Seminário de biologia molecular e genética

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TÉCNICAS DE ANÁLISES DNA,RNA E PROTEÍNAS
DEFINIÇÃO
Blotting é uma técnica de investigação usada para detectar e identificar macromoléculas, como ácidos nucleicos e as proteínas. Esta técnica é realizada por: 
Separação por eletroforese
Transferência para uma membrana
Deteção com uma sonda marcada 
TÉCNICAS DE BLOTTING
SOUTHERN BLOTTING
NORTHERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING
ELETROFORESE
A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA, RNA e proteínas com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através de um gel contendo as moléculas de interesse.
Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras.
Como o nome sugere, a gel eletroforese envolve um gel: uma placa de material gelatinoso. Géis para separação de DNA são muitas vezes feitos de um polissacarídeo chamado agarose.
SOUTHERN BLOTTING
São necessárias enzimas de restrição para clivar a amostra de DNA em fragmentos, antes da eletroforese.
Antes do blotting, o DNA de fita dupla separado é desnaturado com solução alcalina → fragmentos de DNA de fita simples.
Método de blotting: transferência capilar de DNA de um gel de eletroforese para um filtro.
Usa sondas oligonucleotídicas marcadas que são complementares à sequência do DNA alvo.
A incubação permite a hibridização da sonda com o DNA alvo.
NORTHERN BLOTTING
Obtenção de RNA total ou mensageiro.
Separação eletroforética de RNA em gel de agarose em condições desnaturantes.
Transferência de RNA do gel de agarose para a membrana (filtro).
Usa sondas oligonucleotídicas marcadas que são complementares à sequência de RNA alvo.
Hibridação de mRNA fixado na membrana com sondas marcadas.
A incubação permite a hibridização da sonda com o RNA alvo.
WESTERN BLOTTING 
A: As amostras de proteínas são carregadas num gel e separadas por eletroforese.
B: As proteínas separadas são transferidas eletroforeticamente para uma membrana.
C: A membrana é incubada com um anticorpo primário específico para a proteína alvo, que permite a formação de complexos anticorpo-antígeno.
D: A membrana é incubada novamente com anticorpos secundários marcados, que se ligam aos anticorpos primários.
E: Neste caso, é adicionado um substrato que interage com os marcadores, permitindo a deteção por quimioluminescência.
	APLICAÇÕES	
	SOUTHERN BLOT	- Medicina Forense 
- Identificação de novas mutações 
- Diagnóstico de doenças genéticas 
	NORTHERN BLOT	- Avalia níveis de RNA e a expressão gênica
	WESTERN BLOT	- Diagnóstico de doenças infecciosas (HIV, Doença de Lyme)
- Identificação de proteínas e anticorpos anormais (Doença priónica, distrofia muscular)
VANTAGENS E DESVANTAGENS
Vantagens:
Todos os tipos: boa especificidade.
Southern blot: pode detetar uma grande variedade de mutações.
Western blot:
 Boa sensibilidade.
 Pode avaliar várias proteínas alvo.
Desvantagens gerais:
Requer uma grande quantidade de DNA ou RNA.
Processo lento e trabalhoso.
Caro.
O uso de materiais radioativos pode ser potencialmente perigoso.
REFERÊNCIAS
OISETH, Stanley; JONES, Lindsay; MAZA; Evelin. Técnicas de Blotting. Lecturio, 2022. Disponível em: Técnicas de Blotting | Concise Medical Knowledge (lecturio.com). Acesso em: 10 de maio de 2024. 
VERLENGIA, Rozângela. Análises de RNA, Proteínas e Metabólitos - Metodologia e Procedimentos Técnicos. Grupo GEN, 2012. E-book. versão impressa ISBN 978-85-412-0112-4. Disponível em: https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/978-85-412-0112-4/. Acesso em: 11 de maio de 2024.
OBRIGADA!
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