Protocolo Extração de microRNAs

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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
Centro de Estudos e Pesquisas em Doenças Infecciosas e Parasitárias - CEPEDIP
Laboratório de Micobacteriologia Molecular
	
PROCEDIMENTO OPERACIONAL
PADRONIZADO
POP IM-003
	
Título: Protocolo para Extração de microRNAs de Soro/Plasma
	Universidade Federal do Rio de Janeiro
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
Centro de Estudos e Pesquisas em Doenças Infecciosas e Parasitárias - CEPEDIP
Laboratório de Micobacteriologia Molecular
	
PROCEDIMENTO 
OPERACIONAL 
PADRONIZADO
	
Título: Protocolo para Extração de microRNAs de Soro/Plasma
	
POP IM-003
	
Emissão: 17/03/2017
	
Revisão:
	
Validade: 23/02/2017
	
Nº 01
1. OBJETIVO:
Este documento tem por objetivo descrever e normatizar as exigências para manipulação do Kit miRNeasy Serum/Plasma para a extração de microRNAs de amostras de soro ou plasma de pacientes.
2. CAMPO DE APLICAÇÃO:
Este POP se aplica ao uso de experimentos da biologia molecular para a purificação de RNA total livre de células – principalmente miRNA e outros pequenos RNA a partir de pequenos volumes de soro e plasma.
3. ABREVIAÇÕES/SIGLAS
· PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
· EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid (Ácido Etilenodiamino Tetra-acético)
· RWT – Tampão fornecido como um concentrado
· RPE - Tampão fornecido como um concentrado 
· RNA – Ácido ribonucleico
4. RESPONSABILIDADES:
4.1. Responsabilidade do chefe de laboratório:
É de responsabilidade do chefe de laboratório designar técnicos qualificados para execução do protocolo, supervisionar os resultados obtidos e gerenciar a manutenção do estoque de materiais e equipamentos necessários para a realização do protocolo.
4.2. Responsabilidade do técnico de processamento de amostras:
É de responsabilidade do técnico preparar todo o ambiente de trabalho antes do processamento e mantê-lo limpo e organizado, verificar o estoque e qualidade dos equipamentos e relatar o necessário ao chefe de laboratório, seguir o protocolo detalhadamente para obtenção de bons resultados, relatar sugestões ou falhas em relação a este POP e supervisionar novos técnicos em treinamento.
4.3. Responsabilidade do técnico/equipe em gestão de qualidade:
É de responsabilidade desse setor analisar as sugestões e críticas ao POP, assim como modificações de infraestrutura e outros parâmetros que possam alterar as condições de processamento, e revisar o POP anualmente ou quando necessário. 
5. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES
5.1. Preparação do ambiente de trabalho:
a. Preparação do fluxo laminar (vide POP E-006 ou E-007)
· Ligue a cabine e o exaustor, e aguarde 5 minutos para a estabilização do fluxo de ar.
· Limpe toda a superfície de trabalho e materiais dentro da cabine com álcool 70%.
· Limpe com álcool 70% todos os materiais necessários antes de inseri-los na cabine.
· Ligue a luz U.V. por 30 minutos.
b. Prover o material necessário à realização da técnica e verificar o funcionamento dos equipamentos utilizados.
· Equipamentos:
· Cabine de segurança Classe II B2
· Pipetas automáticas de 10 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL devidamente calibradas
· Microcentrífuga (s) (com rotor para tubos de 2 ml) para centrifugação a 4 ° C e à temperatura ambiente (15-25 ° C)
· Reagentes/materiais:
· Clorofórmio (sem adição de álcool isoamílico)
· Etanol (70%, 80% e 96-100%) 
· Pontas de pipeta estéreis sem RNase
· Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml ou 2 ml
· Luvas descartáveis
· O Controle de Spray-In de Soro / Plasma miRNeasy deve ser adquirido separadamente
· Tris/HCL 1M, pH 8 autoclavado
· EDTA pH 8 autoclavado
· Água destilada
5.2. Armazenamento e precauções:
· Após a chegada do Kit, armazenar as colunas de centrifugação RNeasy MinElute imediatamente a 2-8°C.
· O QlAzol pode ser estocado a temperatura ambiente (15-25°C) ou a 2-8°C.
· Armazenar o miScript primer assay Ce_miR-39_1 a -20 ° C quer liofilizado ou reconstituído.
· O Controle de Spray-In de Serum/Plasma de miRNeasy é enviado à temperatura ambiente. Armazenar a -20 ° C, reconstituído ou liofilizado.
· Armazenar os restantes componentes secos à temperatura ambiente. 
· Todos os componentes do kit são estáveis durante pelo menos 9 meses nestas condições.
5.3. Controle de qualidade:
· De acordo com o Sistema de Gestão de Qualidade de Certificação - ISO da QIAGEN, cada lote de Kit de Soro / Plasma miRNeasy e Controle de Ponto / Soro de MiRNeasy Serum / Plasma é testado contra especificações pré-determinadas para garantir a qualidade consistente do produto.
5.4. Recebimento das amostras:
· As amostras de soro ou plasma devem ser mantidas refrigeradas entre 2 a 8°C se forem processadas no mesmo dia (até 6 horas)
· Para um armazenamento mais prolongado, mantenha o soro congelado em alíquotas a -20°C ou -80 °C.
· Verificar temperatura, identificação e integridade do tubo. Registrar informações no formulário de rastreamento de amostras.
5.5. Observações antes de dar início ao protocolo:
· As amostras de sangue não devem ser coletadas em tubos contendo heparina, pois este reagente interfere com a PCR. Pode-se utilizar EDTA ou citrato;
· Observar o soro/plasma e anotar qualquer tipo de alteração não esperada (cor avermelhada indicando lise de hemácias, etc);
· O processamento de mais de 200 μl de amostra não é recomendado
· Verificar se já foi adicionado etanol absoluto nos tampões RWT e RPE, 30 mL e 44 mL, respectivamente (informação presente no rótulo dos frascos). Marcar a tampa do frasco onde o etanol já foi acrescentado;
· Se necessário, dissolver a formação de precipitados do tampão RWT através de aquecimento (15-25 oC);
· Não será adicionado nenhum tipo de controle Spike-in antes ou durante o procedimento;
· NUNCA tocar o filtro/membrana com a ponteira.
5.6. Processamento de amostras no laboratório:
Procedimentos para extração de microRNAs
· Descongelar as amostras de soro no gelo e usar para extração logo em seguida.
· Para cada 200 µL de soro, utilizar 5 vezes o volume de Qiazol. Homogeneizar, pipetando com cuidado. Para fins de referência, consultar a tabela abaixo:
	Soro/Plasma
(µL)
	Qiazol (µL)
Etapa 2
	Clorofórmio (µL)
Etapa 4
	Fase aquosa (µL)
Etapa 7
	Etanol absoluto (µL)
	≤50
	250
	50
	150
	225
	100
	500
	100
	300
	450
	200
	1000
	200
	600
	900
· Incubar por 5 min a temperatura ambiente
· Adicionar o volume de clorofórmio correspondente ao volume inicial de soro. Por exemplo, se o volume de soro utilizado foi 200 µL, adicionar 200 µL de clorofórmio.
· Agitar vigorosamente por aproximadamente 15 seg. Nesta etapa, a cor do lisado pode ficar um rosa-leitoso, lembrando a cor de um iogurte. Incubar por 2-3 min a temperatura ambiente.
· Centrifugar por 15 min a 12.000g, 4 oC. Após centrifugação, ajustar a temperatura para 25 oC. Após a centrifugação será ocorrerá a formação de três fases: (A) fase orgânica, inferior (rosa); (B) fase intermediária (branca) e (C) fase aquosa, superior, (incolor) onde se encontra o RNA. O volume esperado da fase aquosa pode ser verificado na tabela inicial deste protocolo.
· Transferir a fase aquosa para um novo tubo eppendorf (não fornecido pelo kit). Adicionar 1,5 vezes o volume de etanol absoluto (verificar tabela). Homogeneizar pipetando cuidadosamente.
Após a adição do etanol, poderá ser observada a formação de um precipitado. Isto não altera o andamento do protocolo. Prosseguir normalmente, sem demora, para próxima etapa. 
· Pipetar 700 µL da solução, incluindo qualquer precipitado, na ‘RNeasy MinElute spin column’ – a coluna já vem encaixada em um tubo de 2 mL. Centrifugar por 8.000g, 15 seg a temperatura ambiente (25 oC). Descartar o líquido presente no tubo de coleta.
Em alguns modelos de centrífuga, não é possível utilizar o tempo de 15 seg, neste caso, centrifugar por 1 min.O filtro suporta apenas 700 µL por vez. Não exceder este volume. Utilizar o mesmo tubo de coleta na etapa 9.
· Repetir a etapa 8 com a solução remanescente, respeitando o limite de 700 µL por filtro. Descartar o líquido presente no tubode coleta. Repetir o passo 9 enquanto houver líquido a ser filtrado.Utilizar o mesmo tubo de coleta na etapa 10.
· Adicionar na coluna 700 µL do tampão de lavagem RWT. Centrifugar a 8.000g, 15 seg a temperatura ambiente (25 oC). Descartar o líquido presente no tubo de coleta. Utilizar o mesmo tubo de coleta na etapa 11.
· Adicionar na coluna 500 µL do tampão de lavagem RPE. Centrifugar a 8.000g, 15 seg temperatura ambiente (25 oC). Descartar o líquido presente no tubo de coleta. Utilizar o mesmo tubo de coleta na etapa 12.
· Adicionar na coluna 500 µL de etanol 80%. Centrifugar a 8.000g, 2 min a temperatura ambiente (25 oC). Descartar o tubo de coleta contendo o líquido presente. Após a centrifugação, cuidadosamente remover a ‘RNeasy MinElute spin column’, encaixando-a em um novo tubo de coleta de 2 mL (vem com o kit). O etanol 80% deve ser preparado com água RF (RNase free) usando etanol absoluto
· Após encaixar a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL, centrifugar por 5 min a velocidade máxima, com a tampa da coluna aberta para secar a membrana. Descartar o tubo de coleta contendo o líquido presente. A abertura da tampa é um passo importante para permitir que todo o etanol evapore. Ao distribuir os tubos, procurar deixar uma posição vazia entre cada tubo a fim de evitar que a tampa quebre. Se o rotor girar no sentido horário, orientar as tampas no sentido oposto, anti-horário.
· Encaixar a ‘RNeasy MinElute spin column’ em um tubo de coleta de 1,5 mL (vem com o kit). Adicionar 10 µl de água RNase free (vem com o kit) no centro da coluna, sem tocar com a ponteira. Incubar por 1-2 min a temperatura ambiente. Este procedimento favorece a hidratação da membrana, resultando em uma melhor recuperação do RNA. Centrifugar por 1 min, na velocidade máxima a temperatura ambiente. O volume morto do filtro/membrana é de 2 µL, ou seja, espera-se recuperar 8 µL de eluato. Não utilizar menos de 10 µL para eluição do RNA.
· Após a recuperação do RNA, colocar os tubos no gelo. Proceder para a quantificação do RNA no Nanodrop® e/ou Bioanalyzer®. O RNA deve ser estocado a -80 oC.
6. ANEXOS
Não disponível
7. FORMULÁRIOS UTILIZADOS
Não disponível
8. REFERÊNCIAS
8.1. Manual de Instruções:
https://www.qiagen.com/ch/resources/resourcedetail?id=710c0168-e408-408b-95af-91df5b5b1dd6&lang=en
8.2. Maiores informações:
www.qiagen.com
9. HISTÓRICO DE REVISÕES
	No. DA 
REVISÃO
	
DATA
	ITEM
ALTERADO
	DESCRIÇÃO DA
ALTERAÇÃO
	RESP. PELA ALTERAÇÃO
	
JUSTIFICATIVA
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	ELABORAÇÃO
	ANÁLISE CRÍTICA
	APROVAÇÃO
	Carla de Magalhães Karusky
(Coordenadora do Laboratório de Micobacteriologia Molecular, HUCFF/UFRJ).
	Mayla G M de Melo
Estudante de Medicina
Técnica de Imunoensaios – RePORT-TB
Convênio NIH/UFRJ
	Martha Maria Oliveira
Gestora de Qualidade – Rede-TB
	Cópia Controlada – Reprodução Proibida Página 1 de 6
	Página 6 de 6 
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