AULA 5 - TECNICAS DE HIBRIDIZACAO (1)

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Técnicas de hibridização
Técnicas de 
hibridização
Técnica baseada na capacidade que 
duas fitas simples, de DNA ou RNA, 
possuem de se ligar caso tenham 
sequencias complementares, 
formando uma fita-dupla. 
Com a utilização de uma sonda 
marcada, é possível identificar a 
localização de um fragmento de DNA 
ou RNA que possua a sequencia 
complementar a sonda utilizada. 
Mas o que é 
uma sonda?
Sonda
• Fragmento de DNA fita simples, normalmente sintético, com sequencia conhecida. 
Sonda complementar a um trecho específico da amostra
TACTCGACAGGCTAG
CTGATGGTCATGAGCTGTCCGATCGATCAT
Amostra de DNA desnaturada (fita simples)
TACTCGACAGGCTAG
Hibridização
Sonda
• A sonda deve ser marcada (com fluorescência ou agentes radioativos) para 
possibilitar a sua identificação quando em contato com a amostra. 
• Assim, quando a sonda é detectada, é possível localizar a sequencia 
complementar na amostra. 
Técnicas de 
hibridização
Southern Blot
Northern Blot
Western Blot
Microarray
FISH
Southern 
Blot
• 1973 - Edwin Southern, biólogo que 
desenvolveu a técnica. 
• Blot significa transferência 
• Técnica que confere se uma determinada 
sequência de DNA encontra-se ou não 
presente em uma amostra de DNA 
analisada. 
1. Após extração do DNA, digestão com enzima de restrição para 
cortar o DNA em fragmentos menores. 
2. Os fragmentos passam por eletroforese em gel de agarose, 
onde são separados e formam bandas. 
3. Uma membrana de nitrocelulose ou nylon é colocada sobre o 
gel para transferência. 
4. Por ação capilar (água ou solução alcalina – que irá desnaturar 
o DNA, permitindo sua ligação com a sonda), o DNA é transferido 
do gel para a membrana seguindo o padrão eletroforético. 
5. A membrana é seca em vácuo ou exposta à luz UV para fixar o 
DNA.
Southern 
Blot
Passo a passo:
6. A membrana é exposta à sonda, que se hibridiza ao 
DNA. Para evitar ligações não específicas, utilizam-se 
previamente reagentes bloqueadores. 
7. Após a exposição, a membrana é lavada e procede-se à 
revelação, dependendo do tipo de marcação que a sonda 
carrega. Faz-se a autorradiografia (no caso de isótopos), 
revelação (fluoróforos ou substâncias cromogênicas). 
8. O resultado é uma membrana contendo uma ou mais 
bandas marcadas, as quais correspondem à sequência 
procurada. 
Southern 
Blot
Passo a passo:
Southern Blot
Southern 
Blot
https://
www.youtube.com/
watch?v=1Q-
_qgCtk3c&ab_channel=T
hePlantGenetics 
https://www.youtube.com/watch?v=1Q-_qgCtk3c&ab_channel=ThePlantGenetics
https://www.youtube.com/watch?v=1Q-_qgCtk3c&ab_channel=ThePlantGenetics
https://www.youtube.com/watch?v=1Q-_qgCtk3c&ab_channel=ThePlantGenetics
https://www.youtube.com/watch?v=1Q-_qgCtk3c&ab_channel=ThePlantGenetics
https://www.youtube.com/watch?v=1Q-_qgCtk3c&ab_channel=ThePlantGenetics
• Teste de paternidade 
• Identificação criminal 
• Diagnóstico de doenças genéticas 
• Diagnóstico de doenças 
infecciosas 
• Diagnóstico de câncer
Southern 
Blot
Aplicação:
Northern 
Blot
• 1977 - James Alwine e colaboradores 
desenvolveram a técnica 
• Técnica de biologia molecular para 
estudo da expressão gênica, ou seja, 
investigar se um dado gene de um 
genoma é ou não transcrito em RNA em 
uma determinada amostra.
1. Extração de RNA. 
2. Eletroforese em gel de agarose. 
3. Transferência do conteúdo do gel para uma membrana de nylon ou 
nitrocelulose. 
4. Fixação do RNA na membrana com luz UV. 
5. Incubação com a sonda, que irá hibridizar caso a sequencia alvo 
esteja presente na amostra. Para evitar ligações não específicas, 
utilizam-se previamente reagentes bloqueadores 
6. Revelação que depende do tipo de sonda utilizada (isótopos, 
fluoróforos ou substâncias cromogênicas).
Northern 
Blot
Passo a passo:
Northern Blot
Northern 
Blot
https://
www.youtube.com/
watch?v=ZgRC4F-
Uszg&ab_channel=Quick
BiochemistryBasics 
https://www.youtube.com/watch?v=ZgRC4F-Uszg&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=ZgRC4F-Uszg&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=ZgRC4F-Uszg&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=ZgRC4F-Uszg&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=ZgRC4F-Uszg&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
• Diagnóstico e prognóstico de tumores 
• Detecção de supressão de oncogenes 
• Detecção de baixa expressão de genes 
supressores tumorais 
• Estudo e diagnóstico de doenças cuja 
expressão de um RNA específico em 
determinado tecido seja importante. 
Northern 
Blot
Aplicação:
Western 
Blot
• 1979 - Towbin e colaboradores 
desenvolveram a técnica. 
• Também conhecida como Imuno Blot ou 
Imuno Blotting 
• Método em biologia molecular e 
bioquímica para detectar proteínas em uma 
determinada amostra.
1. Extração das proteínas. 
2. Eletroforese em gel de poliacrilamida. 
3. Transferência para membrana de nitrocelulose 
(menor custo) ou PVDF (maior sensibilidade, 
ligação e retenção). 
4. Incubação da membrana com um anticorpo 
específico para detectar a proteína de 
interesse. Para evitar ligações não específicas, 
utilizam-se previamente reagentes 
bloqueadores. 
5. Revelação da membrana para análise dos 
dados.
Western 
Blot
Passo a passo:
Western Blot
Western 
Blot
https://
www.youtube.com/
watch?
v=faOELRICYqY&ab_chan
nel=QuickBiochemistryB
asics 
https://www.youtube.com/watch?v=faOELRICYqY&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=faOELRICYqY&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=faOELRICYqY&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=faOELRICYqY&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=faOELRICYqY&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
https://www.youtube.com/watch?v=faOELRICYqY&ab_channel=QuickBiochemistryBasics
• Diagnóstico de doenças 
infecciosas 
• Teste confirmatório para 
algumas doenças 
• Pesquisa
Western 
Blot
Aplicação:
Microarray
• Técnica que permite a investigar a 
expressão de centenas ou milhares de 
genes em uma amostra com uma reação de 
hibridização. 
• O principal objetivo é o estudo comparativo 
da expressão de certos genes de interesse. 
• É comum que a técnica seja aplicada a duas 
amostras – uma em condições saudáveis e 
outra patológica – para identificar quais 
genes estão sendo expressos ou não.
1. Extração de RNA da amostra de interesse. 
2. Síntese de cDNA (DNA complementar) ao RNA 
extraído com a transcriptase reversa. 
3. Marcação do cDNA com fluoróforos 
(normalmente verde e vermelho). 
4. Os cDNAs são colocados na placa/chip de 
microarray e incubados para permitir a sua 
hibridação (ligação) com a sonda de DNA do 
microarray. 
5. Quantificação da expressão em um sistema 
leitor que atribui um código à fluorescência 
emitida por cada cDNA. 
Microarray
Passo a passo:
Microarray
Microarray
https://
www.youtube.com/
watch?
v=NgRfc6atXQ8&ab_cha
nnel=Henrik%27sLab 
https://www.youtube.com/watch?v=NgRfc6atXQ8&ab_channel=Henrik'sLab
https://www.youtube.com/watch?v=NgRfc6atXQ8&ab_channel=Henrik'sLab
https://www.youtube.com/watch?v=NgRfc6atXQ8&ab_channel=Henrik'sLab
https://www.youtube.com/watch?v=NgRfc6atXQ8&ab_channel=Henrik'sLab
https://www.youtube.com/watch?v=NgRfc6atXQ8&ab_channel=Henrik'sLab
• Classificação e prognóstico de câncer. 
• Expressão diferencial de genes alergias, 
imunodeficiências primárias, doenças autoimunes e 
doenças infecciosas. 
• Comparação de um tecido de controle e um tecido 
tratado com um determinado medicamento – estudo de 
possíveis tratamentos.
Microarray
Aplicação:
FISH 
Hibridização in situ fluorescente
• Técnica de citogenética 
molecular que utiliza 
sondas de DNA 
marcadas com 
fluorescência para 
detectar anomalias 
cromossômicas como 
microdeleções e 
rearranjos complexo.
FISH 
Hibridização in situ 
fluorescente
Passo a passo:
FISH 
Hibridização 
in situ 
fluorescente
encurtador.com.br/efhM0 
FISH 
Hibridização 
in situfluorescente
FISH 
Hibridização in situ 
fluorescente
Aplicação:
• Doenças cromossômicas 
• Diagnóstico pré-natal 
• Reconhecimento de doenças virais 
• Monitoramento pós-transplante 
• Diagnósticos de leucemias 
• Diagnósticos de doenças neuronais, como 
Alzheimer precoce 
• Análise de diversas síndromes 
• Pesquisa
FISH 
Hibridização 
in situ 
fluorescente
Referências Bibliográficas:
• ALBERTS, Bruces, JOHSON, Alexander, LEWIS, Julian, ROBERTS, Keith, WALTER, 
Peter, RAFF, Martin. (04/2011). Biologia Molecular da Célula. 5ª edição. Porto 
Alegre: Artmed. 
• ALBERTS, Bruce, BRAY, Dennis, HOPKIN, Karen, JOHNSON, Alexander, LEWIS, 
Julian, RAFF, Martin, ROBERT. (01/2015). Fundamentos da Biologia Celular. 3ª 
edição. Porto Alegre: Artmed. 
• LIPAY, Monica V. N; BIANCO, Bianca; Biologia molecular - métodos e interpretação 
1. ed. - Rio de Janeiro: Roca, 2015. 
• LODISH, H.; BERK, A.; MATSUDAIRA, P.; KAISER, C.A.; KRIEGER, M.; SCOTT, M.P.; 
ZIPURSKY; DARNELL. Biologia Celular e Molecular. 5ª ed. Porto Alegre: Artmed, 
2005. 1054p. 
• BRUNO, A. N. (Org.). Biotecnologia II: aplicações e tecnologias. Porto Alegre: 
Artmed, 2017.