (Hemiptera, Reduviidae), conhecidos 
popularmente por barbeiros, dos gêneros Triatoma, Rhodnius e Panstrongylus; 
infectam-se durante a ingestão de sangue do hospedeiro vertebrado infectado, 
ingerindo a forma de tripomastigota sanguínea (KESSLER et al., 2017). No intestino 
médio ocorre a diferenciação em forma epimastigota, que multiplica-se por divisão 
binária simples aderida ao epitélio intestinal, posteriormente, formas epimastigotas 
migram à região posterior do intestino, atingindo a ampola retal, onde sofre 
metaciclogênese, com a formação da forma tripomastigota metacíclica, forma 
infectante para o hospedeiro vertebrado, e são eliminados nas fezes do inseto no 
momento da alimentação (GONÇALVES et al., 2018). No hospedeiro vertebrado o 
parasito penetra por mucosa integra ou pelo local da picada, inicialmente a forma 
tripomastigota metacíclica penetra em células próximo ao local da picada, transforma-
se em forma amastigota, multiplica-se por divisão binária simples, diferenciam-se em 
forma tripomastigota, lisam a célula e disseminam-se por via sanguínea e linfática para 
diferentes células e tecidos, apresentando tropismo por macrófagos, células 
dentríticas, musculatura estriada, cardíaca e lisa, além de células epiteliais (KESSLER 
et al., 2017; LIDANI et al., 2019; MELO, GUARNERI e SILBER, 2020). O T. cruzi pode 
penetrar em células fagocíticas e não fagocíticas de duas formas, a primeira é 
dependente de lisossomos, induz a sinalização de cálcio pela geração de trifosfato de 
inositol (IP3), posteriormente acontece o recrutamento e fusão de lisossomos nas 
células alvo formando o fagolisossoma (TARDIEUX et al., 1992), e a segunda é a 
invaginação da membrana plasmática, onde ocorre posterior fusão intracelular com 
lisossomas (DE BONA et al., 2018). O T. cruzi pode infectar aproximadamente 1.000 
16 
 
espécies de mamíferos, sendo transmitido em ciclos doméstico e silvestre por mais 
de 155 espécies de triatomíneos, dificultando a erradicação da infecção humana 
(JIMENEZ, 2014; LIDANI et al., 2019; PAES et al., 2020; WHO, 2020). A doença de 
Chagas é uma zoonose de transmissão vetorial, mas também são consideradas 
outras formas de transmissão, assim como, congênita, oral, transfusões sanguíneas 
e transplante de órgãos (JIMENEZ, 2014; ACEVEDO, GIRARD e GOMEZ, 2018). 
Segundo WHO (2020) a tripanossomíase americana é uma doença 
negligenciada e endêmica em 21 países latino-americanos. Atualmente estima-se 6-
7 milhões de pessoas infetadas pelo T. cruzi no mundo, ocorrem 10 mil mortes anuais 
e 75 milhões de pessoas vivendo em áreas de risco de contrair a infecção. Schmunis 
(2007) documenta que a doença tem demostrado caráter re-emergente em regiões 
não endêmicas, devido à alta mobilidade de pessoas entre países endêmicos para 
não endêmicos e transmissão transfusional, segundo o centro para o controle e 
prevenção de doenças (CDC) há mais de 300.000 pessoas infectadas com T. cruzi 
que moram nos Estados Unidos e 80.000 em à Europa, por isso destacasse como um 
problema de saúde pública (WHO, 2020; MELO, GUARNERI e SILBER, 2020). A 
cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) a principal causa de cardiomiopatia não 
isquêmica na América Latina, segundo o Ministério da Saúde (BR)., (2020), afeta em 
maior frequência as populações que se encontram em áreas rurais de baixa renda e 
cujas condições de moradia facilitam a transmissão do protozoário T. cruzi; doença 
considerada negligenciada por falta de interesse econômico pelas indústrias 
farmacêuticas levando à existência de poucos métodos preventivos e tratamento de 
rotina (SÁNCHEZ-VALDÉZ, et al., 2018; Ministério da Saúde (BR)., 2020). 
No Brasil, estima-se que 1,2 milhões de pessoas estejam infectadas (WHO, 
2020). A transmissão oral, vetorial e congênita foram responsáveis por 73,0%, 8,9% 
e 1,3% dos novos casos registrados no país de 2012 a 2016, respectivamente. Assim, 
a principal forma de transmissão do T. cruzi no Brasil atualmente é a via oral (BRASIL, 
2005). Principalmente através da ingestão de alimentos contaminados tais como açaí 
e palmito de babaçu (SOUZA-LIMA et al., 2013; FERREIRA, 2014) na Região 
Amazônica, com foco para o Estado do Pará (BRASIL, 2015). Os relatos de casos 
agudos pela ingestão de caldo de cana têm sido registrados no Nordeste e no Sul do 
país (SHIKANAY-YASUDA et al., 1991; STEINDEL et al., 2008; VARGAS et al., 2018). 
No Estado do Rio Grande do Norte (RN) inquérito soroepidemiológico realizado entre 
2007 e 2009, em moradores da mesorregião Oeste e da mesorregião Central estimou 
17 
 
a prevalência em 6,5% e 3,3%, respectivamente. Estimando-se cerca de 14.000 
infectados no Estado do RN, Brito et al., (2012). 
 
1.2 Patogenia da doença de Chagas 
 
 
A infecção pelo T. cruzi apresenta duas fases clínicas, a fase aguda e a fase 
crônica. A fase aguda dura entre 6 a 8 semanas, normalmente é caracterizada por 
parasitemia patente, é assintomática na maioria dos casos (90%), mas pode ser 
sintomática em 10% dos casos, apresentando febre, taquicardia, 
hepatoesplenomegalia, adenomegalia, edema bipalpebral unilateral (sinal de 
Romaña), chagoma de inoculação ou pode apresentar formas graves, como 
miocardite aguda, meningoencefalite e morte súbita (CHAGAS, 1916; ACEVEDO, 
GIRARD e GOMEZ, 2018; LIDANI et al., 2019). Após a fase aguda segue-se a fase 
crônica que pode ser assintomática (39% - 78%), caracterizando a forma 
indeterminada da doença ou desenvolver as formas cardíaca (17–50%), digestiva (3–
27%) ou cardiodigestiva (2–11%) (BRENIERE et al., 1989; BRENER, ANDRADE e 
BARRAL-NETO, 2000; RASSI, RASSI e MARIN-NETO, 2010; BONNEY e ENGMAN, 
2015; DIAS et al., 2016). Os determinantes da evolução da infecção estão 
relacionados ao número de formas tripomastigotas do T. cruzi inoculadas durante a 
infecção; ao perfil genético do parasito; às reinfecções; ao estado nutricional do 
paciente, sexo, idade e a resposta imunológica (COURA 1988; MACEDO e PENA 
1998; ANDRADE et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2006; ZINGALES et al., 2009). 
A cardiopatia chagásica crônica desenvolve-se devido à vários fatores, tais 
como resposta inflamatória exacerbada no miocárdio gerando lesões ao tecido 
muscular cardíaco e ao sistema nervoso autônomo do coração (BONNEY e ENGMAN, 
2015). A lesão característica é miocardite difusa com infiltrado linfocitário, levando a 
hipertrofia dos cardiomiócitos (BONNEY e ENGMAN, 2015), influenciando a 
remodelagem ventricular, adelgaçamento das paredes ventriculares, baixa 
capacidade de regeneração do miocárdio, aneurismas da parede do ventrículo, 
desenvolvimento de trombos, produzindo a deterioração na função do coração e 
anomalias vasculares (CHAVES, VÁSQUEZe CORRALES, 2019). Além disso, a 
inflamação de neurônios do sistema nervoso parassimpático junto com à reação 
18 
 
autoimunitária neural afeta na disfunção autonômica, essas alterações neurogênicas 
podem levar à morte súbita (BONNEY e ENGMAN, 2015). Na forma digestiva da 
doença, ocorre principalmente acometimento do esôfago e cólon, devido a lesões no 
sistema nervoso entérico intramural, parasitismo tecidual e inflamação crônica 
levando ao aparecimento de megaesôfago e megacólon, respectivamente (COURA et 
al., 1983., SANCHEZ-GUILLEN et al., 2006; MUNOZ et al., 2009; PEREZ et al., 2011; 
SALVADOR et al., 2013; ANDRADE et al., 2015; SANCHEZ – MONTALVA et al., 
2016). 
Segundo o Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde do Brasil (MS, 
2020), a prevalência de infecção por T. cruzi no Brasil é de 1,02% das quais o 60% 
das pessoas infectadas permanecem na forma indeterminada, 30% evoluem para a 
forma cardíaca e 10% para a forma digestiva. Estima-se no Brasil em 2020 o número 
de pessoas com a forma indeterminada, cardíaca e digestiva de 819.351 pessoas, 
409.676 pessoas e 136.559 pessoas, respectivamente. Durante o período de 2007 a 
2017 foram registradas 51.293 mortes pela doença de Chagas com média de 4.663 
por ano, e nesse mesmo período no Estado do Rio grande do Norte o número de 
óbitos registrados foram 16. Adicionalmente, o impacto econômico da forma cardíaca 
é aproximadamente US$ 750 milhões anuais na América Latina, sendo esta forma a 
que gera maior custo estimado para implantes de marcapasso e cirurgias corretivas, 
Ministério da Saúde (BR), (2020). 
A patogenia da fase crônica da doença de Chagas ocorre devido a presença 
do parasito e a autoimunidade. A presença do parasito parece ser importante para 
desencadear o processo de formação da miocardite chagásica crônica. Na maioria 
dos casos, não é possível fazer uma correlação entre a intensidade da lesão e a 
quantidade de antígeno e/ou DNA do T. cruzi, sugerindo que o parasito dependendo 
de características genéticas inerentes à cepa, é responsável por disparar e manter o 
processo de patogênese no miocárdio, e que este seria amplificado por mecanismos 
auto-imunes que dependeriam ainda, da predisposição genética do hospedeiro 
(GIRONES e FRESNO, 2003; ÃNEZ et al., 1999; BELLOTI et al., 1996; HIGUCHI, 
1995; ROWLAND et al., 1995; JONES et al., 1993). Diferentes autores têm 
demonstrado a participação ativa do parasito na patogênese da cardiopatia chagásica 
crônica humana (HIGUCHI et al., 1993; JONES et al., 1993, HIGUCHI, 1995, BELLOTI 
et al., 1996, LAGES-SILVA et al., 2001, VAGO et al., 1996), havendo correlação 
19 
 
positiva, entre a inflamação e a presença de T. cruzi no tecido cardíaco e a sua 
ausência em locais sem inflamação. Auto-imunidade envolvendo a formação de 
autoanticorpos ou linfócitos T autoreativos ocorre devido a mimetismo molecular de 
antígenos do parasito e do hospedeiro e de ativação bystander, não envolvendo 
antígenos do T. cruzi, induzida por antígenos procedentes de lesões teciduais (LEON 
et al., 2001; KIERSZENBAUM, 1999; COSSIO et al., 1974; ANSELMI et al., 1966). Na 
infecção humana pelo T. cruzi os autoanticorpos contra antígenos do tecido cardíaco, 
de músculo esquelético e tecido nervoso foram assinalados (KIERSZENBAUM, 1999). 
O mimetismo molecular entre antígenos do parasito e do hospedeiro com formação 
de auto-anticorpos foi descrito para miosina cardíaca, proteína P ribossomal, 
queratina, receptores B-adrenérgicos e de muscarina, proteínas associadas a 
microtúbulos do citoesqueleto e proteínas neuronais, auto-antígeno Cha, troponina T 
(LEVIN et al., 1989; CUNHA-NETO et al., 1996; KERNER et al., 1991, PETRY e 
EISEN, 1989; GIRONES et al., 2001, NUNES et al., 2013) (Figura 1). 
 
Figura 1 - Mecanismos de dano cardíaco que levam a progressão da cardiopatia chagásica 
crônica. O dano tecidual na cardiopatia chagásica inicia-se com a multiplicação do T. cruzi que leva à 
destruição dos cardiomiócitos (I). Iniciando resposta imune específica contra o parasita, mas também 
envolve a liberação de componentes celulares que levam à ativação bystander, onde respostas imunes 
são geradas contra os componentes celulares do próprio hospedeiro (I). A ativação bystander e o 
mimetismo molecular entre antígenos do parasita e do hospedeiro geram autoanticorpos (II e III) e 
células T autorreativas (IV). Os autoanticorpos podem gerar lesões mediadas por atividade do 
complemento (II) e opzonizam o tecido para ativação de macrófagos (III). Células T CD8+ autorreativas 
reconhecem antígenos próprios e destroem o tecido cardíaco (IV). Os linfócitos TCD8 citotoxicos não 
destroem apenas as células infectadas, mas também contribuem para a destruição das células 
adjacentes (VI). A lesão do tecido leva à produção de TNF-, resultando na produção de óxido nítrico. 
A infecção pelo T. cruzi também induz a produção de óxido nítrico diretamente, responsável pela 
20 
 
geração de extenso dano cardíaco derivado do estresse oxidativo (V). O processo imunopatológico 
continua durante a fase crônica da infecção. Apesar dos níveis mais baixos do parasita neste estágio, 
focos inflamatórios intrafasciculares pequenos e progressivos continuam a se desenvolver por anos, 
culminando em fibrose e o desenvolvimento de cardiomiopatia dilatada. Fonte: GUTIERREZ et al. 2009 
(Adaptado). 
 
 
1.3 Resposta imunológica na infecção pelo Trypanosoma cruzi 
 
 
Durante a evolução da infecção pelo T. cruzi, as respostas imunológicas inata 
e adaptativa coexistem, observando-se a produção de citocinas pro-inflamatórias, 
anti-inflamatórias e quimiocinas, as quais são fatores importantes tanto para a 
patogenia quanto a resistência na infecção pelo parasito (DUTRA et al., 1994; 
TEIXEIRA, GAZZINELLI e SILVA, 2002; GOMES et al., 2003; GUEDES et al., 2012). 
A ativação da resposta imune frente ao T. cruzi ocorre por meio do reconhecimento 
de padrões moleculares presentes no parasito por receptores da imunidade inata, 
como receptores semelhantes ao Toll (TLRs), os quais induzem a produção de 
citocinas, quimiocinas e oxido nítrico, modulando a resposta imune adaptativa 
(KAYAMA e TAKEDA, 2010). A análise de animais deficientes de TLRs demostrou 
que o TLR2 (BAFICA et al., 2006), TLR4 (OLIVEIRA et al., 2010), TLR7 (CAETANO 
et al, 2011) e TLR9 (BARTHOLOMEU et al., 2008) desempenham papel na resistência 
à infecção pelo T. cruzi e pode haver sinergismo entre eles (BAFICA et al., 2006; 
CAETANO et al, 2011; RODRIGUES, OLIVEIRA e BELLIO, 2012). 
Após o parasito ser reconhecido por diferentes receptores é fagocitado por 
macrófagos, levando a produção de citocinas pro inflamatórias como interleucina 12 
(IL-12), que atua sobre células natural killer (NK), ativando a produção de mais IL-12 
e IFN-γ. O IFN-γ produzido, juntamente com o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), 
ativa o oxido nítrico sintase induzível (iNOS), levando a síntese de óxido nítrico 
limitando a multiplicação intracelular do parasito (SILVA, TWARDZIK e REED, 1991; 
REIS et al., 1997; HOLSCHER et al., 1998). Estudos demostraram o papel da enzima 
iNOS na resistência a infecção (GAZZINELLI et al., 1992) a partir de sua ativação por 
IFN-γ (SILVA et al., 1992; ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996), TNF-α (SILVA et al., 
1995), IL-12 (ALBERTI et al., 1996) e quimiocinas (MACHADO et al., 2000; ALIBERTI 
et al., 2001). Em contrapartida, a susceptibilidade está associada à produção de IL-
21 
 
10, TGF-β e IL-4, por meio da inibição da geração de nitritos pelos macrófagos 
(WIRTH e KIERSZENBAUM, 1985; ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996; 
HOLSCHER et al., 1998). 
As citocinas produzidas durante a resposta imune inata conduzem a resposta 
imune adaptativa, estimulando a diferenciação de linfócitos T naive para o perfil T 
helper 1 (Th1) que possui o fator de transcrição T-bet, Th2 (GATA-3) (MARINO et al., 
2004; PADILLA, BUSTAMANTE e TARLETON, 2009),Th17 (RORγt) e T reguladores 
(Foxp3) (MARIANO et al., 2008; GUEDES et al., 2010). Os linfócitos Th1 CD4+ 
apresentam múltiplas funções na resistência ao T. cruzi e contribuem como fonte de 
IFN-γ para ativação de macrófagos, e parecem atuar também na diferenciação e 
ativação de linfócitos T CD8+ (BRENER e GAZZINELLI, 1997). Os linfócitos T CD8+ 
possuem papel protetor durante a infeção pelo T. cruzi, visto que destroem células 
infetadas pelo parasito, entretanto são responsáveis pela citotoxicidade contra células 
infectadas pelo parasito e células do hospedeiro, ocasionando citólise e fibrose com 
destruição da miofibra cardíaca (TARLETON, 1991; TARLETON et al., 1994; CUNHA-
NETO, 1995; BRENER e GAZZINELLI, 1997). 
Durante o curso da infecção pelo T. cruzi a ativação de linfócitos B e produção 
de imunoglobulinas também é observada em humanos. Quatro isotipos de 
imunoglobulinas G (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) são produzidos no homem sendo o 
controle na produção destas subclasses mediado por deferentes citocinas (KAWANO, 
NOMA e YATA, 1994). As imunoglobulinas exercem o papel de opsonização do 
parasito com consequente destruição pelo complemento, além de fagocitose por 
macrófagos (MOSMANN e COFFMAN, 1989), e são mecanismos relevantes no 
controle do parasitismo durante a fase crônica da infecção, sendo observada queda 
da parasitemia concomitante com o início da produção de anticorpos (KRETTLI, 
WEISZ-CARRINGTON e NUSSENZWEIG, 1979). 
Para sobreviver e manter a infecção o T. cruzi apresenta estratégias de evasão 
da resposta imunológica; algumas delas são, evitar a lise por complemento usando as 
proteínas de superfície como calreticulina do T. cruzi (TcCRT) que liga-se à C1q e 
Lectina de união a manose (MBL) inibindo ativação da via clássica (RAMIREZ et al., 
2011). Os autores Cestari et al., (2008) sugerem que a molécula CRIT, expressa na 
superfície da forma metacíclica apresenta o domínio ed1 inibindo a digestão de C2 
por Serina proteases associadas a MBL (MASP2), que junto com a gp 58/68 inibem a 
formação de Convertasa 3 (C3) retrasando a ativação da via alternativa do 
22 
 
complemento (FISCHER et al., 1988). Outra das moléculas implicadas no processo 
da evasão é a glicoproteína gp160 também chamada proteína reguladora do 
complemento (CRP), encontra-se na superfície flagelar, liga-se à C3 e C4b afetando 
a via clássica e alternativa respectivamente, segundo o estudo feito por Norris et al., 
(1991) e posteriormente Norris (1998) concluiu que essas proteínas têm capacidade 
de união a Convertasa 4 (C4) obstruindo a via das lectinas, e junto com a proteína 
87/93 chamada fator da aceleração de decomposição de tripomastigota (T-DAF) ou 
CRP-10 obstruem à formação de C3 (SOLANA et al., 2012; CESTARI et al., 2013). 
Estudos têm demostrado que linfócitos do sangue periférico e do tecido 
cardíaco de pacientes com CCC produzem altos níveis de IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-6, 
IL-1B e baixas quantidades de IL-17, IL-4 e IL-10. Em adição, células mononucleares 
do sangue periférico de pacientes com a forma indeterminada da doença produzem 
altos níveis de IFN-γ e TNF-α associados à produção elevada de IL-10 e IL-17 (BAHIA-
OLIVEIRA et al., 1998; CORREA-OLIVEIRA et al., 1999; RIBEIRÃO et al., 2000; ABEL 
et al., 2001; GOMES et al., 2003; GOMES et al., 2005; GUTIERREZ et al., 2009; 
GUEDES et al., 2016; PEREIRA et al., 2018). Recentemente foi demostrado que 
pacientes com CCC apresentam menor quantidade de linfócitos T reguladores ou com 
atividade supressora deficiente, quando comparado a pacientes na forma 
indeterminada, esta atividade supressora deficiente foi correlacionada à baixa 
expressão de Foxp3 e CTLA-4 (ARAUJO et al., 2007; ARAÚJO et al., 2011; GUEDES 
et al., 2012; DIAS et al., 2013; GUEDES et al., 2016). 
 
 
1.4 Diagnóstico etiológico e clínico da Doença de Chagas 
 
 
O diagnóstico laboratorial na fase aguda e crônica da doença de Chagas é 
realizado por exames parasitológicos e/ou sorológicos (CHIARI E BRENER, 1966). O 
diagnóstico etiológico padrão ouro na fase aguda é feito por exames parasitológicos, 
como exame de sangue à fresco, esfregaço sanguíneo corado por giemsa, além do 
uso de métodos de concentração, como o microhematócrito (DIAS et al., 2016-
CONSENSO BRASILEIRO EM DOENÇA DE CHAGAS). Exames sorológicos são 
realizados se os exames parasitológicos forem negativos e a suspeita clínica continuar 
(BOCCHI et al., 2017; VERGARA et al., 2019). Para o diagnóstico sorológico de fase 
23 
 
aguda podem ser realizadas as técnicas de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent 
Assay) e reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para a detecção de IgM 
específica anti-T. cruzi no soro, e ELISA, hemaglutinação e RIFI para a detecção de 
IgG específica anti-T. cruzi no soro, sendo recomendada duas coletas com intervalos 
de 4 a 6 semanas entre elas (DIAS et al., 2016-CONSENSO BRASILEIRO EM 
DOENÇA DE CHAGAS). O diagnóstico laboratorial da doença de Chagas na fase 
crônica deve ser confirmado pela utilização de dois testes sorológicos com princípios 
diferentes (ELISA, RIFI, HAI) para pesquisa de anticorpos IgG anti-T. cruzi no soro 
(CAMARGO E TAKEDA, 1979, DIAS et al., 2016). 
O diagnóstico clínico da fase aguda da doença de Chagas é realizado no 
paciente sintomático, entre os sinais clínicos podem ser detectados os sinais de porta 
de entrada, sinal de Romaña e/ou chagoma de inoculação, seguidos de sinais e 
sintomas inespecíficos, como febre, linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, 
cardiomegalia, meningoencefalite (RASSI, et al., 2000). A avaliação clínica da fase 
crônica da doença de Chagas envolve avaliação das alterações cardíacas e 
digestivas, confirmadas pelo eletrocardiograma e/ou ecocardiograma e por raios X de 
tórax e abdômen (enema opaco) (RASSI, RASSI e MARCONDES DE REZENDE, 
2012; DIAS et al., 2016; PEREZ – MOLINA e MOLINA, 2018). Métodos aplicados para 
o diagnóstico e seguimento da doença são pouco acessíveis por custos e a 
localização dos centros especializados, são invasivos e desconfortáveis de serem 
realizados, além de dependerem de pessoal especializado para a realização. Dessa 
forma muitas vezes não são realizados contribuindo à evolução clínica da doença, 
aumentando a mortalidade e morbidade associados a Doença de Chagas. Assim, faz-
se necessário a busca de marcadores não invasivos e que possam ser utilizados em 
exames de rotina, como ELISA, para acompanhamento da evolução clínica do 
paciente. 
 
1.5 Biomarcador 
 
Devido ao risco de morte súbita pela CCC, procura-se a presença de um 
biomarcador que determine o progresso da doença ou que possa indicar o nível de 
acometimento, nesse sentido Strimbu et al., (2010) definem biomarcador, como uma 
24 
 
substância, enzima, hormônio, estrutura ou processo que permite medir e avaliar um 
processo biológico indicando valor clínico dentro dos parâmetros estabelecidos como 
normais ou patológicos. Além disso, é imprescindível que seja sensível, estável e 
quantificável. Os biomarcadores têm alta variabilidade devido ao importante uso na 
rotina clínica, alguns exemplos são os marcadores biológicos de tipo proteico, que são 
os de interesse nesse projeto, eles auxiliam no diagnóstico ao Infarto Agudo do 
Miocárdio (IAM), como as troponinas e mioglobina que conformam o perfil cardíaco, 
geralmente essas proteínas auxiliam na escolha do tratamento e predição de eventos 
após a Síndrome Coronário Agudo (SCA) (REQUENA et al., 2013). 
 
1.5.1 Mioglobina, Troponina I 
 
A mioglobina (MYO) é uma proteína citoplasmática que se encontra nos 
músculos esquelético e cardíaco de mamíferos e possui importante função de 
armazenamento de oxigênio (Antonini e Brunori, 1971). Os níveis séricos de 
mioglobina aumentam 1 a 2 horas após início dos sintomas de infarto agudo do 
miocárdio, por possuir baixo peso molecular é um dos primeiros biomarcadores 
avaliados após lesão isquêmica do miocárdio (MIRANDAet al., 2014; CAVALCATI et 
al., 1998). Keating et al., (2015) e Fan et al., (2017) indicam que a MYO pode ser 
empregada como biomarcador de lesão cardíaca, além de ser empregada no 
diagnóstico precoce do dano miocárdico. 
As troponinas, são proteínas estruturais das miofibrilas que atuam na regulação 
da contração e relaxamento dos músculos estriado, cardíaco e esquelético. As 
troponinas estão formadas por três subunidades proteicas distintas, a troponina I que 
regula o processo contrátil mediado pelo cálcio nos músculos estriados, a troponina T 
que fixa o complexo da troponina à tropomiosina e a troponina C que contém os locais 
de ligação do cálcio regulando a contração muscular. As três subunidades juntas 
formam o complexo da troponina (KATZ, 1996; ALBERTS e LEWIS, 2010; CORTES-
SERRA et al., 2020). As Troponinas I (cTnI) e (cTnT) são consideradas padrão ouro 
no diagnóstico do infarto agudo do miocárdio devido a sua alta especificidade cardíaca 
(PLATEK et al., 2015). Os níveis elevados de cTnI estão associados a maior dano 
cardiovascular e sua concentração aumenta nas diferentes formas da Doença de 
25 
 
Chagas (ARAS et al., 2003), podendo ser utilizada na detecção precoce da inflamação 
no miocárdio (FAN et al., 2017). As troponinas cardíacas presentes no sangue são 
marcadores de escolha de dano no miocárdico. O fato de normalmente não serem 
encontrados na circulação proporciona um alto nível de sensibilidade e especificidade 
clínica, mesmo quando as lesões cardíacas são pequenas. Após lesão miocárdica, as 
troponinas entram na circulação, onde podem ser utilizadas para o diagnóstico de 
síndromes coronarianas agudas e para o prognóstico (HORWICH et al., 2003). A 
presença de troponina na circulação pode induzir a formação de autoanticorpos. A 
presença de autoanticorpos anti-troponina I pode estar associado a doenças 
autoimunes e inflamatórias que envolvem dano cardíaco, podendo ser aplicados como 
biomarcadores de diagnóstico e prognóstico (VILELA et al., 2017). Autoanticorpos 
anti-troponina I poderiam induzir dano, disfunção e dilatação do coração na Doença 
de Chagas. Em indivíduos que apresentaram infarto agudo do miocárdio a presença 
da proteína mioglobina e troponina I, além dos autoanticorpos contra essas proteínas 
correlacionam-se com maior morbidade (PETTERSSON et al., 2009). 
 
1.5.2 CTLA-4 
 
Entre os mecanismos que favorecem a manutenção da tolerância periférica 
destaca-se a participação de moléculas coinibitórias, como CTLA-4 (Cytotoxic T 
Lymphocyte-Associated Antigen-4), que inibe o processo de ativação das células T. 
O Antígeno-4 associado a linfócito T citotóxico (CTLA-4 - Cytotoxic T Lymphocyte-
Associated Antigen-4), também conhecido como CD152 é uma molécula que interage 
com os ligantes B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) para controlar a proliferação e ativação 
das células T. Essa molécula é expressa na superfície dos linfócitos T reguladores, e 
é importante para regular a resposta inflamatória das células T no tecido cardíaco 
evitando e dano tecidual e perda da função (MARTINS et al., 2004; GRABIE, 
LICHTMAN e PADERA, 2019). Células T reguladoras TCD4+CD25+ (TREG) podem 
ser a principal fonte de citocinas (IL-10 e TGF-β) que suprimem a resposta inflamatória 
no coração dos pacientes chagásicos, controlando a patogênese. Ainda, além de sua 
função supressora ser dependente de fatores solúveis (citocinas), o contato célula-
célula via B7 (CD80 e CD86) da célula apresentadora de antígeno com o CTLA-4 da 
TREG aumenta a função desta célula, levando ao aumento de citocinas regulatórias 
26 
 
e moléculas coinibitórias (LEVINGS et al., 2001; DIECKMANN et al., 2001, SHEVACH 
et al., 2002, GUEDES et al., 2012). A molécula de CTLA-4 pode controlar a 
proliferação de linfócitos T CD4+ e TCD8+ (GOMES et al., 2003). 
O CTLA-4+ apresenta polimorfismos genéticos que alteram a regulação imune 
durante a infecção com o T. cruzi contribuindo ao desenvolvimento das diferentes 
formas clínicas (FRISANCHO et al., 2006). Linfócitos T reguladores obtidos do sangue 
periférico de pacientes com cardiopatia chagásica crônica possuem atividade 
supressora deficiente, quando comparado a pacientes na forma indeterminada, esta 
atividade supressora deficiente foi correlacionada à baixa expressão de Foxp3 e 
CTLA-4 (GUEDES et al., 2012). Outros autores demonstraram que pacientes 
portadores da forma indeterminada apresentam maior número de linfócitos T 
reguladores que expressam maiores níveis de CTLA-4, em comparação com 
pacientes cardíacos (DIAS et al., 2013; De ARAÚJO et al., 2011). 
Até o momento não existem biomarcadores de evolução clínica descritos para 
a doença de Chagas, sendo necessário a realização de exames clínicos de alto custo 
(eletrocardiograma, ecocardiograma, raio X, enema opaco), que necessitam da 
presença de profissionais especializados, em muitos casos são invasivos e 
desconfortáveis aos pacientes, e difícil de serem realizados devido ser necessário o 
descolamento do paciente de sua residência para centros especializados. A molécula 
CTLA-4 é expressa em células T reguladoras e encontra-se solúvel no plasma 
sanguíneo. Os autoanticorpos derivados de proteínas cardíacas são gerados após 
lesão de cardiomiócitos pelo parasito e podem contribuir para o mecanismo de 
patogenia, além de serem promissores para utilização como marcadores clínicos da 
doença de Chagas. A pesquisa de biomarcadores de prognóstico clínico tem intuito 
de minimizar os custos dos exames periódicos invasivos e beneficiar o atendimento 
dos indivíduos de baixa renda, além de buscar um melhor entendimento da história 
natural da doença de Chagas. Até o momento não existem trabalhos na literatura que 
avaliaram a produção de autoanticorpos anti-troponina I, anti-mioglobina e a 
concentração sérica de CTLA-4 ao desenvolvimento das formas clínicas da doença 
de Chagas. Assim, esse estudo teve como objetivo avaliar autoanticorpos anti-
troponina I, anti-mioglobina e a molécula CTLA-4 solúvel no soro como biomarcadores 
clínicos não invasivos para a cardiopatia chagásica crônica. 
 
27 
 
2. OBJETIVOS 
 
 2.1 Objetivo geral 
 
Avaliar biomarcadores para a cardiomiopatia chagásica crônica. 
 
 2.2 Objetivos específicos 
 
• Padronizar a técnica de ELISA para detecção de autoanticorpos anti-troponina 
I e anti-mioglobina; 
• Verificar se a produção de CTLA-4 solúvel e dos autoanticorpos contra 
troponina I e mioglobina podem ser utilizados como marcadores da forma 
cardíaca da doença de Chagas; 
• Verificar se a concentração de CTLA-4 solúvel e autoanticorpos anti-troponina 
I e anti-mioglobina estão correlacionados à redução da fração de ejeção do 
ventrículo esquerdo, aumento do índice cardiotorácico e do diâmetro do átrio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
 
 3.1 Delineamento experimental 
 
 
Figura 2 - Delineamento experimental. Fonte: Autoria própria. 
 
 
3.2 População de estudo 
 
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade do 
Estado do Rio Grande do Norte sobre o protocolo Nº 027.2011 com o consentimento 
livre e esclarecido de todos os participantes (Anexo A). Todos os experimentos 
descritos foram realizados em conformidade com os princípios éticos contidos nas 
diretrizes do Conselho Nacional de Saúde e declaração de Helsinki sobre pesquisa 
envolvendo seres humanos (CEP/CONEP, 2015). 
 
29 
 
Foram coletadas 90 amostras de pacientes chagásicos crônicos portadores das 
diferentes formas clínicas da doença provenientes dos municípios Alexandria, Apodi, 
Caraúbas, Governador Dix-Sept Rosado, Ipanguacu, Mossoró, Pendências, Rodolfo 
Fernandes, Serra do Mel, Severiano Melo e Caicó, que fazem parte da mesorregião 
do Estado do Rio Grande do Norte. Como controle negativo foram utilizadas amostras 
de 30 indivíduos saudáveis da mesma mesorregião (Figura 3). 
 
 
Figura3 - Localização dos municípios de procedência dos pacientes. Fonte: Google Earth. E IBGE; 
Malha Municipal. Base Cartográfica contínua do Brasil, 2015. (Adaptado). A localização dos municípios 
de procedência dos pacientes. A - Estado do Rio Grande do Norte destacado em vermelho; B – 
Municípios de procedência dos pacientes chagásicos crônicos e controles negativos. 
 
O critério de inclusão adotado foi baseado na sorologia convencional reativa 
para a infecção pelo T. cruzi. Todas as amostras obtidas foram submetidas à triagem 
sorológica por métodos com princípios distintos Chagastest® HAI screening A-V, 
ELISA recombinante (WienerLab®, Rosário, Argentina) e Imunofluorescência Indireta, 
usando como antígeno as formas epimastigotas do T. cruzi da cepa Y mantidas em 
cultivo e fixadas com formaldeído a 20%. A imunoglobulina anti-IgG humana marcada 
com isotiocianato de fluoresceína (Sigma ChemicalCompany®, Missouri, USA) foi 
utilizada como conjugado, e como ponto de corte o título 1: 80. Após o recrutamento, 
todos os pacientes com resultado reativo na sorologia confirmatória por Western blot 
(TESAcruzi, bioMérieux Brasil) foram submetidos a uma avaliação clínica completa, 
incluindo eletrocardiograma (ECG) e radiografia do tórax, 2D-ecocardiograma, raio x 
contrastado de esôfago e colón, para os casos com alterações cardíacas foi realizada 
a avaliação pelo Holter durante 24h. 
A B
30 
 
Em seguida, os pacientes selecionados foram classificados de acordo com à 
forma clínica da seguinte maneira: pacientes com ausência de alterações 
eletrocardiográficas e radiográficas sugestivas de envolvimento cardíaco ou 
gastrointestinal, classifica-se na forma indeterminada (IND, n=30); pacientes com 
presencia exclusivamente de alterações cardíacas, categoriza-se na forma cardíaca 
(CARD, n=30); pacientes com alterações no esôfago e colón agrupa-se na forma 
digestiva (DIG, n=14), por último, os pacientes com megaesôfago ou megacolón 
associados a cardiomiopatia cataloga-se na forma cardiodigestiva (CARDIG, n=16) 
(Figura 2). 
 
3.3 Avaliação clínica 
 
A avaliação clínica foi conduzida em todos os pacientes e os dados publicados 
pelo médico colaborador Prof. Dr. Cléber Mesquita de Andrade (UERN), que foram 
submetidos ao ecocardiograma abrangente com mapeamento de fluxo em cores 
(VIVID e, GE Healthcare, USA). A fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) foi 
calculada de acordo com a regra de Simpson modificada (método biplano). O Holter 
24h foi empregado apenas em pacientes com CCC usando um sistema de três canais 
de gravação portátil (Cardiolight®, Cardios, São Paulo, Brasil) e analisada num 
sistema DMI-CardiosHolter 8300, utilizando técnica semiautomática. Os pacientes 
foram incentivados a continuar suas atividades normais durante o período de 
gravação (SILVA, 2018). 
Os exames foram realizados e analisados por um observador experiente, que 
desconhece o perfil sorológico, as medições de anticorpos e dados clínicos dos 
participantes. Todas as coletas e exames foram realizados antes do tratamento 
específico com o fármaco benzonidazol e um ano após da terapêutica quando os 
pacientes foram novamente recrutados e os exames clínicos e imunológicos 
realizados (Tabela 1). 
 
 
 
31 
 
Tabela 1 - Características clínicas dos pacientes chagásicos crônicos provenientes do Estado do Rio 
Grande do Norte. Fonte: Autoria própria. 
 
Variáveis/ Formas 
clínicas 
Indeterminada Cardíaca Digestiva Cardiodigestiva Total 
Gênero 
(Masculino/ 
Feminino) 
M=11/30 (37%) 
F= 19/30 (63%) 
 
Total: 30/90 (33%) 
M=16/30 (53%) 
F= 14/30 (47%) 
 
Total: 30/90 (33%) 
M= 5/14 (36%) 
F=9/14 (64%) 
 
Total: 14/90 (16%) 
 
M= 9/16 (56%) 
 
F= 7/16 (44%) 
 
Total: 16/90 (18%) 
 
M=41/90 (46%) 
 
F=49/90 (54%) 
 
Total: 90 (100%) 
 
Idade-Anos 44,1± 10,11 49± 11,25 57.6± 8.9 65 ± 10.6 - 
Presença de 
megacolon 
- - 
8/14 (58%) 9/16 (56%) 17/90 (19%) 
Presença de 
megaesófago 
- - 
3/14 (21%) 3/16 (19%) 6/90 (7%) 
Presença de 
megacólon e 
megaesôfago 
 
- - 
3/14 (21%) 
 
 
4/16 (25%) 
 
 
7/90 (8%) 
 
Tamanho do 
sigmóide (cm) 
4.41±0.57 
 
4.5±0.71 
 
7.72±4.6 
 
7.96±2.87 
 
- 
Tamanho do Reto 
(cm) 
4.89±0.81 5.72±0.89 7.5±31 
 
6.36±1.89 - 
Índice 
Cardiotorácico/ICT 
0,449±0,04 0,478±0,037 0,429±0,035 
 
0,496±0,048 - 
Fração de ejeção 
do ventrículo 
esquerdo/FEVE 
(%) 
64,6±6,8 63,3±13,1 67,0±7,8 
 
53,8±13,6 
- 
 
 
 
3.4 ELISA para quantificação de autoanticorpos e CTLA-4 
 
O método ELISA (Enzyme-Liked Immunosorbent Assay) de tipo indireto foi 
utilizado para a dosagem de IgG total (VOLLER, 1976). As proteínas mioglobina 
(SIGMA. M6036 – 250 µg/ 125µL. Liquido), troponina I (SIGMA. T 9924; 20 µg/ 200µL. 
Liofilizado) e a forma epimastigota da cepa Y de T. cruzi em meio acelular (Liver 
Tryptoseinfusion - LIT) foram utilizados como antígenos e dosados pelo método 
descrito (LOWRY et al., 1951). Posteriormente foi realizada a titulação em bloco 
visando definir a concentração mínima de antígeno para a sensibilização das placas 
plásticas de fundo chato com 96 poços (Corning/Costar, 3590). As concentrações 
32 
 
utilizadas foram 7,5µg/mL (antígeno epimastigota), 0,496µg/mL (antígeno de 
mioglobina) e 0,062µg/mL (antígeno de Troponina I). O conjugado utilizado para a 
dosagem de IgG total foi anti-imunoglobulina humana obtida de soro imune de 
camundongo marcadas com peroxidase (Sigma Chemical Company, St. Louis, USA). 
As placas de ELISA foram sensibilizadas com 100µL do antígeno diluído em 
solução tampão carbonato/bicarbonato (15 mM Na2CO3, 34 mM NaHCO3, pH 9,6) e 
incubadas 24h a 4°C durante a noite. Após a incubação, as placas sensibilizadas 
foram submetidas a uma série de quatro lavagens com PBS-T (salina tamponada com 
fosfato) contendo 0,05% de Tween 20 para remover o excesso de solução antigênica 
e eventuais sítios de ligação, logo após se adicionou a solução de bloqueio que 
contem PBS e 1% de SBF (soro bovino fetal) e as placas foram incubadas a 37°C por 
45 min. Após novas lavagens adicionou-se às placas soro humano diluído em PBS-T, 
então as placas foram novamente incubadas por 45 min a 37°C. Em seguida, as 
lavagens foram repetidas e as placas foram incubadas com 100µL de conjugado de 
peroxidase com anticorpo específico diluído em PBS-T a 37°C por 45 min. As últimas 
lavagens foram seguidas pela solução de 100µL do substrato TMB e 20µL de peróxido 
de hidrogênio (ambos, LGC Biotecnologia) por 10min a 37°C protegido da luz. A 
reação foi interrompida pela adição de 32µL por poço de uma solução de ácido 
sulfúrico 2,5M e a leitura das placas foi realizada em espectofotómetro com filtro de 
450nm (Leitora de Microplacas Mindray®, model MR- 35 96A, Shenzhen, China), e os 
resultados foram expressos em absorbância. O cut-off foi calculado usando a 
absorbância média dos controles negativos e dois desvios padrão. 
A dosagem de CTLA-4 foi realizada por meio de ELISA do tipo sandwich 
utilizando o kit Platinum ELISA Human CTLA-4 (affymetrix eBioscience) seguindo as 
recomendações do fabricante. A placa sensibilizada contendo anti-CTLA4 humano 
disponibilizada no kit foi submetida a duas lavagens com 400µL de solução de 
lavagem (PBS 1% Tween 20) para eliminar o excesso de anticorpo. Posteriormente, 
foi adicionado 100µL de solução diluente de amostra nos poços da curva padrão e do 
branco, para os poços das amostras foram adicionados 90µL dessa mesma solução 
e 10µL de soro. O CTLA4 recombinante foi reconstituído em água destilada (20ng/ml) 
e aplicado 100 µL no primeiro poço da curva padrão que continha 100µL de solução 
diluente de amostras (diluição 1:2, concentração inicial da curva padrão foi 10ng/ml), 
sendo realizada diluição seriada, com transferência de 100µL da amostra ao poço 
33 
 
seguinte. Posteriormente foi diluído o conjugado biotinilado (1:100) em tampão de 
ensaio (PBS 1% tween20 10% BSA) e adicionado 50µL a todosos poços, a placa foi 
coberta com adesivo e incubada a temperatura ambiente (24°C) por 2 horas protegido 
da luz. Após a incubação foram realizadas três lavagens com 400µL de solução de 
PBS contendo 1% Tween20. A Streptavidina-HRP foi diluída 1:100 em tampão de 
ensaio (PBS 1% tween20 10% BSA) e adicionado 100µL em todos os poços, a placa 
foi coberta com adesivo e incubada a temperatura ambiente (24°C) por 1 hora 
protegido da luz. O adesivo da placa foi removido e realizadas três lavagens com 
400µL de solução de PBS contendo 1% Tween20. Em seguida, foi adicionado 100µL 
de TMB e a placa incubada por 30min a temperatura ambiente (24°C) protegida da 
luz. A reação foi interrompida com 100µL de solução de bloqueio (H2SO4 2,5M) e a 
leitura da placa foi realizada em espectofotómetro com filtro de 450nm (Leitora de 
Microplacas Mindray®, model MR- 35 96A, Shenzhen, China), os resultados foram 
expressos em absorbância e interpretados segundo a curva padrão para cálculo da 
concentração de CTLA4 solúvel por ml de soro. 
 
 
3.5 Análise estatística 
 
 
Todas as análises foram realizadas aplicando o programa estatístico Instat e o 
software PRISM® 7.0 (GraphPad, San Diego, CA, USA). Para a verificação da 
distribuição normal dos dados, foram empregados os testes Shapiro-Wilk e 
Kolmogorov-Smirnov. Para comparação entre a produção de autoanticorpos IgG anti-
mioglobina, anti-troponina I e CTLA-4 solúvel no soro de pacientes chagásicos 
crônicos portadores das diferentes formas clínicas da doença de Chagas foi utilizado 
o teste de Kruskall-Wallis. A correlação entre o índice cardiotorácico, fração de ejeção 
do ventrículo esquerdo, diâmetro do átrio com os marcadores foram realizados através 
do teste não paramétrico de Spearman. As diferenças foram consideradas 
significativas quando o valor de p foi menor que 0,05 (p <0,05). 
 
 
 
 
34 
 
4. RESULTADOS 
 
Inicialmente, a produção de IgG total específica anti-T. cruzi foi determinada 
em pacientes chagásicos portadores das formas indeterminada, cardíaca, digestiva e 
cardiodigestiva. Foi observada maior produção de IgG específica anti-T. cruzi nos 
grupos de pacientes com doença de Chagas, quando comparado ao grupo controle 
(Figura 4). Pacientes portadores da forma cardíaca (absorbância: 1,05), 
cardiodigestiva (1,10) e digestivos (0,9) apresentaram uma média maior de produção 
de anticorpos específicos anti-T cruzi, quando comparado a pacientes indeterminados 
(0,75) (Figura 4). 
 
 
Figura 4- Pacientes chagásicos produzem altos níveis de anticorpos IgG específicos anti-
Trypanosoma cruzi. Concentração de IgG específica anti-T. cruzi no soro de indivíduos controle 
negativo (n=30), e de pacientes chagásicos crônicos portadores da forma cardíaca (n=30), 
cardiodigestiva (n=16), digestiva (n=14) e indeterminada (n=30). ***p<0,001. Fonte: autoria própria. 
 
 
 
35 
 
Pacientes chagásicos portadores das formas clínicas indeterminada, cardíaca, 
digestiva e cardiodigestiva apresentaram maior produção de autoanticorpos IgG anti-
troponina I quando comparados aos indivíduos não infectados (Figura 5). Pacientes 
portadores da forma cardíaca (absorbância: 0,74), cardiodigestiva (0,77) e digestiva 
(0,60) apresentaram uma média maior de produção de autoanticorpos anti-troponina 
I, quando comparado a pacientes indeterminados (0,44) (Figura 5). 
 
 
 
 
Figura 5: Pacientes chagásicos crônicos produzem altos níveis de autoanticorpos anti-
Troponina-I. Concentração de IgG total anti-Troponina I no soro de indivíduos controle negativo (n=30), 
e de pacientes chagásicos crônicos portadores da forma cardíaca (n=30), cardiodigestiva (n=16), 
digestiva (n=14) e indeterminada (n=30). ***p<0,001. Fonte: autoria própria. 
 
 
 
 
 
 
36 
 
Pacientes chagásicos portadores das formas clínicas indeterminada, cardíaca, 
digestiva e cardiodigestiva apresentaram maior produção de autoanticorpos IgG anti-
mioglobina, quando comparados aos indivíduos não infectados (Figura 6). Ademais, 
pacientes com a forma cardíaca da doença apresentaram maior produção de 
autoanticorpos IgG anti-mioglobina comparado a pacientes com a forma 
indeterminada (Figura 6). 
 
 
Figura 6: Pacientes chagásicos crônicos portadores da forma cardíaca produzem altos níveis 
de autoanticorpos anti-Mioglobina. Concentração de IgG total anti-Mioglobina no soro de indivíduos 
controle negativo (n=30), e de pacientes chagásicos crônicos portadores da forma cardíaca (n=30), 
cardiodigestiva (n=16), digestiva (n=14) e indeterminada (n=30). ***p<0,001; *p<0,05. Fonte: autoria 
própria. 
 
 
 
Ao analisar a concentração do CTLA-4 solúvel no foi constatado que pacientes 
com a forma clínica indeterminada produzem níveis semelhantes a indivíduos 
controles saudáveis (Figura 7). De maneira interessante, pacientes portadores da 
37 
 
forma indeterminada apresentaram maior concentração de CTLA-4 solúvel no soro, 
quando comparado a indivíduos portadores das formas clínicas cardíaca, digestiva e 
cardiodigestiva (Figura 7). 
 
 
Figura 7- Pacientes chagásicos crônicos portadores das formas cardíaca, digestiva e 
cardiodigestiva apresentam reduzida concentração de CTLA-4 solúvel no soro. Concentração de 
CTLA-4 no soro de indivíduos controle negativo (n=30), e de pacientes chagásicos crônicos portadores 
da forma cardíaca (n=30), cardiodigestiva (n=16), digestiva (n=14) e indeterminada (n=30). **p<0.01, 
*p<0.05. Fonte: autoria própria. 
 
 
 
Com intuito de verificar a participação de autoanticorpos anti-troponina-I, anti-
mioglobina e de CTLA4 solúvel no desenvolvimento das lesões cardíacas na doença 
de Chagas foram realizadas correlações entre a fração de ejeção do ventrículo 
esquerdo (FEVE), índice cardiotorácico (ICT) e diâmetro do átrio com a produção de 
anticorpos IgG específicos anti-T cruzi, autoanticorpos anti-troponina-I, anti-
mioglobina e CTLA4 solúvel com auxílio do teste de Spearman. Não foi observada 
correlação significativa entre os achados clínicos e a produção de autoanticorpos anti-
troponina-I, anti-mioglobina e CTLA4 solúvel no soro. 
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*
38 
 
5. DISCUSSÃO 
 
No presente estudo avaliou-se a produção de autoanticorpos anti-Mioglobina, 
anti-Troponina I, a concentração de CTLA-4 solúvel e a possível associação com o 
desenvolvimento da CCC ou como marcador para diagnóstico clínico da forma 
cardíaca da doença de Chagas. Pacientes chagásicos crônicos portadores da forma 
cardíaca da doença apresentam maior produção de autoanticorpos IgG anti-
mioglobina comparado a pacientes com a forma indeterminada. Ademais, pacientes 
indeterminados apresentam maior produção de CTLA-4 solúvel, quando comparado 
a indivíduos portadores das formas clínicas cardíaca, digestiva e cardiodigestiva. 
Inicialmente, foi quantificada a produção de anticorpos específicos anti-T.cruzi, 
sendo observada alta produção de IgG em pacientes chagásicos crônicos, comparado 
a indivíduos não infectados. Pacientes portadores da forma cardíaca e cardiodigestiva 
apresentaram maior de produção de anticorpos específicos anti-T cruzi, quando 
comparado a pacientes digestivos e indeterminados. Estes resultados corroboram 
com resultados da literatura, que descreve títulos reduzidos de IgG específico anti-T 
cruzi em pacientes com a forma indeterminada da doença de Chagas, enquanto 
pacientes sintomáticos portadores das formas cardíaca, digestiva e cardiodigestiva 
apresentam exacerbada resposta imune humoral (MONTEÓN-PADILLA et al., 1999; 
D’AVILA et al., 2009; NUNES et al., 2013; APT et al., 2015). A elevada produção de 
IgG total específica anti-T. cruzi em pacientes chagásicos crônicos portadores da 
forma cardíaca e cardiodigestiva da doença de Chagas observada no presente estudo 
pode ser devido a maior carga parasitária e estimulação de linfócitosT e B, 
conduzindo a maior produção de anticorpos. Efetivamente, a carga parasitária tem-se 
mostrado importante no mecanismo de lesão cardíaca na infecção pelo T. cruzi 
(VAZQUEZ et al., 2015; DE MELO MEDEIROS et al., 2010). 
Estudos recentes relatam infecções orais devido a ingestão de formas 
tripomastigotas metacíclicas do parasita em alimentos contaminados, como o caldo 
de cana e o suco de açaí (YOSHIDA, 2008). Nesses casos, a quantidade de inoculo 
e a patogenicidade da cepa podem determinar a gravidade da doença (MONTEIRO 
et al., 2010). A carga parasitária durante a infecção pelo T. cruzi pode influenciar a 
ativação da resposta imune e a patologia da doença na fase crônica da doença de 
Chagas (MARINHO et al., 2009). Além disso, pacientes que apresentam formas 
39 
 
clínicas específicas da doença de Chagas, como a forma cardíaca, podem ter 
persistência do parasita que poderia manter a ativação imunológica, que seria 
responsável por aumento do dano tecidual em hospedeiros suscetíveis (MONTEON-
PADILLA et al., 2001). 
Efetivamente, a carga parasitária tem mostrado importante no mecanismo de 
lesão do miocárdio na infecção pelo T. cruzi. Camundongos infectados com inóculos 
crescentes da cepa Y do T. cruzi apresentaram progressivamente maior inflamação, 
fibrose e destruição tecidual com perda da inervação (BORGES et al., 2012). A 
literatura mostra que a denervação durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi é 
resultado da produção de IFN-γ e TNF-α com consequente ativação da enzima iNOS 
e produção de oxido nítrico (SILVA et al., 1991; ALIBERT et al., 1996; TALVANI et al., 
2000; ARANTES et al., 2004). 
Dados da literatura demonstram a produção de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 
específicas anti-T. cruzi em todos os grupos de pacientes chagásicos crônicos, sendo 
detectado alta produção de IgG1 e IgG3 e menor produção de IgG2 e IgG4 (CERBAN 
et al., 1993; D’ AVILA et al., 2009; NUNES et al., 2013). IgG1 auxilia a lise de formas 
tripomastigotas por meio da ligação da proteína C1q e a fagocitose por macrófagos, 
enquanto IgG2 está envolvido com a imunidade mediada por células efetoras não 
fagocitárias (FANGER et al., 1991). A produção de todos os isotipos de IgG indica a 
presença de resposta imune mista entre linfócitos auxiliares tipos Th1 e Th2. A 
produção de imunoglobulinas é estimulada por meio de citocinas pertencentes aos 
perfis Th1 e 2 de diferenciação de linfócitos T CD4 (REIS et al.,1997; BAHIA-
OLIVEIRA et al.,1998; ABEL et al.,2001; GOMES et al.,2003; GUTIERREZ et al., 
2009). A produção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-12, IFN-γ e TNF-α (perfil 
Th1), induzirão a produção de IgG1 e IgG3, enquanto citocinas anti-inflamatórias, IL-
4 e IL-10 (perfil Th2), promoverão a produção de IgG2 (BRIERE et al., 1994; KAWANO 
et al., 1994). Em pacientes, IgG1 e IgG2 correspondem a aproximadamente 90% do 
total de imunoglobulina G produzida (WATTHANAKULPANICH et al., 2008). 
Trabalhos recentes demonstram a presença de linfócitos T reguladores, Th9, Th17 e 
Th22 em pacientes chagásicos crônicos (GUEDES et al., 2012, 2016). O mecanismo 
pelo qual as citocinas produzidas por estas respostas imunológicas poderiam 
influenciar a produção de imunoglobulinas em pacientes chagásicos ainda não foi 
demonstrado. 
40 
 
Já foram identificados autoanticorpos em pacientes chagásicos crônicos contra 
miosina cardíaca, proteína P ribossomal, queratina, receptores B-adrenérgicos e de 
muscarina, proteínas associadas a microtúbulos do citoesqueleto, actina, tubulina, 
proteínas neuronais, auto-antígeno Cha, troponina T (BERGAMI et al., 2001; LEVIN 
et al., 1989; CUNHA-NETO et al., 1996; KERNER et al., 1991, PETRY e EISEN 1989, 
GIRONÉS et al., 2001, NUNES et al., 2013). Entretanto a produção de autoanticorpos 
anti-mioglobina e troponina I em pacientes chagásicos crônicos ainda não foi avaliada. 
No presente estudo foi observada elevada produção de autoanticorpos anti-
mioglobina e anti-troponina I em pacientes chagásicos crônicos, demonstrando que a 
infecção crônica pelo T. cruzi induz a produção de autoanticorpos da classe IgG anti-
troponina I e anti-mioglobina. Foi demonstrado em modelo murino de cardiomiopatia 
autoimune que anticorpos específicos anti-troponina I interagem com a troponina I na 
superfície dos cardiomiócitos e aumentam a corrente de Ca2+, resultando em 
disfunção e dilatação cardíaca (OKAZAKI et al., 2003). A troponina I cardíaca (cTpnI) 
é um membro do complexo troponina, responsável por regular a contração do músculo 
cardíaco. Pacientes com cardiopatia isquêmica e idiopática apresentam elevados 
níveis séricos de autoanticorpos anti-troponina I (SHMILOVICH et al., 2007). 
Camundongos imunizados com troponina I cardíaca recombinate, apresentam 
inflamação grave do miocárdio, cardiomegalia, fibrose e mortalidade (GOSER et al. 
2006). Dessa forma, autoanticorpos anti-Troponina I poderiam influenciar no 
desenvolvimento da forma cardiíaca da doença de Chagas. Níveis séricos elevados 
de troponina I são observados em pacientes com doenças cardiovasculares que 
tiveram parada cardíaca, sugerindo como biomarcador preditor de morte em paciente 
com doença cardiovascular (LEUSCHNER et al., 2008, PLATEK et al., 2015; VILELA 
et al., 2017). 
Dados da literatura mostram que pacientes chagásicos crônicos portadores de 
cardiopatia apresentam níveis séricos maiores de troponina I e mioglobina, 
marcadores associados à disfunção cardíaca em comparação com pacientes que não 
possuem cardiopatia chagásica crônica (KEATING et al., 2015; FAN et al., 2017). 
Indicando que a presença de mioglobina e troponina I séricas estão associadas a 
lesão cardíaca e podem induzir a produção de autoanticorpos que poderiam auxiliar a 
patogênese cardíaca e/ou servir como marcador clínico. Nossos, resultados 
demonstram que pacientes chagásicos crônicos portadores da forma cardíaca da 
41 
 
doença apresentam maior produção de autoanticorpos IgG anti-mioglobina 
comparado a pacientes com a forma indeterminada. A mioglobina é um transportador 
de oxigênio contribuindo substancialmente para o suprimento de oxigênio 
mitocondrial. Dados da literatura demonstram que as concentrações cardíacas de 
mioglobina encontram-se reduzidas em vários modelos de insuficiência cardíaca 
crônica (ICC) (WITTENBERG et al., 1975). Entretanto, não existem relatos sobre a 
concentração de mioglobina ou autoanticorpos anti-mioglobina em pacientes 
chagásicos crônicos descritos na literatura. Autoanticorpos contra miosina, troponina, 
tropomiosina e mioglobinha têm sido observados com alta frequência em doenças 
autoimunes da tireoide (JASANI et al., 1999; RUCHALA M ET AL, 2007). 
Nossos resultados demonstram que pacientes indeterminados apresentam 
maior produção de CTLA-4 solúvel, quando comparado a indivíduos portadores das 
formas clínicas cardíaca, digestiva e cardiodigestiva. Não existem dados na literatura 
sobre a quantificação dos níveis séricos de CTLA-4 em pacientes chagásicos 
crônicos. Entretanto, o CTLA-4 é expresso em Células T reguladoras TCD4+CD25+ 
(TREG) (SHEVACH, 2002). As TREG são uma fonte importante de citocinas 
regulatórias e estão envolvidas no controle da resposta inflamatória no tecido cardíaco 
e consequente destruição do miocárdio. As TREG são capazes de migrar para o local 
da inflamação cardíaca desencadeada pelo T. cruzi e suprimir a função efetora das 
células T CD4 e CD8 durante os processos infecciosos (MARIANO et al., 2008; 
GUEDES et al., 2012, GUEDES et al., 2016). Eles suprimem a proliferação de células 
T efetoras (CD4+CD25−) quando cocultivados e também podem inibir a ativação de 
células T autoreativas por meio da expressão de moléculas coinibidoras (CTLA-4) e a 
produção de citocinas supressoras (IL-10, TGF-β, IL-35) (ZHENG et al., 2004, 
COLLISON et al., 2007; GUEDES et al., 2012). Ainda, o contato célula-célula via B7 
(CD80 e CD86) da célula apresentadora de antígeno como CTLA-4 da TREG 
aumenta a função desta célula (LEVINGS et al., 2001; SHEVACH, 2002). 
Estudos demonstraram que pacientes com doença de Chagas indeterminada 
apresentam maior frequência de células T CD4+CD25+ em comparação com 
indivíduos cardíacos e não infectados em seu sangue periférico (VITELLI-AVELAR et 
al., 2005; VITELLI-AVELAR et al., 2006; ARAUJO, 2007; DE ARAÚJO et al., 2011). A 
análise de polimorfismo do gene de CTLA-4 em pacientes chagásicos crônicos 
portadores das diferentes manifestações clínicas da doença demonstrou que 
42 
 
pacientes que apresentam alelos, genótipos e haplótipos relacionados a alta 
expressão da molécula reguladora CTLA-4 estavam associados à forma 
indeterminada da doença (DIAS et al., 2013). A maior incidência de células T 
expressando CTLA-4 entre as células efetoras (T CD4+CD25−) de pacientes 
chagásicos indeterminados em comparação a pacientes com cardiomiopatia 
moderada ou grave, também sugere um melhor controle da resposta imune, uma vez 
que a expressão de CTLA-4 em células efetoras CD25- também suprimem a resposta 
imunológica (GUEDES et al., 2012). O CTLA-4 é uma proteína de 44kD semelhante 
ao CD28, competem pelo mesmo sítio de ligação na célula apresentadora de antígeno 
(CD28) e CTLA-4 exibe cerca de 20 vezes mais afinidade de ligação para B7 (CD80 
e CD86) do que o CD28 (LINSLEY et al., 1993). O tratamento utilizando CTLA-4 
quimérico protege ratos do desenvolvimento da miocardite autoimune experimental, 
conforme evidenciado por uma redução significativa do infiltrado celular cardíaco e 
melhoria do estado hemodinâmico (SATORU et al., 2005). Dessa forma, o CTLA-4 
participa regulando o processo de gênese de lesões cardíacas na doença de Chagas 
crônica, podendo servir como base para terapias alternativas na doença de Chagas, 
como vem sendo testada em modelos experimentais de miocardite autoimune. 
Observamos no presente estudo autoanticorpos anti-troponina I e mioglobina 
em pacientes chagásicos crônicos portadores das diferentes manifestações clínicas, 
gerados após lesão de cardiomiócitos pelo parasito ou devido ao mimetismo molecular 
entre antígenos do parasito e do hospedeiro. Ainda, observamos maior concentração 
da molécula CTLA-4 solúvel no soro em pacientes portadores da forma indeterminada. 
Esse conhecimento pode contribuir para o entendimento do mecanismo de patogenia, 
além de serem promissores para utilização como marcadores clínicos da doença de 
Chagas. 
 
43 
 
 
6. CONCLUSÕES 
 
 
Nossos resultados sugerem que a produção elevada de autoanticorpos anti-
Troponina-I e anti-Mioglobina associada a baixa produção de CTLA-4 sérico podem 
estar associadas ao desenvolvimento da forma cardíaca da doença de Chagas, bem 
como serem utilizados como marcadores de forma clínica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
7. REFERÊNCIAS 
 
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ANEXO A