Principios da Reação em Cadeia da Polimerase

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¡  É	
   uma	
   reação	
   “in	
   vitro”	
   que	
   mimetiza	
   o	
   processo	
  
fisiológico	
   de	
   replicação	
   do	
   DNA	
   com	
   o	
   objetivo	
   de	
  
produzir	
   milhares	
   de	
   cópias	
   de	
   uma	
   região	
   pré-­‐
determinada	
  do	
  DNA;	
  
¡  Cópia	
  de	
  fragmentos	
  pequenos	
  de	
  DNA	
  (até	
  10kb);	
  
	
  
¡  Produtos	
  de	
  PCR	
  são	
  chamados	
  de	
  amplicons;	
  
	
  
¡  Vantagens	
  :	
  rápido,	
  sensibilidade,	
  
	
   	
   	
  	
  	
  especificidade.	
  
	
  
¡  Técnica	
  “inventada”	
  em	
  1983	
  por	
  Kary	
  B.	
  Mullis;	
  
	
  
¡  Princípios	
  básicos	
  da	
  técnica	
  de	
  PCR	
  foram	
  
descritos	
  em	
  1971	
  por	
  Kjell	
  Klepper	
  e	
  col.,	
  
entretanto,	
  a	
  DNA	
  polimerase	
  utilizada	
  (E.coli)	
  
era	
  destruída	
  durante	
  os	
  ciclos	
  de	
  aquecimento	
  e	
  
era	
  necessário	
  adição	
  consecutiva	
  a	
  cada	
  novo	
  
ciclo;	
  
	
  
¡  Foi	
  o	
  primeiro	
  a	
  sugerir	
  a	
  utilização	
  	
  
de	
  uma	
  DNA	
  Polimerase	
  “termoestável”.	
  
¡  Várias	
   tentativas	
   de	
   publicações	
   de	
   seus	
   experimentos	
  
negadas;	
  
¡  Amplificação	
  do	
  gene	
  da	
  β-­‐globina	
  –	
  Methods	
  of	
  Enzymology.	
  
¡  Kary	
   Mullis	
   à	
   Prêmio	
  
Nobel	
  de	
  Química	
  em	
  1993;	
  
	
  
¡  Vendeu	
   patente	
   para	
  Cetus	
  
Corporation	
   à	
   venda	
   da	
  
patente	
   US$	
   300	
   milhões	
  
Roche	
  Molecular	
  Systems.	
  	
  
¡  1969	
  –	
  T.	
  Brock	
  e	
  H.	
  Freeze	
  
relataram	
  a	
  descoberta	
  de	
  
uma	
  nova	
  espécie	
  de	
  
bactéria	
  –	
  Thermus	
  
aquaticus	
  –	
  sobrevive	
  na	
  
água	
  a	
  temperatura	
  média	
  
de	
  75ºC	
  	
  
Yellowstone	
  National	
  Park	
  
¡  Taq	
  DNA	
  Polimerase	
  –	
  temperatura	
  ótima	
  de	
  
72°C	
  e	
  é	
  estável	
  até	
  temperaturas	
  superiores	
  
a	
  94°C	
  
¡  O	
  primeiro	
  termociclador	
  foi	
  desenvolvido	
  
na	
  Cetus	
  Corp.	
  –	
  Mr	
  Cycle;	
  
¡  Projetado	
  para	
  que	
  a	
  DNA	
  polimerase	
  
pudesse	
  ser	
  adicionada	
  a	
  cada	
  ciclo;	
  
¡  Após	
  a	
  descoberta	
  da	
  DNA	
  polimerase	
  
termoestável	
  eram	
  necessárias	
  máquinas	
  
com	
  ciclagem	
  mais	
  rápida	
  entre	
  diferentes	
  
temperaturas;	
  
¡  1985	
  -­‐Cetus	
  Corp.	
  em	
  parceria	
  com	
  a	
  
Perkin-­‐Elmer	
  desenvolveram	
  o	
  primeiro	
  
termociclador	
  
¡  Todas	
  as	
  Taq	
  DNA-­‐POLIMERASES	
  requerem	
  para	
  
seu	
  funcionamento:	
  
	
  
§  Molécula	
  de	
  DNA	
  –molde	
  (amostra)	
  
§  Tampão	
  	
  
§  Um	
  par	
  de	
  oligonucleotídeo	
  	
  
	
  (Primer	
  ou	
  iniciador)	
  
§  Cátions	
  divalentes:	
  	
  
	
  Magnésio-­‐	
  MgCl2	
  
§  Desoxinucleotídeos	
  trifosfato	
  	
  
	
  (dNTPs)	
  
Localização	
  da	
  sequência	
  alvo	
  é	
  feita	
  pelos	
  Primers	
  
	
  
¡  Oligonucleotídeos	
   formados	
  por	
  uma	
  seqüência	
  de	
  
20-­‐24	
  bases	
  -­‐	
  seletivos	
  o	
  suficiente	
  para	
  localizar	
  um	
  
sítio	
  único	
  em	
  um	
  genoma	
  de	
  alta	
  complexidade;	
  
§  A	
  probabilidade	
  de	
  uma	
  sequência	
  específica	
  de	
  20	
  bases	
  
ocorrer	
  em	
  um	
  genoma	
  é	
  uma	
  vez	
  a	
  cada	
  420	
  bases.	
  
	
  	
  
¡  É	
   complementar	
   a	
   seqüência	
   alvo	
   que	
   se	
   quer	
  
amplificar.	
  
¡  O	
  pareamento	
  dos	
  primers	
  com	
  a	
  sequência	
  alvo	
  se	
  
faz	
  pelo	
  estabelecimento	
  de	
  pontes	
  de	
  hidrogênio,	
  
obedecendo	
  o	
  pareamento	
  convencional	
  descrito	
  
por	
  Watson	
  e	
  Crick:	
  
A	
  =	
  T	
  
C	
  Ξ	
  G	
  
¡  Tampão	
  à	
  Mantém	
  o	
  pH	
  ótimo	
  para	
  a	
  enzima.	
  	
  
§  Promove	
  a	
  força	
   iônica	
  ótima	
  para	
  máxima	
  atividade	
  
da	
  enzima.	
  
	
  
¡  dNTPà	
  Desoxirribonucleotídeos	
  trifosfatos	
  
▪  dATP-­‐deoxiadenosinanucleotídeo	
  fosfatado;	
  	
  
▪  dTTP-­‐deoxitiminanucleotídeo	
  fosfatado;	
  	
  
▪  dGTP-­‐deoxiaguanosinanucleotídeo	
  fosfatado;	
  
▪  dCTP-­‐deoxicitidinanucleotídeo	
  fosfatado;	
  
§  	
   São	
   os	
   nucleotídeos	
   utilizados	
   pela	
   Taq	
   DNA	
  
polimerase	
  na	
  fase	
  de	
  extensão	
  da	
  cadeia.	
  
¡  Íons	
  Mg+2	
  à	
  Cofator	
  da	
  enzima	
  Taq	
  polimerase.	
  
§  Interfere	
  na	
  especificidade	
  da	
  reação;	
  
§  Concentração	
  ideal	
  por	
  reação:	
  1	
  –	
  4	
  mM	
  
	
  
¡  Consiste	
  em	
  ciclos	
  repetitivos	
  compostos	
  por	
  
temperaturas	
  pré-­‐determinadas	
  
DESNATURAÇÃO:	
  94	
  –	
  96ºC.	
  	
  
Separa	
  a	
  dupla	
  fita	
  de	
  DNA	
  em	
  duas	
  
fitas	
  simples.	
  
	
  
ANELAMENTO:	
  50	
  -­‐	
  65ºC.	
  
Acoplamento/hibridização	
  dos	
  primers	
  
nos	
  sítios	
  específicos	
  do	
  DNA	
  molde;	
  
DEPENDE	
  DA	
  [	
  ]	
  DE	
  C	
  e	
  G	
  DO	
  primer.	
  
	
  
EXTENSÃO:	
  72ºC	
  
A	
  DNA	
  polimerase	
  usa	
  os	
  dNTPs	
  para	
  
adicionar	
  os	
  nucleotídeos	
  criando	
  
moléculas	
  complementares.	
  
R
F
Crescimento exponencial do número de moléculas 
¡  Temperature	
  of	
  melting	
  (Tm)	
  na	
  faixa	
  de	
  52	
  ºC	
  a	
  65	
  ºC	
  
¡  Cálculo	
  da	
  Tm	
  (<	
  20	
  bases)	
  :	
  
§  Tm	
  =	
  4(G+C)	
  +	
  2(A+T)°C	
  
¡  O	
  pareamento	
  específico	
  (hibridização)	
  depende	
  
criticamente	
  da	
  temperatura,	
  além	
  de	
  ser	
  influenciado	
  pela	
  
concentração	
  de	
  cátions	
  divalentes	
  (Mg+2);	
  
	
  
¡  Tamanho:	
  20	
  -­‐25	
  bases	
  	
  
¡  Sequência:	
  40-­‐50%	
  de	
  G+C	
  distribuídos	
  aleatoriamente;	
  	
  
¡  Checar	
  para	
  formação	
  de	
  estruturas	
  secundárias	
  internas	
  ;	
  
¡  Evitar	
  complementariedade	
  entre	
  os	
  pares	
  de	
  primers;	
  
¡  Checar	
  se	
  o	
  par	
  de	
  primers	
  tem	
  Tm	
  próximas	
  	
  
	
  (no	
  máximo,	
  de	
  2	
  a	
  3ºC	
  de	
  diferença)	
  .	
  
1-­‐	
  www.ensembl.org;	
  
§  Pesquisar	
  a	
  sequência	
  alvo.	
  
	
  
2-­‐	
  http://frodo.wi.mit.edu	
  à	
  Primer3;	
  
¡  Sequência	
  de	
  primers	
  Forward	
  e	
  Reverse.	
  
¡  Primer	
  Forward	
  –	
  próximo	
  da	
  extremidade	
  5’	
  com	
  a	
  sequência	
  
igual	
  a	
  da	
  fita	
  molde;	
  Primer	
  Reverse	
  –	
  próximo	
  da	
  extremidade	
  
3’	
  com	
  a	
  sequência	
  complementar	
  a	
  da	
  fita	
  molde.	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
3-­‐	
  http://genome.ucsc.edu/.	
  	
  	
  
§  PCR	
  in	
  silico	
  –	
  tamanho	
  do	
  produto.	
  
¡  A	
  duração	
  da	
  etapa	
  de	
  extensão	
  (72°C)	
  deve	
  
ser	
  calculada	
  em	
  função	
  do	
  tamanho	
  do	
  
produto	
  que	
  se	
  deseja	
  amplificar;	
  
	
  
¡  Em	
  geral	
  utiliza-­‐se	
  1	
  min/kb	
  de	
  produto;	
  
¡  Cada	
  uma	
  das	
  novas	
  fitasde	
  DNA	
  estendidas	
  a	
  
partir	
  dos	
  primers	
  serve	
  
como	
  amostra	
  (template)	
  
para	
  síntese	
  de	
  uma	
  nova	
  
fita.	
  Isso	
  garante	
  o	
  
aumento	
  exponencial	
  do	
  
número	
  de	
  novas	
  fitas.	
  
Análise	
  da	
  PCR	
  	
  	
  
Gel	
  agarose	
  
¡  Contaminantes	
  na	
  amostra	
  de	
  DNA	
  podem	
  inibir	
  
fortemente	
  a	
  PCR.	
  
¡  Inibidores	
  da	
  DNA	
  polimerase:	
  
§  Fenol	
  
§  Proteinase	
  K	
  
§  Agentes	
  quelantes	
  em	
  excesso	
  (EDTA)	
  
§  Elevadas	
  concentrações	
  de	
  sal	
  
§  SDS	
  
§  Amostras	
  hemolisadas	
  
§  Heparina	
  	
  
¡  Diagnóstico	
  de	
  doenças	
  hereditárias;	
  
¡  Sequenciamento	
  direto	
  de	
  genes;	
  
¡  Teste	
  de	
  Paternidade;	
  
¡  Medicina	
  Forense;	
  
¡  Detecção	
  de	
  mutação/polimorfismo	
  em	
  
genes	
  específicos;	
  
¡  Detecção	
  de	
  doenças	
  infecciosas;	
  
¡  Engenharia	
  genética