Aula 5 - Meios de Cultura

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UNIVERSIDADE DE PERNAMBUCO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
VIII Curso de Especialização em Microbiologia Clínica
Disciplina: Identificação Bacteriana
Meios de culturaMeios de cultura
Profª: Beathriz Godoy
E-mail: beathriz.godoy@upe.br
Recife
● Se você tiver uma bactéria, você 
consegue identificar?
● Como?
● Microscopia óptica aumenta cerca 
de 1 000X
● Microscopia eletrônica aumenta 
Microscopia eletrônica
● Microscopia eletrônica aumenta 
cerca de 200.000 a 400.000X
● Para ser identificada e se realizar 
o antibiograma é necessário se 
ter milhões de bactérias (pela 
bacteriologia clássica);
Colônias a olho nu
Crescimento bacteriano
10 horas: 1 bilhão de células
Após 18 a 24 horas
Meios de cultura
● Finalidade: Cultivo artificial de microrganismos;
● São formulados com material nutriente preparado 
para multiplicação dos microrganismos;
● Ao aumentar o numero de microrganismos, é possível ● Ao aumentar o numero de microrganismos, é possível 
identificar o gênero e espécie, bem como o perfil de 
susceptibilidade aos antimicrobianos;
● A maioria das bactérias podem ser cultivadas em 
laboratório 
● Ainda não se conseguiu cultivar em laboratório: 
Treponema pallidum e Mycobacterium leprae
Meios de cultura
Principio básico: 
● Adição de indicador de pH
● Quando determinado substrato é utilizado pela bactéria ocorre 
produção de metabólitos
● Os metabolitos alteram o pH do meio  acidificação
● Alteração na cor das colônias ou do meio de cultura
Principio básico
Exemplo fermentação do Manitol
O manitol é um açúcar que alguns 
microrganismos são capazes de 
utilizar como fonte de energia, 
através da fermentação. 
O manitol é um açúcar que alguns 
microrganismos são capazes de 
utilizar como fonte de energia, 
através da fermentação. 
A mudança de pH pode ser observada pela A mudança de pH pode ser observada pela 
Positivo: acidificou
Se houver produção de ácidos
durante o processo de 
fermentação vai acarretar 
modificação do pH do meio
Se houver produção de ácidos
durante o processo de 
fermentação vai acarretar 
modificação do pH do meio
viragem de cor do meio devido à presença do 
indicador de pH Vermelho de Fenol. 
viragem de cor do meio devido à presença do 
indicador de pH Vermelho de Fenol. 
Negativo: não acidificou
Meio inalterado
Meio de manitol
Meios de cultura
● Deve oferecer condições o mais próximas possível das 
condições naturais. 
Características fundamentais:
1. Fonte de carbono (açúcar: glicose, lactose, sacarose) 
energia 
2. Água: normalmente contêm 80% de água, 2. Água: normalmente contêm 80% de água, 
3. Cloreto de sódio: 0.9%, (Staphylococcus aureus pode 
suportar elevadas concentrações salinas).
4. pH: entre 6.8 e 7.8, ou seja, próximo da neutralidade;
ex. Helicobacter e Lactobacillus o que são quanto ao pH?
Procedimento básico para preparo dos 
meios de cultura sintéticos
balançabalança
proveta balão
aquecimento
autoclave Distribuição em placas
Procedimento básico para preparo dos 
meios de cultura sintéticos
● Pesar o meio de cultura de conformidade com as 
instruções do fabricante
● Adicionar a água necessária para a quantidade de meio 
que foi pesada
● Dissolver o meio no fogo ou forno de micro-ondas● Dissolver o meio no fogo ou forno de micro-ondas
● Esterilizar em autoclave
● Aguardar esfriar um pouco o meio
● Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas
● Distribuir em placas de Petri
Esterilização
Duas principais funções de 
esterilização:
a) meios e reagentes a serem utilizados
b) todo material utilizado (placas com 
cultivo)cultivo)
● Autoclave temperatura sob pressão; 
Temperatura 121ºC
Tempo de 30 minutos
Meios de cultura 
Estado físico: [Ágar]
LÍQUIDO
Turvação do meio
SÓLIDO (1,5 a 2,0%) de agar
Colônias
Semi-Sólido (0,5%) 
Motilidade
“AGAR-AGAR”
● A consistência dos meios é dada pela concentração 
de Ágar-ágar
● Extraído de diversos gêneros e espécies de algas ● Extraído de diversos gêneros e espécies de algas 
marinhas vermelhas;
● Solidifica a 37ºC, permitindo o plaqueamento
Colônias bacterianas em vários meios 
de cultura
Ágar-sangue
HE MacConkey
MacConkey HE
Caldo de Infusão Cérebro-Coração (BHI)
● Líquido ou sólido
● Rico em nutrientes: 
● Infusão de cérebro e coração 
Adicionado de peptona (fontes de nitrogênio, ● Adicionado de peptona (fontes de nitrogênio, 
carbono, enxofre e vitaminas) 
● Dextrose (carboidrato utilizado para 
fermentação).
Caldo de Infusão Cérebro-Coração (BHI)
● Finalidade:
○ Cultivar microrganismos (fastidiosos ou não)
○ Testes de coagulase
○ Teste de motilidade em lâmina.
Interpretação:
● Cor original do meio: amarelo claro e límpido.
● Presença de turvação: crescimento bacteriano.
● Ausência de turvação: sem crescimento
Caldo BHI – Brain Heart Infusion
● Derivado de nutrientes de infusão de cérebro e 
coração de boi, adicionado de peptona, possuindo 
nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas;
● Enriquecimento de materiais biológicos pobres em 
bactérias; bactérias; 
● Microrganismos moderadamente fastidiosos como: 
Streptococcus pyogenes, meningococo
● Para realização de teste de motilidade em lâmina.
Ágar Mueller-Hinton (MH)
● Oferece condições de crescimento das 
principais bactérias 
● Meio padronizado por Kirby e Bauer e 
pelo CLSI  ANTIBIOGRAMA
Finalidades:
Pode servir de base para o ágar● Pode servir de base para o ágar-sangue
● Realização do teste de avaliação da 
resistência aos antimicrobianos pelos 
métodos de difusão em disco e E-test;
Interpretação:
● Cor original do meio: amarelo palha.
Ágar Mueller-Hinton
Como identificar determinada bactéria?
● Cultura pura  reisolamentos
● Semeio sempre deve ser por 
esgotamento;esgotamento;
● Varias colônias com as 
mesmas características; 
● Realização de testes 
necessários a identificação;
Função dos meios de cultura
● Realizar a identificação 
perfunctória (inicial) de 
microrganismos, explorando 
as características 
bioquímicas microbianas;
● Para identificar corretamente 
é imprescindível que se 
esteja diante de colônias 
bem isoladas e culturas 
puras (semeio por 
esgotamento).
Semeio por esgotamento
Tipos de meios de cultura
● Meios de enriquecimento: Geralmente líquidos, facilitam a 
multiplicação celular;
● Meios ricos: adicionados de substâncias nutritivas;
● Meios seletivos: Têm o objetivo de nutrir determinadas espécies que : Têm o objetivo de nutrir determinadas espécies que 
serão objetos de investigação e impedir o crescimento de outras 
bactérias (adição de corantes, antibióticos e outras substâncias);
● Meios indicadores e diferencial: indicam uma propriedade importante 
na identificação (ex. utilização de determinado substrato)
● Meios de triagem: Identificam a produção de alguma substância 
específica.
Ágar-sangue (rico) Ágar-chocolate (rico) Ágar Dnase (triagem)
Tipos de meios de cultura
Ágar sangue (rico) Ágar chocolate (rico)
Manitol ágar sal (seletivo/triagem) EMB ou Teague (seletivo) BHI (enriquecimento)
● Meios de enriquecimento: Brain Heart Infusion
(BHI) ou caldo simples;
● Meios ricos: ágar-sangue, ágar-chocolate;
● Meios seletivos: Teague MacConkey;
Tipos de meios de cultura
● Meios seletivos: Teague, MacConkey;
● Meios indicador: Teague, MacConkey;
● Meios para provas específicas (triagem): DNase, 
Manitol.
Meios de Enriquecimento
● Fornecem nutrientes necessários ao 
crescimento de microrganismos presentes 
usualmente em:
1. baixo número1. baixo número
2. de crescimento lento; 
3. Fastidiosos; 
ex. caldo tetrationato para crescimento de 
Salmonellas  iodo e iodeto de K
Motilidade bacteriana 
● Colocar os microrganismos em 
caldo BHI
● Colocar uma gota da suspensão 
bacteriana sobre a lâmina e uma bacteriana sobre a lâmina e uma 
lamínula por cima;
● Observar ao microscópio óptico;
● Diferenciar motilidade de 
movimento browniano.
Motilidade bacteriana 
Meio MIO
Motilidade, Indol, 
Ornitina
Meio Motility
Meio Motility comTriphenyltetrazolium
Chloride (TTC)
Meio SIM
Sulfeto, Indol, 
Motilidade
MEIOS RICOS
● São acrescentadas substâncias para aumentar o 
poder nutritivo do meio:
● Ágar-sangue (sólido): a uma base acrescenta-se
5 a 10% de sangue desfibrinado de carneiro, 5 a 10% de sangue desfibrinado de carneiro, 
coelho;
● Ágar-chocolate (sólido): a uma base 
acrescenta-se 5 a 10% de sangue desfibrinado 
de carneiro, coelho; com hemácias rompidas.
Meios de cultura
Ágar-sangue
Ágar-Chocolate 
Thayer Martin
Teague 
Ágar-sangue
● O meio, usando uma base rica, 
oferece ótimas condições de 
crescimento a maioria dos 
microrganismos. 
● A conservação dos eritrócitos íntegros 
no meio permite identificar se o no meio permite identificar se o 
organismo produz algum tipo de 
hemólise ou não;
● Cor: vermelho vivo
● Finalidade: isolamento de 
microrganismos não fastidiosos, 
verificação do padrão de hemólises
● isolamento de microrganismos não fastidiosos;
Tipos de hemólise:
1. Alfa hemólise ou hemólise parcial  presença de halo 
esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial 
Ágar-sangue
esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial 
dos eritrócitos).
2. Beta hemólise ou hemólise total  presença de halo 
transparente ao redor das colônias semeadas (lise total 
dos eritrócitos).
3. Gama hemólise ou ausência de hemólise  sem halo 
ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros).
Hemólises 
A B C
Alfa-hemólise Beta-hemólise 
Gama - hemólise
Hemólises 
Hemólise alfa hemólise beta ausência de hemólise 
Colônias de S. aureus
Luz transmitida
A observação das placas deve ocorrer 
através da luz refletida e transmitida 
Luz refletida
Padrões de hemólise
A
B
Beta-hemólise 
gama-hemólise 
A B
Padrões de hemólise
Beta-hemólise 
Alfa - hemólise
Ágar sangue - preparo do meio
Seguir o procedimento básico 
● Esfriar a base a +/- 50ºC;
● Adicionar 5 a 10% de sangue desfibrinado de carneiro 
para cada 100 ml de base;para cada 100 ml de base;
● Homogeneizar bem o sangue com o meio até o meio 
apresentar uma cor vermelho vivo;
● Seguir restante do procedimento básico.
Características de enterobacteriáceas no 
ágar-sangue
Proteus spp. Klebsiella spp. E. coli
Proteus spp. no sangue 
Características Não fermentadores 
P. aeruginosa
Características dos cocos no 
ágar sangue
Enterococcus
S. aureus
S. agalactiae
Ágar Chocolate
● Interpretação: Cor original do meio: 
castanho escuro (chocolate).
● Utilizado para o cultivo de microrganismos 
exigentes, embora cresçam neste meio 
quase todos os tipos de microrganismos.quase todos os tipos de microrganismos.
● Base do meio em temperatura alta
● Adiciona-se sangue carneiro, o que faz com 
que as hemácias se rompam, liberando 
hemina e hematina (hemoglobina livre), 
compostos fundamentais para o 
crescimento dos microrganismos exigentes.
Ágar Chocolate - preparo do meio
Seguir o procedimento básico e modificar:
● Quando retirar do autoclave esfriar a base à 
temperatura de aproximadamente 80ºC;
● Adicionar 5 a 10 % de sangue desfibrinado de cavalo 
para cada 100 ml de base;para cada 100 ml de base;
● Homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias 
e o meio apresentar uma cor castanho escuro 
(chocolate);
● Distribuir em placas de Petri
Ágar Thayer-Martin
● Base rica 
● Adicionado de inibidores 
● Cor do meio: cor de chocolate
● Destinados para o isolamento de Neisseria
gonorrhoeae e Neisseria meningitidis;
Seguir o procedimento básico e deixar resfriar a base 
ágar chocolate a 50ºC; e adicionar:ágar-chocolate a 50ºC; e adicionar:
● Suplemento nutritivo (ISOVITALEX)
● Adicionar VCN:
V: Vancomicina (antibiótico inibir Gram-positivos)
C: Colistin (antibiótico inibir Gram-negativos)
N: Nistatina (anti-fúngico )
Meios Seletivos
● Objetivo de favorecer o crescimento da bactéria de 
interesse impedindo o crescimento de outras bactérias;
Inibem os Gram positivos selecionando os Gram
negativos
● MacConkey: Contém sais biliares e cristal de violeta 1%;
● Teague, EMB: Contém eosina 2% e azul de metileno ● Teague, EMB: Contém eosina 2% e azul de metileno 
0,5%;
● HE: sais de bile (inibição de Gram positivos e 
retardamento do crescimento da microbiota normal, 
especifico para fezes);
Favorece o S. aureus
● Manitol Ágar sal: Tem 7.5% de NaCl
Meio seletivo e diferencial – Teague
● Seletivo: porque só 
crescem bacilos (contém 
eosina azul de metileno 
que inibe as bactérias 
Gram-positivas num 
determinado grau).determinado grau).
● Diferencial: diferencia as 
bactérias que utilizam a 
lactose das que não 
utilizam a lactose como 
fonte de carbono. EMB ou Teague 
Pigmento metálico no Teague
● E.coli, K. pneumoniae e E. 
aerogenes metabolizam a 
lactose com produção 
de aldeido ácido.
● O aldeído liberta fucsina
do composto de fucsina-
sulfito, a fucsina então 
colore as colônias de 
metálico-esverdeado.
EMB ou Teague (meio seletivo e diferencial)
Contém sacarose que é fermentada por 
determinados organismos entéricos de forma mais 
rápida do que a lactose
Lactose positiva
Lactose negativa
Os corantes funcionam também como indicadores 
de pH diferenciando a resposta à fermentação da 
lactose e/ou sacarose por microrganismos. 
Os coliformes em geral produzem colônias 
pretas/azuladas, 
Colônias de Salmonella e Shigella são incolores ou 
têm uma cor âmbar transparente 
Eosina Azul de Metileno (EMB ou Teague)
Interpretação:
● Cor original do meio: vermelho escuro, com 
tom meio marron;
● Colônias pretas-azuladas: fermentadoras Colônias pretas
de lactose (Enterobacter spp. Klebsiella spp);
● Colônias com brilho verde metálico: 
fermentadoras de lactose (E.coli);
● Colônias incolores: não fermentadoras de 
lactose.
Principio básico da fermentação da lactose no meio de 
Teague
A lactose é um açúcar que alguns microrganismos são capazes de utilizar como fonte de 
energia, através da fermentação, produzindo ácidos como subprodutos
A lactose é um açúcar que alguns microrganismos são capazes de utilizar como fonte de 
energia, através da fermentação, produzindo ácidos como subprodutos
A mudança de pH (produziu ácidos) pode 
ser observada pela viragem de cor das 
colônias devido à presença do indicador de 
A mudança de pH (produziu ácidos) pode 
ser observada pela viragem de cor das 
colônias devido à presença do indicador de colônias devido à presença do indicador de 
pH eosina azul de metileno
colônias devido à presença do indicador de 
pH eosina azul de metileno
Utilizou a lactose 
(lactose positiva): produziu ácidos 
Não utilizou a lactose 
(lactose negativa): não produziu ácidos
Meio de Teague 
EMB ou Teague 
MEIO SELETIVO E INDICADOR
A
B C
Lactose positiva
Lactose positiva
E F
Lactose negativa
Lactose positiva
Lactose positiva
Lactose negativa
D
Meio seletivo e diferencial- MacConkey
● Seletivo: porque só 
crescem bacilos; 
Contém sais biliares 
e cristal de violeta 
1%;
● Diferencial: 
diferencia as 
bactérias que 
utilizam a lactose 
das que não utilizam 
a lactose como fonte 
de carbono. MacConkey 
Ágar MacConkey
● Meio Seletivo e diferencial ou indicador;
● Não há crescimento de cocos Gram positivos 
devido a presença de sais biliares e o cristal 
violeta;
● Finalidade: isolar bacilos Gram-negativos
(enterobactérias e não fermentadores) e verificar a (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a 
fermentação ou não da lactose.
Interpretação:
● Cor original do meio: rosa intenso.
● Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose.
● Colônias incolores: não fermentadoras de lactose.
MacConkey
Principio básico da fermentação da lactose no meio de 
macConkey
A lactose é um açúcar que alguns microrganismos são capazes de utilizar como fonte de 
energia, através da fermentação, produzindo ácidos como subprodutos
A lactose é um açúcar que alguns microrganismos são capazes de utilizar como fonte de 
energia, através da fermentação, produzindo ácidos como subprodutos
A mudançade pH (produziu ácidos) pode 
ser observada pela viragem de cor das 
colônias devido à presença do indicador de 
A mudança de pH (produziu ácidos) pode 
ser observada pela viragem de cor das 
colônias devido à presença do indicador de colônias devido à presença do indicador de 
pH eosina azul de metileno
colônias devido à presença do indicador de 
pH eosina azul de metileno
Utilizou a lactose 
(lactose positiva): produziu ácidos 
Não utilizou a lactose 
(lactose negativa): não produziu ácidos
Meio de MacConkey 
MacConkey (meio seletivo e indicador)
A
B C
D E
F G
Meio seletivo e diferencial – Hectoen enteric (HE) 
● Seletivo: porque só crescem 
bacilos; Contem sais biliares e 
os corantes azul de 
bromotimol e fucsina ácida.
● Diferencial: diferencia as 
bactérias que utilizam a 
lactose das que não utilizam a 
lactose como fonte de 
carbono. 
Hectoen enteric 
● Mais uma característica: (H2S), a 
produção de gás sulfídrico é 
visto pelo precipitado negro que 
se acumula com as colônias;
● Finalidade: isolar bacilos Gram-
negativos (enterobactérias e não 
Meio seletivo e diferencial – Hectoen enteric (HE) 
negativos (enterobactérias e não 
fermentadores) e verificar a 
fermentação ou não da lactose.
● Utilidade: isolar e diferenciar os 
membros da espécie Salmonella e 
Shigella de outras 
Enterobacteriaceaes. Hectoen enteric 
● E. coli: colônias amarelas a salmão 
● Shigella spp. produz colônias esverdeadas (da 
Meio seletivo e diferencial – Hectoen enteric (HE) 
● Shigella spp. produz colônias esverdeadas (da 
cor do meio).
● Salmonella spp. e Proteus spp produzem colônias 
esverdeadas com pigmento negro. 
Interpretação:
● Cor original do meio: azul-esverdeado
● Colônias amarelas a salmão: enterobactérias
fermentadoras de lactose.
Meio seletivo e diferencial – Hectoen enteric (HE) 
● Colônias azuis-esverdeadas: enterobactérias
Não fermentadoras de lactose.
● Colônias azuis-esverdeadas com centro 
preto: suspeita de Salmonella spp. ou Proteus
spp.
Hektoen Enteric (HE)
Hektoen Enteric (HE)
Hectoen Enteric - HE
MEIO SELETIVO, INDICADOR E H2S
Principio básico da fermentação da lactose no meio de 
H.E.
A lactose é um açúcar que alguns microrganismos são capazes de utilizar como fonte de 
energia, através da fermentação, produzindo ácidos como subprodutos
A lactose é um açúcar que alguns microrganismos são capazes de utilizar como fonte de 
energia, através da fermentação, produzindo ácidos como subprodutos
A mudança de pH (produziu ácidos) pode 
ser observada pela viragem de cor das 
colônias devido à presença do indicador de 
A mudança de pH (produziu ácidos) pode 
ser observada pela viragem de cor das 
colônias devido à presença do indicador de colônias devido à presença do indicador de 
pH eosina azul de metileno
colônias devido à presença do indicador de 
pH eosina azul de metileno
Utilizou a lactose 
(lactose positiva): produziu ácidos 
Não utilizou a lactose 
(lactose negativa): não produziu ácidos
Meio de H.E. 
Hektoen Enteric (HE)
Lactose positiva 
Lactose negativa 
Lactose negativa e positiva 
com e sem H2S
Lactose negativa e positiva 
com e sem H2S
Lactose negativa com e 
sem H2S
Lactose positiva 
Hektoen Enteric (HE)
Compare as características das colônias 
Proteus mirabilis Salmonella enterica
Nos meios de Teague/MacConkey/Hectoen enteric: 
● Produzem colônias com cor intensa: 
“fermentadores de lactose”:
● Escherichia coli
● Enterobacter spp;● Enterobacter spp;
● Klebsiella pneumoniae;
● Produzem ácido (como sub-produto da fermentação 
da lactose), baixando o pH do meio resultando na 
aparência de colônias coradas.
● Produzem colônias incolores ou da cor do 
meio: “não fermentadores de lactose”
1. Salmonella spp. 
Nos meios de Teague/MacConkey/Hectoen enteric: 
2. Proteus spp.
3. Morganella spp.
4. Providencia spp.
5. Serratia spp.
6. Shigella spp
7. Pseudomonas spp.
●Meio de cistina lactose deficiente em eletrólitos (CLED)
●Nutrientes  peptonas de caseínas e gelatina e extrato 
de carne bovina.
●Lactose  metabolismo diferencial
Ágar CLED
●Lactose  metabolismo diferencial
● Indicador de ph  azul de bromotimol
●Fontes de eletrólitos são reduzidas para minimizar a 
proliferação de espécies de Proteus spp.
Ágar CLED
Lactose -
Lactose +Cor original
Serratia marcescens
Manitol Ágar Sal
S. epidermidis
● Alta concentração de sal 
(7,5%);
● Indicador vermelho de fenol, 
quando o pH baixa muda 
para amarelo a cor do meio; 
S. aureus
para amarelo a cor do meio; 
● Staphylococcus aureus é capaz 
de crescer e de fermentar 
manitol, produzindo ácido.
● Staphylococcus epidermidis
cresce, mas não fermenta o 
manitol, não acidifica
Produção de pigmentos
Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa
Quem produz esse pigmento?
Serratia pigmento: prodigiosina 
DNAse
DNase positivos: 
● Staphylococcus aureus 
● Serratia spp. 
● Stenotrophomonas maltophilia.
DNase negativos: DNase negativos: 
● Staphylococcus coagulase 
negativa,
● demais enterobactérias, 
● demais bacilos Gram negativos 
não fermentadores.
E. faecalis
Meios cromogênicos
P. 
mirabilis
E. coliS. aureus
E. faecalis
K. pneumoniae
S. agalactiaeE. faecalis
Meio cromogênico
Streptococcus 
agalactiae
Klebsiella
E. coli
Klebsiella
Meio cromogênico
Proteus S. aureus
Enterococcus 
E. coli Klebsiella
Meio cromogênico
Klebsiella
S. aureus
Enterobacter
Meio cromogênico
Proteus
E. coli
Cândida
Cromo Cândida 
C. tropicalis
C. cruzei
C. albicans
Provas bioquímicas 
● Através da verificação das transformações 
químicas que ocorrem no substrato pela ação do 
microrganismo pode-se identificar a bactéria. 
● Baseia-se na:
● utilização de carboidratos, na decomposição de 
compostos nitrogenados (produção de indol, 
desdobramento da uréia, produção de gás sulfídrico). 
● A série é composta por vários meios de cultura TSI, 
CITRATO, LISINA, URÉIA, GLICOSE E TESTE DE 
MOBILIDADE
Provas bioquímicas
citrat
o TSI: três açucares e ferro