SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO DE DNA 1

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SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO DE DNA 
 
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO DE 
DNA 
 
 
 
As primeiras técnicas de sequenciamento de DNA foram criadas na década de 
1970, por Maxam e Gilbert, e demandavam marcação radioativa das extremidades do 
DNA com fósforo-32 e posterior purificação do segmento a ser sequenciado, sendo o 
sequenciamento limitado a um tamanho de 100 bases, devido à resolução 
proporcionada pelo gel de poliacrilamida. 
Somente no início da década 1980, com um método criado por Sanger e 
colaboradores, o sequenciamento de DNA se tornou popular e foi considerado um 
avanço tecnológico marcante nos estudos genéticos e genômicos. Nessa técnica, um 
segmento de DNA é sintetizado em milhares de fitas-filhas, apresentando, entre elas, 
uma diferença de tamanho de um nucleotídeo; essas fitas-filhas são marcadas com uma 
substância fluorescente em uma das extremidades. 
A determinação da sequência completa de nucleotídeos do genoma de uma 
espécie permite que, posteriormente, os pesquisadores encontrem qualquer sequência 
específica com grande rapidez e precisão, utilizando computadores e algoritmos. A 
disponibilidade de grande quantidade de sequências genômicas possibilitou a busca 
precisa de cópias de sequências associadas nos organismos e entre organismos in silico. 
Para ser sequenciado, o segmento de DNA em questão deve estar disponível em 
grande quantidade e, por isso, é necessária uma prévia amplificação do segmento por 
clonagem ou reação em cadeia da polimerase (PCR). Da mesma forma que na reação de 
PCR comum, no sequenciamento a DNA polimerase é utilizada para copiar a sequência 
de DNA de interesse. 
O precursor normal da síntese do DNA é o desoxirribonucleosídeo trifosfatado 
(dNTP), que apresenta uma hidroxila na posição 3’, a partir da qual a fita nascente é 
estendida. Já para a técnica de sequenciamento, é utilizado um tipo diferente de 
nucleotídeo, denominado dideoxirribonucleosídeo trifosfatado (ddNTP), o qual não 
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contém a hidroxila na posição 3’ e, portanto, quando incorporado a uma fita de DNA, 
interrompe a incorporação de outros nucleotídeos a partir de sua posição. Uma vez o 
ddNTP marcado por radiação ou fluorescência, a fita interrompida se tornará radioativa 
ou fluorescente, podendo ser detectada. 
À medida que os ddNTPs vão sendo incorporados, a reação para nesse ponto e a 
fita não cresce mais; portanto, ao final do ciclo de reações, são produzidos novos 
segmentos de diferentes comprimentos, contendo o análogo didesoxi na extremidade 
3’. Esses segmentos podem, então, ser separados por eletroforese em gel de 
poliacrilamida ou no interior de capilares, conforme o método utilizado para a revelação 
da sequência de interesse. 
No sequenciamento manual, a mesma amostra de DNA é submetida a reações 
de sequenciamento que ocorrem simultaneamente em quatro tubos diferentes, cada 
um contendo um dos quatro ddNTPs, marcados com substâncias radioativas. Esse 
conjunto de segmentos é desnaturado e submetido a eletroforese em gel de acrilamida, 
e a sequência de bases do DNA é lida em chapas de autorradiografia. Por empregar 
substâncias radioativas, ser trabalhosa e demorada, essa técnica foi quase 
completamente substituída por métodos automatizados. 
No sequenciamento automático, os sequenciadores analisam as fitas de DNA 
previamente amplificadas e marcadas com fluoróforos diferentes para cada ddNTP. 
Posteriormente, a mistura de segmentos contida na reação de sequenciamento é 
aplicada em um gel de acrilamida ou no interior de um capilar e a migração, então, 
ocorre até passar pelo detector do equipamento, que capta a emissão de luz em 
comprimentos de onda específicos oriunda dos fluoróforos, quando excitados por um 
feixe de laser. 
O sequenciador, por sua vez, interpreta o sinal e o transforma em um espectro 
gráfico denominado eletroferograma (Figura 1), que demonstra a sequência de DNA 
identificada por meio de picos nos quais cada uma das bases apresenta uma cor 
diferente, facilitando a leitura e a análise da sequência. O que antigamente era limitado 
a 100 bases, atualmente passou para até 700 bases com alta qualidade, existindo 
equipamentos capazes de realizar 96 sequenciamentos a cada duas horas e 
equipamentos contendo 384 colunas diferentes de fracionamento, as quais, 
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teoricamente, podem gerar cerca de 200 mil nucleotídeos (200kb) de sequências brutas 
de DNA em poucas horas. 
 
 
Figura 1 – Eletroferograma de uma sequência de DNA obtida por meio de sequenciamento automático. 
 
As primeiras 30 a 50 bases do sequenciamento não apresentam interpretação 
confiável porque, comumente, a eletroforese nessa região está contaminada com 
reagentes e restos de fluoróforos da reação. Deve-se atentar, também, para a 
interpretação do sequenciamento após 600 a 700 bases, uma vez que, após essa região, 
e dependendo das condições de sequenciamento, a eletroforese fica bastante lenta e o 
computador associado ao equipamento pode interpretar os dados de maneira incorreta 
(duplicando bases e sobrepondo picos, por exemplo). 
Picos duplos significam população dupla e, conforme o objetivo do 
sequenciamento, é possível identificar uma mutação em que uma base foi trocada, 
inserida ou deletada em um dos alelos, além de ser possível a detecção de subtipos virais 
e pools de plasmídeos diferentes, dentre outras aplicações. 
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Caso a reação gere um sinal muito baixo (por exemplo, por falta de primer ou de 
DNA molde, perda do produto durante a precipitação ou exposição dos reagentes 
fluorescentes à luz), o ruído de fundo tende a se misturar com o sequenciamento e, 
consequentemente, a diminuir sua confiabilidade. Dependendo da aplicação destinada 
ao sequenciamento e do grau de interferência, o sequenciamento deve ser 
desconsiderado. Ainda, grandes conjuntos de timina (T) são capazes de interromper o 
sequenciamento. Também é necessário cautela na hora de escolher a posição para os 
primers, pois, se uma sequência dessas estiver antes da região-alvo, o sequenciamento 
não alcançará o objeto de análise. 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
 
GUIMARÃES, G. S. Sequenciamento de DNA. In: CARVALHO, C. V.; RICCI, G.; AFFONSO, 
R. (orgs.). Guia de práticas em Biologia Molecular. 2. ed. São Caetano do Sul: Yendis, 
2014. p. 147-158. 
 
MARTINS, A. F.; FIEGENBAUM, M.; RUPPENTHAL, R. D. Sequenciamento de DNA. In: 
MARTINS, A. F.; FIEGENBAUM, M.; RUPPENTHAL, R. D. Biologia Molecular: aplicando a 
teoria à prática laboratorial. 2. ed. Porto Alegre: Sulina, 2014. p. 82-91. 
 
WATSON, J. D. et al. Técnicas de Biologia Molecular. In: WATSON, J. D. et al. Biologia 
molecular do gene. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. p. 660-667. 
 
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