Seminário de imunologia

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ELISA – Ensaio imunossorvente ligado a enzima – Enzima-linked 
immunosorbent assay 
É uma técnica imunológica empregada para identificar a presença de proteínas, 
anticorpos, hormônios e outras moléculas em uma determinada amostra por 
meio de reações enzimáticas, e fundamenta-se na interação altamente 
específica e sensível entre antígeno e anticorpo. 
O antígeno ou o anticorpo é acoplado de forma covalente a uma enzima, e então 
quantificado por meio da determinação em espectrofotômetro da taxa de 
conversão de um substrato claro em um produto colorido pela ação enzimática. 
Esse ensaio é chamado ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA; do 
inglês, enzyme-linked immunosorbent assay). 
A análise é normalmente conduzida em uma placa de microtitulação com 
revestimento de antígenos específicos que se conectam aos anticorpos. 
O ELISA pode ser categorizado em quatro formatos principais: 
1. ELISA direto: forma mais prática e tem como objetivo verificar a presença 
ou até mesmo a dosagem de anticorpo, permitindo reconhecer se o 
indivíduo ou animal foi exposto a um determinado patógeno. As etapas 
são as seguintes: 
a. Componentes antigênicos oriundos do soro são imobilizados em 
placas com postos de microtitulação. 
b. É adicionado o anticorpo, ligado à uma enzima (pode ser a 
peroxidase ou a fosfatase alcalina) em cada poço para reagir. A 
enzima vai promover a reação e mudança de cor ao contato com o 
substrato. 
c. Durante a etapa seguinte, ocorre o reconhecimento do antígeno 
pelo anticorpo e, após procedimentos intermediários, como 
incubação e lavagem, os componentes não fixados são removidos. 
d. Em seguida, a reação positiva é visualizada ao adicionar um 
substrato específico da enzima usada, causando uma mudança de 
cor na solução devido à catálise enzimática. A intensidade da cor 
é estimada colorimetricamente e é proporcional à concentração do 
anticorpo pesquisado, ou seja, quanto maior a quantidade de 
anticorpo pesquisado, maior a coloração oriunda da reação entre 
substrato e enzima ligada ao anticorpo. 
 
2. ELISA indireto 
a. Componentes antigênicos oriundos do soro são imobilizados em 
placas com postos de microtitulação 
b. É adicionado anticorpos ou soro do paciente (que pode conter o 
anticorpo de interesse caso o soro contenha anticorpos 
direcionados para aquela doença a ser pesquisado) 
c. É acrescentado um segundo anticorpo, denominado anticorpo 
secundário (conjugado a uma enzima), o qual é específico para o 
anticorpo primário e que está conjugado ou ligado a uma 
determinada enzima 
d. Após procedimentos intermediários, como incubação e lavagem, 
os componentes não fixados são removidos. 
e. Após a realização das lavagens, é adicionado o substrato, e a 
enzima gera o sinal de detecção resultante da reação química: 
Enzima, Peróxido de Hidrogênio e Substrato. 
 
3. ELISA sanduíche: largamente utilizada para detectar antígenos 
específicos em baixas concentrações. O ensaio sanduíche emprega dois 
anticorpos diferentes que reagem com epítopos distintos do antígeno, 
cuja concentração precisa ser determinada. 
a. Uma quantidade fixa de um anticorpo é ligada a uma série de 
suportes sólidos em replicata, como os poços de placas de plástico 
para microtitulação. 
b. As soluções de teste contendo antígeno em uma concentração 
desconhecida, ou uma série de soluções-padrão com 
concentrações conhecidas de antígeno, são adicionadas aos 
poços para que ocorra a ligação. 
c. O antígeno não ligado é removido por lavagem, e o anticorpo 
secundário, que está ligado a uma enzima, radiomarcado ou 
marcado fotoquimicamente, é adicionado para se ligar. 
d. Após a realização das lavagens, é adicionado o substrato, e a 
enzima produz o sinal de detecção. 
e. O antígeno serve de ponte, de modo que, quanto mais antígeno 
houver no teste ou nas soluções-padrão, mais ligação ocorrerá do 
anticorpo secundário ligado à enzima ou radiomarcado. Os 
resultados obtidos com as soluções-padrão são usados para 
construir uma curva de ligação para o anticorpo secundário em 
função da concentração de antígeno, a partir da qual as 
quantidades de antígeno nas soluções de teste poderão ser 
estimadas. 
A abordagem do ELISA sanduíche foi adaptada para muitos testes 
rápidos e testes domésticos, em que a geração enzimática de um 
produto colorido é prontamente determinada por 
espectrofotômetros portáteis. Na maioria dos testes domésticos, 
como os testes de gravidez, a tecnologia de fluxo lateral é 
empregada. A amostra, como uma gota de urina, é adicionada em 
uma extremidade de uma matriz e se difunde linearmente, 
encontrando primeiro o anticorpo pré-ligado específico para o 
analito e marcado com uma esfera (bead) ou um agente químico 
coloridos. Em seguida, os complexos formados pelo anticorpo 
marcado e o analito ligado se difundem ainda mais até serem 
imobilizados por um segundo anticorpo específico contra o analito, 
formando uma linha colorida que indica um teste positivo. Uma 
variação dessa tecnologia é um teste competitivo em que o analito 
na amostra compete com o analito pré-adicionado, e a ausência de 
uma linha colorida indica um resultado positivo. 
 
 
 
 
4. ELISA competitiva ou ELISA de bloqueio 
a. O antígeno é previamente incubado com um anticorpo específico 
marcado com uma enzima. 
b. Em seguida, a mistura antígeno-anticorpo é adicionada à placa 
revestida com um anticorpo capturador. 
c. O antígeno marcado competirá com o antígeno da amostra pela 
ligação ao anticorpo capturador na superfície da placa. 
d. Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, menor será a 
quantidade de antígeno marcado que se ligará ao anticorpo 
capturador. 
e. Após a lavagem para remover o excesso de reagentes, a atividade 
enzimática é medida, sendo inversamente proporcional à 
quantidade de antígeno presente na amostra.