[HPLC] Colóquio

Prévia do material em texto

09/05/2013
1
Cromatografia a Líquido
O que é HPLC?
• … em inglês, High Performance Liquid 
Chromatography
• High Pressure Liquid Chromatography
(normalmente verdade!)
• High Price Liquid Chromatography (verdade!)
• HPLC é a automação da cromatografia a 
líquido sob condições que permitem fornecer 
separações melhores em tempos mais curtos! 
CLAE - HPLC
Analitomóvel Analitoestacionária
K = Analitoest / Analitomov = Coeficiente de partição
Método físico-químico que permite a separação de
componentes de uma mistura, através da distribuição
destes componentes em duas fases, que estão em
contato íntimo:
Fase móvel (líquido) Fase estacionária
Velocidades diferentes de migração
Separação 
em coluna: 
fase móvel e
estacionária
Esquema de um instrumento de HPLC Tipos de Separações por HPLC
• Partição em fase normal
• Partição em fase reversa: Separação de analitos
pouco polares por partição em uma fase estacionária líquida
apolar.
• Adsorção
• Cromatografia de íons: Separação de íons
orgânicos e inorgânicos por atração eletrostática de grupos
iônicos presentes em uma resina trocadora de íons.
• Cromatografia por exclusão de tamanho
09/05/2013
2
Resolução de uma coluna:
habilidade de separar dois analitos
Rs =
∆∆∆∆ tR
Wm
W1 + W2Wm=
2
Obs.: Tr e W - mesma unidade
Quanto maior a resolução = 
melhor é a separação
Experimento 1 – Cromatografia a 
líquido de partição em fase reversa
Separação e identificação dos 
componentes: 
Trazer qualquer medicamento que contem aspirina!
C
C
O
O CH3
OH
O
C
C
O
O CH3
OH
O
Ácido acetil-salicílico
Ácido benzóico
Ácido gálico
Fase estacionária – líquido apolar (C18)
Fase móvel – líquido polar (ACN:água)
Qual é a proporção dos solventes da 
fase móvel que irá resultar em uma 
melhor resolução?
Escolha das fases estacionária 
e móvel
Esquema de uma coluna com fase ligada 
Material
suporte
Material
suporte C18
A)Separação dos analitos
Fase móvel adequada (ACN:H2O) 
B) Identificação dos analitos (mistura padrão)
Técnica da adição de padrão na amostra 
(spiking)
C) Quantificação da aspirina (medicamento)
Curva de calibração externa (soluções do 
padrão em concentrações diferentes)
Procedimento experimental
09/05/2013
3
Fase estacionária – resina de troca iônica
Fase móvel - solução aquosa de uma 
base forte ou ácido forte
Experimento 2: 
Cromatografia de íons (CI)
Cl- Br-
Cl- Br-
Br- Cl-
Br- Br-
Br-
Cl- Cl-
Cl-
OH-
OH-
Cl-
Cl-
OH-
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
HBr
HBr
HCl
HCl
Cl- Br-
Tempo
Coluna de separação
Coluna supressora
Descarte
Detector de condutividade 
elétrica
amostraeluente
(NaOH)
Cromatografia de ânions
Resina -N+R3X
- + Na+OH-Resina -N+R3OH
- + Na+X-
Na coluna de separação:
Na coluna supressora:
Resina -SO3
-H+ + Na+X- Resina -SO3
-Na+ + H++ X-
Resina-SO3
-Na+ + Na+OH- Resina-SO3
-Na+ + H2O
Procedimento experimental
A) Separação dos ânions: 
Cloreto, brometo, acetato e fosfato em 
uma solução aquosa. 
B) Identificação dos ânions:
Técnica de adição de padrão (spiking)