Aula 11. Compartimentalização Intracelular (reticulo) [parte2] [2012]

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Rafael Valverde 
rafaval@gmail.com 
Laboratório e Físico-Quimica Biológica G-37 
 
 
Biologia Celular para Nanociências e Nanotecnologia 
IBCCFº - UFRJ 
 
Abril– 2012 
Page 723 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
proteínas destinadas ao 
Golgi, membrana 
plasmática, lisossomas, 
endossomas etc devem ser 
primeiramente 
internalizadas no RE 
Microscopia de Fluorescência do Retículo 
Endoplasmático 
todos os eucariotos tem um retículo 
endoplasmático 
 
mais da metade da membrana de 
uma célula animal 
cisternas tubulares achatadas interconectadas 
e contínuas ao envelope nuclear (um único 
espaço interno ou lúmen) 
 
todas as partes do citosol estão próximas de 
uma parte do retículo 
RE tem papel importante na 
biossíntese de proteínas, lipídeos e no 
estoque de Ca2+ 
Translocação Proteica Co- e Pos-Traducional 
determinadas regiões do RE são 
especializadas de acordo com o 
contexto celular 
 
RE rugoso: ribossomos associados a 
membrana (cadeia polipeptidica é 
translocada durante a síntese) 
importação pós traducional de proteínas é típica 
de outras organelas: mitocôndria, peroxissomos, 
núcleo 
translocação co-
traducional no RE 
rugoso 
Figure 12-36a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
ribossomos cobrem a superfície do RE 
rugoso, as demais cisternas irregulares são 
denominadas RE liso 
 
área onde brotam vesículas contendo 
cargas entre o RE e o Golgi: RE transicional 
 
células importantes para o metabolismo de 
lipídeos possuem RE liso maior 
(metabolismo lipídico) (heaptócitos) 
 
estoques de Ca2+ (sinalização!) (RE 
sarcoplasmático maior em células 
musculares) 
Figure 12-37b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
após homogeneização o RE se 
quebra e se re-sela formando 
microssomas 
 
preservam suas funções (estocam 
Ca2+, glicosilam proteínas, 
translocam proteinas, sintetizam 
lipideos) 
gradiente de sacarose separa RE liso do rugoso pela 
diferença de densidade das membranas 
Isolamento e Purificação do RE liso e Rugoso 
Figure 12-37a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
microssomas de RE rugoso com ribossomos no lado 
externo 
Figure 12-38 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
algumas proteínas tem como 
destino final o próprio RE, 
outras: direcionadas a outros 
compartimentos (direcionadas 
ao RE por sequência sinal) 
O Peptídeo Líder 
”peptídeo lider”: direciona a 
cadeia polipeptidica para o RE (é 
clivado por peptidase na 
membrana interna do RE) 
RE captura proteínas 
sintetizadas: transmembrana 
(translocadas parcialmente na 
membrana do RE) e solúveis 
(translocadas para o lúmen do 
RE) 
Figure 12-39a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
SRPs Direcionam 
Peptídeos Sinais 
do RE aos Translocadores 
6 polipeptídios e um RNA 
a sequência sinal é 
reconhecida e guiada ao RE 
pela signal-recognition 
particle (SRPs) 
 
SRP oclui sítio do fator de 
extensão (interrompe 
tradução!!) 
Como Sequências Sinal do RE e SRPs Direcionam 
Ribossomos a Membrana do RE 
ligação ao receptor de SRP permite que 
ribossomo se ancore ao translocador 
(liberação de SRP) 
 
translocação da cadeia polipeptídica através 
da membrana 
complexos SRP-ribossomo interrompem 
tradução (impedem ligação dos fatores de 
elongamento!!) 
 
complexos SRP-ribossomo se ligam ao receptor 
de SRP na membrana do RE 
Figure 12-41a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Ribossomos Livres ou 
Associados a 
Membrana 
poliribossomos (diversos 
ribossomos traduzindo um 
mRNA) são atraídos a 
membrana do RE 
 
mRNA permanece próximo a 
membrana do RE graças a 
uma população 
intercambiável de 
ribossomos que iniciam e 
terminam a tradução 
Figure 12-41b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
micrografia eletrônica dos poliribossomas 
associados a membrana do RE 
Estrutura do Complexo sec61 
plug se desloca quando translocador é 
acionado deixando a cadeia polipeptidica 
passar 
 
sec61 pode se abrir lateralmente pera inserir 
a cadeia polipeptidica na membrana 
(proteínas integrais de membrana!) 
estrutura do translocador (sec61) contem três 
subunidades 
 
pequena α-hélice (plug) mantém o poro fechado 
quando no translocador em repouso (impede 
vazamento de Ca2+!!) 
Figure 12-43 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Ribossomo Ligado ao Translocador 
ribossomo se encaixa 
com precisão sobre 
Sec61 (espaço interior 
contínuo ao lúmen do 
RE) 
Sec61 formam complexos 
de 4 unidades mas nem 
todos participam da 
translocação (pontos de 
apoio para o ribossomo e 
proteínas acessórias) 
Figure 12-44a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Translocação não Requer 
Sempre que Peptídeo 
Esteja em Elongamento 
translocação pós-traducional a partir 
de proteínas traduzidas por 
ribossomos solúveis (em bactérias e 
eucariotos) 
a translocação pós-traducional requer 
proteínas acessórias que impulsionem 
a translocação 
translocação co-traducional: ribossomo 
é trazido a membrana por signal 
recognition proteins (SRPs) 
(reconhecidas pelo receptor de SRP que 
posiciona o ribossomo sobre o 
translocador) 
Figure 12-44b,c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
eucariotos: grupo de 
proteínas acessórias da 
família Sec se associa ao 
complexo Sec61 
atravessando a 
membrana 
 
recrutam chaperona BIP 
no lúmem (ciclos de 
quebra de ATP puxam a 
cadeia polipeptídica 
através do translocador) leveduras 
bactérias: SecA ATPase se liga a parte 
citosólica do translocador (ciclos de quebra 
de ATP empurrando a proteína através deste) 
Figure 12-45 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Translocação de uma Proteína Solúvel Através da 
Membrana do RE 
peptidases do RE clivam o peptídeo sinal após entrada da cadeia 
polipeptídica (degradado por proteases) 
 
abertura lateral do translocador permite liberação do peptídeo na 
membrana (inserção de domínios hidrofóbicos das proteínas na 
bicamada lipídica!!) 
sequencia sinal é reconhecida duas vezes, por 
SRPs no citosol e pelo translocador (só proteínas 
corretas entram no RE) 
 
reconhecimento do peptídeo sinal abre o 
translocador 
Figure 12-46 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
após clivagem do peptídeo 
sinal, cadeia polipeptídica 
na região da sequencia de 
parada é transferida para a 
membrana pela abertura 
do translocador 
Translocação de uma Proteína Transmembrana 
N-terminal voltado 
para o lúmen do RE 
proteínas integrais de membrana tem domínios alocados no interior da 
bicamada lipídica 
 
em proteínas single-pass, bolso hidrofóbico (além do peptideo sinal) da cadeia 
polipeptídica determina a parada da translocação (sequencia de parada) 
Figure 12-47 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
sequencia sinal de localização no RE (e de inicio da translocação) pode ser 
interna e não N-terminal 
 
reconhecida por SRP de forma semelhante 
 
neste caso a sequencia não será clivada por peptidases, proteína será inserida 
na membrana contendo o peptídeo sinal 
Figure 12-47 (part 2 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
seqs. sinal podem se ligar aos translocadores em ambos 
os sentidos determinando qual o segmento da cadeia 
polipeptidica será translocado para o lúmen do RE 
 
orientação da proteína é determinada pela distribuição 
dos aa carregados na seq. sinal!! 
Integração de uma Proteína Transmembrana Double-
Pass em proteínas transmembrana multipass a cadeia polipeptídica 
atravessa a membrana varias vezes 
 
peptídeo sinal interno inicia a translocação que continua até 
encontrar um domínio hidrofóbico de parada (cadeia 
polipeptidica é transferida pra membrana) 
Figure 12-49 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
em proteínas multipass mais complexas: diversos 
domínioshidrofóbicos 
 
primeiro peptídeo hidrofóbico reconhecido pelo 
SRP define o frame (scannea a cadeia polipeptídica 
N-ter  C-ter 
 
seqs de inicio e parada de translocação (liberação 
da cadeia na membrana a cada stop) 
Figure 12-50 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
residentes definitivas do RE possuem sequência de 
retenção no C-terminal (ex: BIP da familia das Hsp-70) 
Oligossacarídeo Precursor da N-
glicosilação 
proteínas destinadas ao Golgi, lisossoma, membrana 
plasmática ou espaço extracelular recebem açúcares (N-
glicosilação) 
 
transferência “em bloco” de uma cadeia oligossacarídica 
(14 açúcares) a cadeia lateral de uma asparagina (N) da 
proteína 
Figure 12-51 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
oligossacarideo fica ancorado ao 
dolicol na membrana luminal do 
RE 
 
transferência em bloco do 
oligossacarideo é catalizada em 
um unico passo pela oligossacaril-
transferase na membrana interna 
 
oligossacaril-transferase se 
associa a cada translocon 
(scanneia e glicosila a cadeia 
polipeptídica nascente) 
Glicosilação de Proteínas no RE Rugoso. 
oligossacarideo é ancorado ao dolicol 
por um pirofosfato (fornece a energia 
de ativação para a glicosilação) 
Oligossacarídeos Marcam o Enovelamento Proteico 
porque a glicosilação é comum em proteínas 
que entram no RE? 
proteínas no RE requerem N-glicosilação para 
se enovelarem, glicoses são “podadas” no 
processo 
 
calnexina e calreticulina retém proteínas com 
apenas uma das três glicoses originais do 
oligossacarideo 
glicosidase cliva a ultima glicose 
(proteína enovelada solta-se da 
chaperona) 
 
proteínas mal enovelada: glicosil 
transferase re-adiciona glicose ao 
oligossacarideo 
Proteínas Mal-Enoveladas são Exportadas do RE e 
Degradadas no Citosol 
proteínas que não atingem 
estrutura enovelada final ou 
oligomérica são retro-
translocadas ao citosol 
 
mecanismo pouco conhecido 
de retro-translocação 
oligossacarídio serve como timer do 
tempo gasto pela proteína no RE 
 
maquinaria de retro-translocação detecta 
ausência de uma manose na cadeia 
ação da manosidase é lenta: apenas 
proteínas que demoram no RE perdem 
manose (timer) 
Figure 12-55a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Reposta ao Acúmulo de Proteínas Mal-Enoveladas no 
lúmen do RE proteínas mal-enoveladas ativam 3 
vias distintas de resposta ao stress de 
enovelamento 
 
Via 1: (slide seguinte) 
Via 2: proteínas mal-enoveladas 
acionam uma cinase de membrana 
(PERK) que inibe um fator de 
iniciação da tradução 
 
tradução e consequente influxo 
de proteínas no RE 
Via 3: proteína de membrana 
(ATF6) ativada por proteínas mal-
enoveladas migra para o Golgi onde 
sua porção citosólica é clivada: 
proteína regulatória gênica (genes 
de resposta ao stress de 
enovelamento) 
Figure 12-55b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
“Our experiments cannot rule out the possibility that some of the 
substrate RNA enters the nucleus where the splicing reaction may occur. 
Therefore, although the preponderance of our data indicates that 
cytoplasmic splicing of XBP1 mRNA occurs, we cannot rule out that the 
reaction also occurs in the nucleus" 
RE Sintetiza a Bicamada Lipídica 
todas as classes de lipídeos e colesterol são 
sintetizados na membrana do RE (enzimas de 
síntese voltadas para o citosol) 
 
principal fosfolipideo, fosfatidilcolina (PC), é 
sintetizado em três etapas a partir de colina, 2 
ácidos graxos e glicerol fosfato 
união dos ácidos graxos num esqueleto de 
glicerol fosfato forma o ácido fosfatídico (PA) 
 
PA sofre alterações subsequentes sendo 
transformado em DAG e depois em PC 
fosfolipídios são sintetizados 
apenas na face citoplasmática da 
membrana do RE 
 
formação da bicamada requer 
transferência para face luminal: 
“flip-flop” 
fosfolipídios se equilibram entre as 
duas monocamadas em minutos! 
 
proteína transportadora de lipídeos: 
scramblase (distribui fosfolipídios 
aleatoriamente!!) 
assimetria na bicamada da 
membrana plasmática e de outros 
compartimentos: ação das 
flipases!!