Coprocultura-aula 06

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Coprocultura 
 
Coprocultura é o exame bacteriológico das fezes que o médico pede quando tem suspeita de 
gastroenterite (inflamação do trato gastrointestinal que se manifesta através de diarréia e desinteria, 
vômitos, cólicas abdominais). 
Diarréia: aumento do número de evacuações de fezes, pastosas, moles ou liquidas. 
Desinteria: é uma diarréia com presença de muco e sangue. 
 
Coleta, transporte e armazenamento: 
 A coleta deve ser feita no início da fase aguda da doença, quando os patógenos 
estão usualmente presentes em maior número e preferencialmente, antes da 
antibioticoterapia. 
 *Caso você queira verificar a resistência bacteriana, ai pode fazer a coleta 
mesmo com a antibioticoterapia. Ou em pacientes de UTI. 
 Coletar as fezes e colocar em um frasco contendo o meio para transporte (cary-
blair ou salina glicerinada tamponada), fornecido pelo laboratório, em 
quantidade equivalente a uma colher de sobremesa. Preferir sempre as porções 
mucosas e sanguinolentas, se a amostra for líquida coletar aproximadamente 2-
3ml. 
 *Geralmente, você recebe o frasco sem o meio de transporte, porque o meio de 
transporte são usados com mais frequência em laboratórios do interior que 
precisam enviar as amostras. 
 Fechar bem o frasco e agitar o material. 
 Se a amostra não for entregue no laboratório em uma hora, conservar em 
geladeira 40 C, no máximo por um período de 12 horas. Marcar o horário da 
coleta. 
 Na falta de meio de transporte utilizar frasco limpo e seco (fornecido pelo 
laboratório), coletar no mínimo 2g de fezes e enviar ao laboratório. 
 
 Para pesquisa de Vibrio cholerae: 
Swab fecal em cary-blair: 
 Coletar 1 a 2g de fezes em frasco limpo, seco, de boca larga fornecido pelo 
laboratório. 
 Mergulhar o swab no frasco contendo as fezes, 
 Introduzir o meio de 
transporte cary-blair e 
transportar em temperatura 
ambiente entre 24 e 72 
horas após a coleta. 
Swab retal em cary-blair: 
 Introduzir o swab no ânus e fazer movimentos rotativos suaves por alguns 
segundos. 
 Introduzir o meio de transporte cary-blair e transportar em temperatura 
ambiente em até 24h após a coleta. 
 
Armazenamento no laboratório: 
 
 Fezes in natura: encaminhas imediatamente ao laboratório em 
temperatura de 20 C a 80 C (com gelo reciclável) 
 Fezes in swab: caso não seja possível encaminhar amostras de fezes 
in natura no mesmo dia, introduzir o swab nas fezes colhidas em 
frasco estéril e acondicionar o swab no meio de transporte cary-blair 
(viável por até 7 dias sem refrigeração). 
 
Meio de transporte: 
 
 Cary blair: tem como princípio a carência de uma fonte de nitrogênio 
que impede a multiplicação de microrganismos. A composição 
nutritiva garante a sobrevivência dos microrganismos presentes na 
amostra. 
 
Meios de cultura: 
 
 Meios de isolamento: 
o Ágar SS 
o HE 
o EMB 
 Meios de identificação: 
o TSI 
o Ureia 
o Citrato 
o SIM 
o Indol 
o Fenilalanina 
o Lisina 
o Ornitina 
 Meios de enriquecimento: 
o Tetrationato 
 
Principais provas para a identificação das enterobactérias de 
importância clínica: 
 
 Fermentação da glicose 
 Fermentação da lactose 
 Motilidade 
 Utilização de citrato 
 Descarboxilação da lisina e ornitina 
 Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) 
 Produção de gás (CO2) 
 Oxidase 
 Produção de indol 
 Produção de urease 
 Produção de fenilalanina desaminase 
 
 Ágar salmonella Shigella-SS: 
 É um meio de cultura altamente seletivo para o isolamento de Salmonella spp. E 
algumas espécies de Shigella a partir de amostras clínicas e de alimentos. 
 Os microrganismos gram positivos e os coliformes são inibidos por componentes 
seletivos e a diferenciação dos microrganismos é obtida através da adição da 
lactose no meio. 
 As bactérias fermentadoras formam colônias vermelhas ou rosa e as não 
fermentadoras formam colônias incolores. 
 Elevadas concentração de sais biliares e citrato de sódio inibem todas as bactérias 
gram positivas e muitas gram negativas. 
 Carboidrato: lactose 
 Indicador para ácido: vermelho neutro 
 Indicador de H2S: citrato férrico 
 Os produtores de H2S (Salmonella): formam colônias incolores com fundo 
enegrecido 
 Os não fermentadores de lactose e não produtores de H2S (Shigella): colônias 
incolores 
 Não fermentadores de lactose: colônias vermelha a rosa (Escherichia coli). 
 
 
 
 
 
 
 
*Dentro da coprocultura, não tem como o microrganismo ser produtor de lactose e de 
H2S, exceto o proteus. 
 
 Meio ágar entérico hektoen – HE 
Salmonella spp. Shigella spp. Bactéria fermentadora de 
lactose (vermelha a rosa) 
 É um meio moderadamente seletivo para diferenciação de gram negativos 
entéricos utilizado para isolamento e cultura desses microrganismos, 
especialmente para o isolamento de Shigella e Salmonella provenientes de 
amostras fecais. 
 A elevada concentração de sais inibem todas as bactérias gram positivas e 
muitas gram negativas. 
 Carboidrato: lactose, sacarose 
 Indicador para ácido: fucsina ácida e azul de bromotimol 
 Indicador de H2S: citrato férrico 
 Produtores de H2S e não fermentadores de lactose (Salmonella): forma um 
centro escuro com as bordas mais claras esverdeada-azulada. 
 Apenas produtores de lactose sem formação de H2S (Shigella): forma uma 
coloração esverdeada. 
 Fermentadores de lactose: alaranjada a salmão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ágar EMB: 
 É um meio para diferenciação ligeiramente seletivo utilizado para o isolamento e 
diferenciação de bacilos entéricos gram negativos (enterobacteriaceae e outros 
bastonetes gram negativos provenientes de amostras clínicas) 
 A presença de eosina e azul de metileno inibem as bactérias gram positivas 
 Carboidrato: lactose e sacarose 
 Indicadores e inibidores: eosina e azul de metileno 
*Não tem indicador de H2S então não vê o ponto enegrecido. 
 Não fermentadores de lactose: colônias incolores. 
 Fermentadores de lactose: colônias pequenas, secas com fundo metálico característico da 
escherichia coli, além de colônias grandes mucoides que é característica da klebsiella. 
*No meio EMB não diferencia salmonella e shigella. Os meios mais específicos são o SS e o 
HE, porque o que a gente quer observar nas fezes são as bactérias patogênicas que é a 
samonella, shigella e a escherichia coli em algumas ocasiões. 
Shigella spp. Salmonella spp. 
Bactéria fermentadora de lactose 
(alaranjado a salmão) 
 
 Tetrationato: 
 É um meio de enriquecimento para Salmonella 
 Contém sais de bile que inibem os microrganismos gram positivos e a adição 
da solução de iodo (antes da amostra) inibe a microbiota intestinal normal. 
 Tetrationato é formado no meio pela adição da solução de iodo e iodeto de 
potássio. Organismos que contém a tetrationato redutase proliferarão no 
meio 
 Tempo de incubação 18-24 horas: tempo diferente do preconizado (inferior 
ao período de 18 horas) não se garante a recuperação do microrganismos 
alvo e não seletividade referente à possível flora presente. 
*Então as fezes chegam ao laboratório e são colocadas no meio tetrationato 
para enriquecimento e pode ao mesmo tempo semear no meio SS ou no meio HE, 
porque se a gente conseguir obter colônias isoladas nesses dois meios já adianta com a 
cultura. Caso a cultura fique muito cheia, ai tem que fazer um novo semeio. 
 
 Meio TSI: 
Detecta bactérias fermentadoras de carboidratos e produtores de H2S 
Tem 3 açúcares e ferro, ai a gente vai ver a fermentação dos 3 açúcares que é lactose, 
sacarose, glicose e a produção do H2S. 
Carboidratos: glicose (0,1%) lactose e sacarore (1%) distribuídos uniformemente, tanto 
no fundo quanto na superfície do meio 
Indicadores para ácido: vermelho de fenol pH neutro-vermelho e pH ácido-amarelo 
 
 
 
1. Tubo controle: a cor do TSI é essa, uma cor de tijolo. 
2. Microrganismo alcalino-alcalino: cor vermelha sema produção de H2S 
3. Microrganismo alcalino-ácido: sem produção de H2S 
4. Ácido-ácido com produção de gás e sem produção de H2S 
5. Ácido-ácido com produção de H2S e produção de gás 
6. Alcalino-ácido com produção de H2S e gás. 
*A fermentação da glicose é vista no fundo do tubo, então se é uma enterobacteriacea 
o fundo do tubo tem que ser ácido. Nos dois últimos tubos por exemplo, a gente vê 
um precipitado preto do H2S, mas é ácido, porque é uma enterobacteriace. 
Amarelo é ácido, alcalino é vermelho. 
 
Não fermentador de lactose: 
 Ficam alcalino-ácido ou alcalino-ácido com produção de H2S se houver. 
 No inicio ocorre uma acidificação, tanto na superfície como no fundo do tubo. Em 
seguida o suplemento de glicose se esgota e a bactéria começa a efetuar a 
degradação oxidativa dos AA na superfície inclinada do tubo, resultando na 
libeação de aminas ficando a parte inclinada vermelha (alcalina), no entando o 
fundo do tubo permanece amarelo pois a degradação de AA não é suficiente para 
neutralizar o ácido formado pela fermentação da glicose. 
A fermentação continua porque tem lactose. 
*Com a alça, inocula o material no centro do tubo e faz estria na superfície. 
*Com a sacarose fica a mesma coisa da lactose. 
 
 
 
 
 
 
 
 Ureia: 
Detecta os microrganismos produtores da enzima urease, que hidrolisa a ureia 
liberando amônia e CO2. 
 
 
Podem ser utilizados dois meios para a detecção de urease: 
1. Caldo ureia de stuart: 
Tamponado com sais de fosfato a um pH 6,8 sendo indicado para identificação de 
microrganismos produtores de grandes quantidades de amônia para superar o 
sistema e elevar o pH do meio para produzir uma viragem do indicador (>8,0), 
sendo seletivo para espécies de proteus. 
2. Ágar ureia de Christensen: 
Possui um sistema tampão muito mais fraco, permitindo detectar produções 
menores de amônia, sendo, portando, apropriado para análise de bactérias que 
apresentam formação reduzida de urease ativa. 
*O laboratório escolhe qual vai usar. 
 
 Citrato: 
 Determina a capacidade de um microrganismo utilizar citrato de sódio como única 
fonte de carbono para o seu metabolismo e crescimento. 
 Se o microrganismo cresceu, é citrato positivo, ele transforma o meio de 
verde para azul e mesmo que com 24 horas essa reação de viragem do azul 
não ficar bem evidente mas ocorrer o crescimento do microrganismo, a 
gente considera citrato positivo e deixa mais 24 horas pra ocorrer a viragem. 
 Esta capacidade depende da presença de citrato permeasse que facilita o 
transporte do citrato para o microrganismo, uma vez dentro da célula o 
citrato é degradado pela enzima citrase, produzindo ácido oxalacético e 
acetato. 
 A formação de bicarbonato de sódio e amoníaco (NH3) resultante da utilização de 
citrato de sódio e de sair de amônio, leva a um aumento do pH do meio de cultura 
e, consequentemente à alteração da cor do mesmo de verde para azul tendo como 
indicador o azul de bromotimol. 
 
 
 
 SIM (sulfeto, indol e motilidade): 
 É um meio recomendado para a determinação da produção de H2S, formação de indol e 
motilidade 
 A baixa concentração do ágar permite a dispersão dos microrganismos pelo meio 
(motilidade) 
 O indol é um dos produtos da degradação metabólica do triptofano 
 
 
 
Observação: o indol é 
importante para separar 
Escherichia coli (sempre 
positivo) de membros do grupo 
Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-
Serratia (a maioria negativo). 
 Se a bactéria produzir a enzima tiossulfato redutase ela irá degradar 
o tissulfato de sódio presente no meio produzindo H2S, este reage 
com o sulfato ferroso formando um precipitado preto de sulfeto 
ferroso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Fenilalanina: 
 É um aminoácido que por desaminação forma um cetoácido, o ácido fenilpirúvico. 
 O microrganismo deve possuir a enzima desaminase, necessária para essa conversão. 
 O teste da fenilalanina é baseado na detecção de ácido fenilpirúvico, o qual é liberado 
no meio, após o crescimento do microrganismo teste, sua presença é visualizada pela 
adição de uma solução de cloreto férrico a 10% quando aparece uma cor verde. 
 A determinação da enzima fenilalaninadesaminase é útil para a diferenciação de 
espécies proteus, morganellae, providencia de outros bacilos gram negativos. 
 
 
 
 
 Descarboxilases: 
 Representam um grupo de enzimas substrato específicas, capazes de atuar sobre a porção 
carboxila dos aminoácidos, formando aminas de reação alcalina. 
 Lisina, arginina e ornitina são os três aminoácidos habitualmente avaliados na identificação 
das enterobactérias cuja descarboxilação resulta na liberação das seguintes aminas 
específicas: 
 
 
 
 
 
Lisina cadaverina 
Ornitina putrescina 
Arginina citrulina (dehidrolase) 
 
 Lisina: 
 Muitas bactérias possuem enzimas capazes de descarboxilar AA específicos no meio de 
cultura 
 A enzima descarboxilase remove uma molécula de CO2 de um AA para formar aminas 
de reação alcalina. 
 
 
 Características comuns das enterobactérias: 
 Bacilos gram negativos 
 Não esporulados 
 Catalase positivos (exceto a Shigella dvsenteriae) 
 Oxidase negativos (importante na sua detecção) 
 Fermentam a glicose com ou sem produção de gás carbônico 
 Reduzem os nitratos a nitrito 
 
 Podem: 
 Ser móveis ou imóveis (a maioria são móveis com exceção de Klebsiella, Shigella e 
Yersinia -imóveis a 370C) as móveis são por flagelos peritríquios 
 Ser a maioria anaeróbios facultativos 
 Algumas estirpes podem fermentar a lactose (p.ex.E.coli, Klebsiella, Enterobacter, 
Citrobacter e Serratia) 
 Ter cápsula (Escherichia, a maioria das Klebsiella e algumas Enterobacter) 
 Crescem bem nos meios comuns e meios seletivos para BGN 
 
 Importância clinica: 
 As enterobactérias representam 80% ou mais de todos os gram negativos de 
importância clínica isolados na rotina microbiológica 
 São responsáveis por cerca de 70% das infecções urinárias e 50% das septicemias 
 São considerados enteropatógenos clássicos os os diferentes sorotipos de Salmonella, 
Shigella spp, categorias diarreiogênicas de E.coli e Yersinia enterocolítica 
 São classificadas atualmente em 42 gêneros e centenas de espécies 
 
 Enterobacteriaceae não envolvida na gastroenterite: 
Enterobacter 
Fermentam lactose. Raramente causam doenças primárias em seres humanos, mas 
com frequência colonizam pacientes hospitalizados. 
 Klebsiella 
Fermentam lactose. Causam uma pneumonia lombar necrotizante em indivíduos 
comprometidos pelo alcoolismo, diabetes ou DPCO 
 Klebsiella granulomatis – donovanose -DST 
Afeta a pele e mucosas das regiões da genitália, da virilha e do ânus. Difícil isolamento 
em meios de cultura. 
 Serratia 
Pode causar infecções no trato respiratório inferior e no trato urinário, especialmente 
em pacientes hospitalizados, como também infecção da ferida cirúrgica. 
 Proteus 
Provocam infecções nos seres humanos apenas quando deixam o tratointestinal. São 
encontrados em infecções das vias urinarias e causam bacteriemia, pneumonia e 
lesões em pacientes debilitados. 
Proteus vulgaris e morganela morganii 
São importantes patógenos hospitalares 
Providencia 
As espécies de providencia estão presentes na microbiota intestinal normal. Todas 
causam infecções das vias urinárias e ocasionalmente outras infecções, e muitas vezes 
são resistentes ao tratamento antimicrobiano.