04 - (NP2) - Aula Sistema Complemento - Imunologia Clínica 09-10-2024

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Sistema 
Complemento
Imunologia Clínica
Sistema Complemento - Tópicos
❖ O que vamos estudar nesta aula de Sistema Complemento (SC)?
● Introdução do SC
● Ativação do SC
● Regulação do SC e seus receptores
● Funções do SC
● Deficiência do SC e efeitos patológicos
● Avaliação laboratorial do SC
Introdução SC
Histórico, Conceito e Nomenclatura
Sistema Complemento - Introdução
❖ O que é o Sistema Complemento (SC)?
● Mecanismos efetores da imunidade inata e humoral
● São proteínas produzidas continuamente, 
principalmente no fígado 
● Na ausência de infecção essas proteínas de fase aguda 
circulam de forma inativa
O sistema complemento consiste em um conjunto de proteínas séricas e de superfície 
que interagem umas com as outras e com outras moléculas do sistema imune de 
maneira altamente regulada, para gerar produtos que atuam na eliminação dos 
microrganismos.
Sistema Complemento - Introdução
❖ A descoberta do SC
● Jules Bordet (1870 - 1961) em 1890 fez uma série de 
experimentos envolvendo soro fresco e bactérias
● Soro fresco (37°C) - Lise de bactérias! 
● Soro fresco (56°C) - Bactérias vivas! Jules Bordet
Sistema Complemento - Introdução
❖ A descoberta do SC
Soro (37°C)
Cultura de bactérias
Lise de bactérias
Sistema Complemento - Introdução
❖ A descoberta do SC
Soro (56°C)
Cultura de bactérias
Bactérias vivas
Sistema Complemento - Introdução
❖ A descoberta do SC
● Qual a conclusão do experimento de Jules Bordet?
Bordet concluiu que o soro contém algum outro componente 
termolábil que auxilia, ou complementa, a função lítica de 
anticorpos. O nome do sistema passou a ser chamado e 
conhecido como Sistema Complemento.
Jules Bordet
Sistema Complemento - Introdução
❖ A nomenclatura do SC
● As proteínas do SC são denominadas de ‘’C’’:
- C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 
● Outras proteínas estão envolvidas:
- Fator B, Fator D, Lectina Ligadora de Manose (MBL), ficolinas, 
properdina
● Muitas proteínas do SC são clivadas e geram fragmentos 
designados por letras minúsculas 
- C3 : C3a + C3b 
- C4: C4a + C4b
- C2: C2a + C2b
Fragmentos ‘’a’’ - Inflamação
Fragmentos ‘’b’’ - Opsonização
Exceção - C2 (invertido)
 
Ativação do SC
Vias de Ativação
Sistema Complemento - Vias de ativação 
❖ As vias de ativação do SC 
VIA CLÁSSICA
VIA 
ALTERNATIVA
VIA DA 
LECTINA
As diferenças entre as 3 vias de ativação do sistema 
complemento ocorre até a formação da C5 convertase!
Sistema Complemento - Vias de ativação
Sistema Complemento - Via Clássica
❖ A via clássica (VC) de ativação
● A numeração das proteínas relaciona-se a sua descoberta e não a sequência de ativação 
- Sequência de ativação da VC: C1 C4 C2 C3 C5 C6 C7 C8 C9 
- A via clássica é a única via que usa do C1 a C9
- A proteína C1 é exclusiva da via clássica
- A principal ativação da via clássica se dar por mediação de anticorpos (IgM / IgG)
- Outras proteínas envolvidas na ativação da VC são as pentraxinas
Sistema Complemento - Via Clássica
❖ A via clássica (VC) de ativação
● Ativação mediada por anticorpos (IgM / IgG)
Sistema Complemento - Via Clássica (fase inicial)
❖ A via clássica (VC) de ativação
Faz ativação?
NÃO!
SIM!
Sistema Complemento - Via Clássica (fase inicial)
❖ A via clássica (VC) de ativação
Sistema Complemento - Via Clássica (fase inicial)
❖ A via clássica (VC) de ativação
Sistema Complemento - Via Clássica (fase inicial)
❖ A via clássica (VC) de ativação
Sistema Complemento - Via Clássica
❖ A via clássica (VC) de ativação
● É possível ativar a via clássica do SC na ausência de IgM e IgG?
- As pentraxinas são proteínas plasmáticas pentamericas estruturalmente homólogas 
de fase aguda que reconhecem estruturas microbianas e participam da imunidade 
inata
- Produção principalmente hepática via estímulo de interleucinas (IL-6 / IL-1)
- Algumas proteínas (Ex.: PTX3) são expressas por células, incluindo DCs, macrófagos e 
células endoteliais após estímulo via TLR e citocinas inflamatórias (TNF)
Sistema Complemento - Via Clássica
❖ A via clássica (VC) de ativação por pentraxinas
P
en
tr
ax
in
as
Pentraxinas 
Curtas
Pentraxina 
Longa
Proteína C 
Reativa (CRP)
Amilóide Sérica 
P (SAP)
Pentraxina 3 
(PTX3)
Reconhece moléculas diversas 
em bactérias, fungos e vírus.
Liga em 
fosforilcolina
Liga em 
fosfatidiletanolamina
Membrana 
bacteriana e 
células 
apoptóticas.
Sistema Complemento - Via Clássica
❖ A via clássica (VC) de ativação por pentraxinas
Fosforilcolina
Superfície do 
microrganismo CRP
CRP
CRP
CRP
CRP
CRP
C2
C4
Sistema Complemento - Via Clássica
❖ Proteínas da Via Clássica do ComplementoProteína Estrutura Concentração Sérica 
(μg/mL)
Função
C1 (C1qr2s2) 750 kDa - Inicia a Via Clássica
C1q 460 kDa; hexâmero com três 
pares de cadeia (22, 23, 24 kDa)
50-150 Liga-se a porção Fc do anticorpo que está ligado ao antígeno, 
a células apoptóticas e a superfícies catiônicas
C1r Dímero de 85 kDa 50 Serina protease, cliva C1 para torná-la ativa
C1s Dímero de 85 kDa 50 Serina protease, cliva C4 e C2
C4 210 kDa; trímero com cadeias de 
97, 75 e 33 kDa
300-600 C4b liga-se covalentemente à superfície de um 
microrganismo ou célula, onde o anticorpo está ligado e o 
complemento é ativado. 
C4b liga-se a C2 para clivagem por C1s. 
C4b estimula inflamação (anafilatoxina)
C2 Monômero de 102 kDa 20 C2a é uma serina protease e atua como enzima ativa da C3 e 
C5 convertase para clivar C3 e C5
C3 Tabela anterior
Sistema Complemento - Via Alternativa
❖ A via alternativa (VA) de ativação
● A via alternativa de ativação do complemento resulta na proteólise de C3 e na fixação 
estável de seu produto de degradação C3b nas superfícies microbianas, sem a participação 
de anticorpo.
● A C3 é continuamente e espontaneamente clivada no plasma (1-2%) - C3 tickover
Sistema Complemento - Via Alternativa
❖ A via alternativa (VA) de ativação
● O fragmento C3b pode-se ligar a célula do hospedeiro? 
● Sim, porém é regulada negativamente, a ausência de tal mecanismo em microrganismos 
permite a continuação da ativação do SC
● Além disso, a properdina (estabilização da C3bBb) tem sua ligação favorecida nos 
microrganismos e não nas células normais do hospedeiro 
● A properdina é liberada por neutrófilos ativados, macrófagos e células T - feedback positivo 
da ativação do complemento 
Sistema Complemento - Via Alternativa
❖ A via alternativa (VA) de ativação
Sistema Complemento - Via Alternativa
❖ A via alternativa (VA) de ativação
Sistema Complemento - Via Alternativa
❖ A via alternativa (VA) de ativação
Sistema Complemento - Via Alternativa
❖ Proteínas da Via Alternativa do Complemento
Proteína Estrutura Concentração Sérica 
(μg/mL)
Função
C3 185 kDa 1.400 - 1.700 C3b liga-se a superfície do 
microrganismo, onde atua como uma 
opsonina e como um componente das 
C3 e C5 convertase. C3a estimula 
inflamação (anafilotoxina)
Fator B Monômero de 93 kDa 200-400 Bb é uma serina protease e a enzima 
ativa de C3 e C5 convertase.
Fator D Monômero de 25 kDa 1-3 Serina protease plasmática que cliva o 
fator B quando está ligado a C3b.
Properdina Composta por até 4 
subunidades de 56 kDa
20-35 A properdina estabiliza as C3 convertase 
(C3bBb) na superfície microbiana
Sistema Complemento - Via das Lectinas
❖ A via das Lectinas (VL) de ativação
● A ativação do complemento pela via das lectinas é desencadeada pela ligação de polissacarídeos 
microbianos a lectinas circulantes, como a lectina ligante de manose plasmática (MBL - mannose-binding 
lectin) ou a ficolinas 
● Algumas lectinas circulantes podem ser sintetizadas no fígado (MBL), outras por macrófagos ativados 
(M-ficolina). Outras colectinas específicas, como as proteínas surfactantes A e D fazem mediação da 
resposta imunológica em sítios anatômicos específicos
● As lectinas circulantes são proteínas do tipo colágeno estruturalmente semelhantes a C1q
● As lectinas circulantes também apresentam complexos de serina protease associadosem sua estrutura, 
são conhecidas como MASP’s (MASP 1, MASP 2, MASP 3)
Sistema Complemento - Via das Lectinas
❖ A via das Lectinas (VL) de ativação
Parede gram +: 
N-acetilglicosamina; Ác. 
lipoteicóico
Manose na 
superfícies 
microbiana
Antígeno 
de superfície 
microbiana
Anticorpo IgM
Sistema Complemento - Via das Lectinas
❖ A via das Lectinas (VL) de ativação
Sistema Complemento - Via das Lectinas
❖ A via das Lectinas (VL) de ativação
Sistema Complemento - Via das Lectinas
❖ Proteínas da Via das Lectinas do Complemento
Proteína Estrutura Concentração 
Sérica (μg/mL)
Função
Lectina ligante de 
manose (MBL)
Trímero helicoidal com cadeia de 
32 kDa; dímeros a hexâmeros dessa 
tripla-hélice 
1-8 Aglutinina, opsonina, fixação do complemento
M/L/H-ficolina 
(ficolina-1/2/3)
Trímeros helicoidais com cadeias de 
34 kDa; um tetrâmero dessa 
tripla-hélice
Indetectável/ 1-7 
/ 6-83
Aglutinina, opsonina, fixação do complemento
MASP-1 Homodímero de 90 kDa; homólogo 
a C1r/C1s
2-13 Forma complexo com MASP-2 e com colectinas ou 
ficolinas e ativa MASP-3
MASP-2 Homodímero de 110 kDa; 
homólogo a C1r/C1s
2-13 Forma complexo com lectinas, especialmente ficolina-3
MASP-3 Homodímero de 76 kDa; homólogo 
a C1r/C1s
0,02-1,0 Associa-se a colectinas ou ficolinas e MASP-1 e cliva C4
Sistema Complemento - Etapas tardias 
❖ Etapas tardias de ativação do Sistema Complemento
● As C5 convertases geradas pelas vias alternativa, clássica ou das lectinas iniciam a ativação dos 
componentes da via terminal do SC, que culmina na formação do complexo de ataque à membrana 
(MAC - membrane attack complex)
● Todos os passos das etapas tardias são comuns as 3 vias de ativação
● As etapas tardias envolvem a participação das demais proteínas do complemento: C6, C7, C8 e extensa 
polimerização da C9
● Os poros formados pelo MAC são de aproximadamente 20 nm de diâmetro externo, 1 a 11 nm de 
diâmetro interno e com altura de 15 nm levam ao desequilíbrio osmótico com morte das células onde 
ocorre deposição do MAC
● Não ocorrem clivagens protéicas nas etapas tardias 
Sistema Complemento - Etapas tardias 
❖ Etapas tardias de ativação do Sistema Complemento
● Formação do MAC
Sistema Complemento - Etapas tardias 
❖ Etapas tardias de ativação do Sistema Complemento
Sistema Complemento - Etapas tardias 
❖ Etapas tardias de ativação do Sistema Complemento
Sistema Complemento - Etapas tardias 
❖ Etapas tardias de ativação do Sistema Complemento
Sistema Complemento - Etapas tardias 
❖ MAC
Sistema Complemento - Etapa tardia
❖ Proteínas das etapas tardias do complemento
Proteína Estrutura Concentração 
Sérica (μg/mL)
Função
C5 Dímero de 190 kDa com 
cadeias de 115 e 75 kDa 
80 C5b inicia a montagem do MAC. C5a estimula 
inflamação (anafilotoxina)
C6 Monômero de 110 kDa 45 Componente do MAC: liga-se ao C5b e aceita C7
C7 Monômero de 110 kDa 90 Componente do MAC: liga-se a C5bC6 e insere-se 
na membrana lipídica
C8 Trímero de 155 kDa com 
cadeias de 64, 64 e 22 kDa
60 Componente do MAC: liga-se a C5bC6C7 e inicia a 
ligação e polimerização do C9
C9 Monômero de 79 kDa 60 Componente do MAC: liga-se a C5bC6C7C8 e 
polimeriza-se para formar poros na membrana
Regulação do SC 
e seus receptores
Necessidade do equilíbrio na 
modulação imunológica
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ A atividade biológica do SC são mediadas pela ligação de fragmentos do complemento 
a receptores de membrana expressos em vários tipos celulares
Receptor Especificidade Funções Tipos celulares
CR1 (CD35) C3b > C4b > iC3b Promove decaimento de C3b 
(Reg.), C4b / Estimula fagocitose 
/ Transp. dos complexos imunes
Eritrocitos, macrófagos, 
monócitos, leucocitos 
polimorfonucleares, células B, 
FDC
CR2 (CD21) C3d, iC3b > C3dg Parte do co-receptor de células B 
/ Receptor p/ EBV (inf. Cel. B)
Células B, FDC
CR3 (CD11b/CD18) iC3b, ICAM-1 Estimula fagocitose; Integrina Macrófagos, monócitos, 
leucocitos polim., FDC
CR4 (p150, 95, CD11c/CD18) iC3b Estimula fagocitose; Integrina Macrófagos, monócitos, 
leucocitos polim., FDC
Receptor C5a / Receptor C3a C5a / C3a A ligação do C5a / C3a ativa a 
proteína G
Células endoteliais, mastócitos, 
fagócitos
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Qual a importância em regular a ativação do Sistema Complemento?
● Impedir que o SC se ative em células do hospedeiro (elas se ligam em nossas células também)
● Controlar e modular o tempo de ativação do SC
❖ Como é feita a regulação do complemento?
● Vários mecanismos asseguram que a ativação do complemento ocorrerá somente na superfície de 
um patógeno e em células danificadas
● Diversas proteínas regulam a atividade do SC, proteínas circulantes e de membrana celular, essas 
proteínas pertencem a uma família denominada RCA (Regulators of complement activity)
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ C1-INH (inibidor de serino-proteases, família das serpinas) 
● Mimetiza os substratos normais de C1r e C1s, se tornando alvo da atividade enzimática 
proteolítica de C1r-C1s
● Limita o tempo de atuação da serina protease
Dissociação de C1r 
e C1s de C1q
Impedimento de 
ativação da via 
clássica
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Inibidores de C3b e C4b
Inibidores de 
C3b e C4b
Proteína de Cofator de 
Membrana (MCP ou CD46)
Receptor do Complemento do 
tipo 1 (CR1)
Fator de Aceleração do 
Decaimento (DAF)
Fator H
Proteína ligadora de C4 (C4BP)
Inibe somente C3b
Inibe somente C4b(proteína plasmática)
(proteína plasmática)
Fator I
Depende dessas 
proteínas 
reguladoras 
(cofatores) para sua 
atividade biológica
(proteínas de 
membrana)
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ DAF 
● Sem as proteínas de regulação plasmáticas ou de membrana, como a proteína DAF, a ativação do SC continuaria 
por meio da atividade das C3 convertases de outras vias de ativação do SC, danificando células saudáveis do 
hospedeiro.
Inibição da formação 
do MAC e diminuição 
da inflamação
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Fator I 
● Degradação de C3b e C4b. As demais proteínas reguladoras servem como cofator para sua 
atividade.
● O Fator I pode fragmentar ainda mais o iC3b em C3f (liberado) e C3dg (ligado a célula)
● Os fagócitos e células B possuem receptores para o C3dg
‘’i’’ = Inativa
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Inibição da formação do MAC (Regulação das etapas finais) - CD59 e Proteína S
● O CD59 está presente nas células normais do hospedeiro 
● Essa proteína de membrana (CD59) não faz parte da bioquímica de microrganismos 
● A proteína S também inibe a formação do MAC, trata-se de uma proteína plasmática
● A proteína S liga-se aos complexos C5b, C6, C7 solúveis
● Ambos os inibidores atuam por meio de um impedimento alostérico
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Inibição da formação do MAC (Regulação das etapas finais) - CD59 e Proteína S
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Inibição da formação do MAC (Regulação das etapas finais) - CD59 e Proteína S
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Inibição da formação do MAC (Regulação das etapas finais) - CD59 e Proteína S
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Resumo dos reguladores do SC
Inibidor Descrição
C1-INH Inibidor de C1 (C1r-C1s)
Inibidores de C3b e C4b Membrana: MCP, CR1, DAF / Plasma: Fator H, C4BP
Fator I Degradação direta de C3b e C4b. Necessita de outros inibidores 
atuando como cofatores.
CD59 Proteína de membrana - Inibe formação do MAC 
Proteína S Proteína plasmática - Inibe formação do MAC
Regulação da ativação do SC e seus receptores
❖ Evasão microbiana ao Sistema Complemento 
● Neisseria meningitidis - Expressão de ácido siálico inibe C3 e C5 
convertase
● Estreptococos - Proteína M bloqueia a ligação de C3 ao organismo, e 
a ligação de C3b aos receptores de complemento
● Tripanossomos e Schistosoma - Produção de moléculas DAF similis 
● Vírus como Epstein-Baar e Measles morbillivirus- Usam receptores 
do complemento para infectar nossas células
Funções do SC
Importância imunológica em 
condições fisiológicas
Funções do Sistema Complemento
❖ As principais funções do SC na imunidade inata e na imunidade adaptativa 
humoral:
● Opsonização e fagocitose
● Estimulação das reações inflamatórias
● Citólise mediada pelo complemento
● Depuração dos complexos imunes
Funções do Sistema Complemento
❖ Opsonização e fagocitose 
● Os microrganismos sobre os quais o complemento é ativado tornam-se recobertos 
com C3b ou C4b, e são fagocitados pela ligação dessas proteínas e receptores 
específicos em macrófagos e neutrófilos.
Funções do Sistema Complemento
❖ Estimulação das Respostas Inflamatórias
● Os fragmentos proteolíticos C5a, C4a e C3a do complemento induzem inflamação 
aguda pela ativação de mastócitos, neutrófilos e células endoteliais.
Funções do Sistema Complemento
❖ Citólise mediada pelo complemento
● A lise de organismos estranhos mediada pelo complemento é realizada pelo MAC e se torna 
eficiente principalmente em bactérias com paredes celulares mais delgadas (Ex.: Neisseria)
Funções do Sistema Complemento
❖ Depuração de imunocomplexos
● Por se ligarem aos complexos antígeno-anticorpo, as proteínas do complemento promovem 
a solubilização desses complexos e sua remoção por fagócitos.
Pequenos complexos 
antígeno-anticorpo se formam na 
circulação e ativam o complemento
Muitas moléculas de C3b são ligadas 
covalentemente ao complexo
Funções do Sistema Complemento
❖ Depuração de imunocomplexos
CR1
C3b ligado une-se ao receptor CR1 
nas superfícies de hemácias
No baço e no fígado, células 
fagocitárias removem os complexos 
imunes
Deficiência do SC e 
efeitos patológicos
Disfuncionalidades envolvendo o 
SC
Deficiência do SC e efeitos patológicos
❖ Deficiência na C2 e C4 - Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES)
● 50% dos pacientes com deficiências em C1q, C2 e C4 desenvolvem LES
● Remoção inadequada de imunocomplexos circulantes decorrentes de 
defeitos na ativação do complemento é uma das possíveis causas e 
deposição nos glomérulos renais, articulações, junção derme 
epiderme
● Deficiência na remoção de corpos apoptóticos, isso é observado por 
meio da presença de autoanticorpos contra antígenos nucleares 
presente nestas células
● Não está associada à suscetibilidade aumentada a infecções (outras 
vias)
Deficiência do SC e efeitos patológicos
❖ Deficiência de C3 
● A proteína C3 é a mais abundante do SC e sua deficiência está associada a infecções graves bacterianas 
fatais
❖ Deficiência nas demais proteínas do complemento (C5-C9)
● Está associado a aumento de susceptibilidade a infecções disseminadas por Neisseria meningitidis e 
Neisseria gonorrhoeae
❖ Deficiência na C1-INH
● Angioedema hereditário - indivíduos sensíveis cujo organismo inflama facilmente
● Consumo de C4 e C2 não controlada
● Principais manifestações clínicas: Edema agudo intermitente na pele e mucosas, dor abdominal, 
vômitos, diarréia, obstrução das vias respiratórias
Avaliação 
laboratorial do SC
Aplicações em imunologia clínica
Avaliação laboratorial do SC
❖ Avaliação geral do SC (funcionalidade das vias) - Fase 1 da triagem
❖ Complemento Total - CT (CH50/CH100) - Quantificação da atividade hemolítica da 
via clássica
● O soro do paciente é incubado com eritrócitos pré-sensibilizados de carneiro com anticorpos de 
coelho, servindo assim como iniciador da ativação da via clássica
● O ensaio verifica a quantidade do complemento requerida para lisar 50% das hemácias (Hb 
livre), sendo o resultado expresso em unidades hemolíticas
● Valores normais neste ensaio implica em preservação da função da via clássica
Avaliação laboratorial do SC
❖ Avaliação geral do SC (funcionalidade das vias) - Fase 1 da triagem
❖ CH50 - Imuno-hemólise 
Avaliação laboratorial do SC
❖ Avaliação geral do SC (funcionalidade das vias) - Fase 1 da triagem
❖ CH50 - Imuno-hemólise 
Normal: 60,0 a 145,0 U CAE
Baixo.: Inferior a 60,0 U CAE
Alto..: Superior a 145,0 U CAE
U CAE.: Atividade do Complemento
Avaliação laboratorial do SC
❖ Avaliação geral do SC (funcionalidade das vias) - Fase 1 da triagem
❖ APH50 - Quantificação da atividade hemolítica da via alternativa
● O procedimento laboratorial é semelhante ao da CT, com exceção da adição do uso de reagentes 
que bloqueiam a VC de ativação do complemento
● Este ensaio é útil para screening de deficiências homozigóticas dos componentes da via 
alternativa como C3, Fator B, Fator D, Properdina
● Valores normais neste ensaio implica em preservação da função da via alternativa
Avaliação laboratorial do SC
❖ Avaliação da fase 1 da triagem
● CH50 e APH50 com valores normais significam em integridade do SC, diminui-se a suspeita sobre 
determinada doença ou elimina
● CH50 reduzido e APH50 normal indicam problemas de ativação na VC (C1, C2, C4, C3)
● CH50 normal e APH50 reduzido indicam problemas de ativação na VA (C3, Fator B, Fator D, Prop.)
● CH50 e APH50 reduzidas indicam problemas em proteínas da fase tardia (MAC) ou C3
● Valores reduzidos em tais ensaios podem ter como possível causa a deficiência de um ou mais 
componentes das proteínas do SC
Avaliação laboratorial do SC
❖ Avaliação específica do SC - Fase 2 triagem
● Os ensaios nesta fase se tornam mais específicos a fim de detectar a origem da deficiência
● Avaliação quantitativa de C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9
● Os métodos mais utilizados para avaliação dos componentes da cascata são: ELISA, Nefelometria, 
Turbidimetria ou Imunodifusão
Avaliação laboratorial do SC
❖ Avaliação específica do SC - Fase 2 triagem
● A imunoturbidimetria é um dos métodos mais utilizados para dosagem de frações do 
complemento por quantificação fotométrica (absorbância) de luz não difundida de 
imunoprecipitados 
Fonte: Labtest
Obrigado