154-Material-Curso-Pro-Hemoce-IPH5e22e0bc576ff

Prévia do material em texto

PCR: Conceitos e
Aplicações
Ms. Pedro Aurio Maia Filho
PEDRO AURIO MAIA FILHO
• Graduado em Farmácia pela Universidade
Federal do Ceará (UFC);
• Especialista em Citologia Esfoliativa e Onco-
Hematologia/UNIFOR;
• Mestre em Patologia/UFC;
• Doutorando em Ciências Farmacêuticas/UFC.
– Laboratório de Hemoglobinopatias e
Genética das Doenças Hematológicas/UFC
• Farmacêutico da UFC;
• Professor do Centro Universitário Fametro
(UNIFAMETRO).
PCR: Conceitos
Breve Histórico...
• Foi descrita por Kary Mullis em 1987;
• A Perkin-Elmer e a Roche patenteram o
processo;
• 1993 – Kary Mullis foi agraciado com o Prêmio
Nobel de Química.
Definição
• Reação em Cadeia pela Polimerase é uma
reação de amplificação exponencial de um
segmento específico de DNA dentro de um
genoma até um ponto em que sua
concentração em dada solução seja tão alta
que possa ser facilmente detectável.
Objetivo
• Síntese de muitas cópias de uma sequência
específica de ácido nucleico, a partir de um
DNA-molde;
• Produção de DNA in vitro.
A PCR revolucionou a biologia 
molecular
Sensibilidade Especificidade
Molécula de DNA
Nucleotídeos de DNA
• O genoma humano tem cerca de 3 bilhões de 
nucleotídeos.
*RNA = Uracila
*
Molécula de DNA
Procedimento
Extração 
de DNA
PCR
Mg2+
(cofator da Taq)
dNTPs:
dCTP, dGTP, 
dATP e dTTP
taq-DNA polimerase 
(Thermus aquaticus)
DNA molde
Primers
O tampão mantém o pH ótimo para a atividade da enzima
Etapas da PCR
• 1. Temperatura de desnaturação do DNA;
• 2. Temperatura de ligação dos iniciadores;
• 3. Temperatura de extensão da fita de DNA.
Passo 1: Desnaturação
• Separação das fitas de DNA
Passo 2: Anelamento
• Ligação dos pares de primers (sequências de 
iniciação).
Passo 3: Extensão
• DNA polimerase adiciona nucleotídeos no
sentido 5’ 3’ em fita duplas de DNA (primers
anelados).
E as ciclagens térmicas?
• Termociclador.
Antes???
Reagentes para PCR?
• Comprados comercialmente;
• Master Mix PCR (íons Mg2+, Taq DNA
Polimerase e dNTPs);
– Thermo Fisher;
– Biorad;
– Outras.
Componentes e Condições
DNA molde dNTPs
Concentração 
de íons Mg2+
Taq DNA 
Polimerase
Primers e 
dímeros de 
primers
Temperatura 
de fusão e 
anelamento
Inibidores da 
PCR
Parâmetros do 
Ciclo
DNA molde
• A PCR amplifica a partir de ng de DNA;
• A quantidade de DNA inicial não deve exceder
1 a 2 µg (para DNA genômico e cDNA), já que
pode resultar em falso anelamento do primer;
• As amostras de DNA muito diluídas podem
levar a uma amplificação em pequena
quantidade.
Concentração de Íons Mg2+
• Cofator para a atividade da Taq DNA-
polimerase;
• Concentração ótima: 1,2 a 1,3 mM;
• Formação de complexo: Mg2+ - dNTPs;
O excesso de Mg2+:
redução na fidelidade 
(aumento da taxa de erro) 
da Taq DNA-polimerase, 
formando produtos 
inespecíficos.
Baixa concentração 
de Mg2+: haverá pouco 
ou nenhum produto 
formado.
dNTPs
• São blocos construtores do DNA: dATP, dCTP,
dGTP e dTTP;
• Concentração recomendada: 200 μM (0,2mM)
para cada dNTP;
• Interfere na concentração de Mg+2: formação
de complexo (quelação).
A concentração de 200 μM para cada dNTP pode até ser 
excessiva, mas a sua diminuição não é necessária se a Taq
DNA-polimerase usada tiver atividade exonucleásica.
Taq DNA Polimerase
• Thermus aquaticus (bactéria em fontes
hidrotermais – em torno de 100⁰ C);
• Atividade polimerásica;
• Atividade exonucleásica.
Primers
• O ideal é aquele que anela a uma única
sequência-alvo e não a outra região do DNA;
• Teor de GC (%);
• Comprimento: 18 – 30 nucleotídeos (até 4 Kb)
e 30 – 35 (mais de 4 Kb);
• Evitar complementariedade de bases internas
(ex: hairpins);
• A complementariedade total de extremidade
3’ é fundamental para a extensão.
Dímeros de Primers
• São formados quando um primer anela
parcialmente a outro, criando um molde para
a DNA-polimerase;
• Implica em uma menor disponibilidade dos
primers para anelar com o DNA-alvo e uma
competição por consumo de nucleotídeos e
enzima.
Como obter os primers?
• Customizados ou pré-desenhados;
• Ferramentas grátis:
– Primer-Blast;
– Primer3 Plus.
Temperatura de Fusão do Primer (Tm) 
e Anelamento
• Tm é a temperatura na qual 50% da sequência do
primer encontra-se associada ao DNA-alvo:
– Depende do seu tamanho, do conteúdo de GC e do
tipo de cátion presente na solução (Na+);
• Temperatura ideal de anelamento é estimada em
torno de 5℃ abaixo da temperatura de fusão,
porém na prática é algo muito empírico.
𝑻𝒎 = 𝟖𝟏, 𝟓 + 𝟏𝟔, 𝟔 [𝐥𝐨𝐠 (Na+)] + 0,41 (%G + C) – 600/mer
𝑻𝒎 = 𝟐 𝑨 + 𝑻 + 𝟒 (𝑮 + 𝑪)
O sucesso da PCR depende, principalmente, da 
especificidade de anelamento do primer com a 
sequencia-alvo, e isso depende criticamente da 
sua temperatura de fusão (Tm).
A temperatura de fusão de cada um dos primers
do par deve ser a mais próxima possível, para que 
ambos tenham um desempenho semelhante no 
pareamento de bases com o DNA-alvo.
Inibidores da PCR
• Podem ter origem na própria amostra ou nos
reagentes usados na coleta e preparo:
– Ex: grupamentos heme, bilirrubina, bile e sais
inibem a PCR de amostras biológicas;
– A taq DNA-polimerase é muito sensível a
compostos orgânicos e inorgânicos (proteinase K,
SDS, Heparina, EDTA, isotiocianato de guanidina).
• Existe uma variedade de métodos para a
remoção de inibidores:
– Diluição da amostra de DNA (aumentar n◦ ciclos).
Parâmetros dos Ciclos Térmicos
O número de ciclos 
depende da 
complexidade e 
quantidade de DNA-
molde inicial;
O tempo e o número de 
ciclos afetam 
dramaticamente a 
obtenção do produto e 
especificidade;
O padrão de 
amplificação é de 25 a 
35 ciclos, podendo ser 
até 40 (alta 
sensibilidade);
Não é acoselhável
ultrapassar 40 ciclos 
quando se usa a enzima 
taq DNA-polimerase;
Parâmetros dos Ciclos Térmicos
Outro parâmetro que pode 
influenciar é o tempo de 
incubação de cada ciclo, que 
depende das características 
do termociclador e do 
microtubo utilizado;
A desnaturação incompleta 
do DNA-alvo, principalmente 
quando ele é rico em GC, é 
uma das causas de falha da 
PCR.
As condições típicas para uma 
desnaturação eficiente são:
30 segundos a 95° C
15 segundos a 97° C
Vantagens e Limitações da PCR
• Vantagens
– Simples, sensível e específica;
– Rápida, barata e segura;
– Não é necessário isolar o DNA que se quer
amplificar, a especificidade é definida pelos
primers.
• Limitações
– Necessidade de conhecer a sequência de DNA que
se quer amplificar para a sínteses dos primers;
– Contaminação devido a alta sensibilidade;
– Aplicação da PCR na amplificação de sequências
extensas.
Aplicações
• Microbiologia clínica;
• Sequenciamento de genes;
• Oncologia clínica;
• Diganóstico de doenças;
• Teste de paternidade;
• Medicina forense;
• Clonagem;
• Outros.
Tipos de PCR
• PCR tradicional;
• PCR-RT;
• PCR em tempo real;
• Nested-PCR;
• PCR multiplex;
• Fast PCR.
PCR tradicional
PCR tradicional
Extração 
de DNA
PCR
Análise da 
Amplificação
Análise da Amplificação
• PCR tradicional
– Eletroforese em géis de agarose e poliacrilamida;
– Quali ou semi-quantitativa.
Antes da PCR Depois da PCR
Análise da Amplificação
Eletroforese
Análise
Os poços recebem:
• Tampão de carreamento:
– Leva o DNA para o fundo do poço;
– Permite o monitoramento ao long da corrida;
• Corante de DNA
– Permite a visualização do DNA;
– Exemplos: Brometo de etídeo, SYBR Green.
Análise
• Transluminador/Fotodocumentador
RT-PCR
Definição
• RT-PCR é uma reação da transcriptase reversa,
seguida de reação em cadeia da polimerase;
• Não utiliza o DNA de cadeia dupla como
molde e sim RNA de cadeia simples;
• A partir do RNA, a enzima transcriptase
reversa sintetiza uma cadeia de DNA
complementar (chamado agora de cDNA);
• Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.
Preparação do RNA
RNA é uma 
molécula 
muito instável
É susceptível à 
degradação 
por RNAses
Método de 
extração e 
purificação
RNA de alta 
qualidade
A relação:A260/280 ≥ 2,0 
(PROTEÍNAS)
AVALIAÇÃO DA
QUALIDADE DO
RNA
Extração de RNA
• Um dos produtos comerciais mais usados é o
Trizol (Invitrogen®);
– Solução monofásica de fenol e guanidina
isotiocianato;
– Durante a extração, o Trizol rompe as células e
mantém a integridade do RNA;
– O acréscimo do clorofórmio separa a solução em fase
aquosa e orgânica, sendo que o RNA permanece na
fase aquosa;
– O RNA presente na fase aquosa pode ser precipitado
com isopropanol.
Procedimento da RT-PCR
Extração
de RNA
RNA
dNTPs
Buffer
Água
qRT
cDNA
PCR em 
tempo real
AMV
M-MLV
Métodos de qRT-PCR
• Uma etapa (one-step)
– Exige um único mix de reação, pois a RT e a PCR
ocorrem no mesmo tubo;
– Requer primer de sequência específica para síntese
de cDNA.
• Duas etapas (two-step)
– Exige dois mix de reação (RT e PCR);
– O cDNA pode ser armazenado para uso posterior.
PCR em Tempo Real
Análise da Amplificação
• PCR tradicional
– Eletroforese em géis de agarose e poliacrilamida;
– Quali ou semi-quantitativa.
• PCR em tempo real
– Sistemas automatizados (sinais gráficos);
– Quantitativo.
Princípio
É uma reação na qual é
possível monitorar o
resultado da PCR enquanto
ela progride;
Os dados são coletados ao
longo da PCR, ao invés de
serem apenas no final da
reação.
Vantagens da qPCR
• A capacidade de determinar o número de
cópias de um template;
• Reduz o tempo de experimento;
• Diminui o risco de contaminação.
Métodos de Detecção
• O produto da PCR é detectado à medida que
vai sendo produzido, com auxílio de corantes
fluorescentes:
– SYBR Green I;
– Sonda de hidrólise TaqMan®.
Sistema Corante SYBR Green I
• Liga-se ao DNA dupla-fita para detectar o
produto da PCR conforme ele se acumula
durante os ciclos da reação;
• O SYBR Green I detectará todo DNA dupla-fita,
inclusive produtos de reação não específicos;
• Uma reação bem otimizada é, portanto,
essencial para resultados precisos.
Sistema Corante 
SYBR Green I
• Vantagens:
– Pode ser utilizado para monitorar a amplificação
de qualquer sequência de DNA dupla-fita;
– Não é necessário sonda, o que reduz a
configuração do ensaio e os custos de execução.
• Desvantagem:
– Pode gerar sinais falso-positivos, uma vez que a
molécula de SYBR Green I se liga a qualquer DNA
dupla-fita.
SBRY Green I
Sistema TaqMan®
• O sistema TaqMan® utiliza uma sonda
fluorescente para possibilitar a detecção de
um produto específico da PCR conforme esse
se acumula durante os ciclos da reação.
Sistema TaqMan®
Sistema TaqMan®
• Vantagens:
– É necessário a hibridização específica entre a sonda
e o alvo para gerar sinal fluorescente;
– As sondas podem ser marcadas com corantes
reporter distintos e distinguíveis, os quais permitem
a amplificação de duas sequências distintas em um
mesmo tubo de reação;
• Desvantagem:
– A necessidade de síntese de diferentes sondas para
sequências distintas.
Gráfico de Amplificação
Eficiência 
Baixa eficiência:
• Primers mal desenhados;
• Condições subótimas da reação;
Eficiência > 100%:
• Erros de pipetagem;
• Coamplificação de produtos inespecíficos.
Quantificação 
• Quantificação Absoluta:
É utilizado para quantificar amostras
desconhecidas interpolando suas quantidades a
partir de uma curva padrão.
• Quantificação Relativa:
É utilizado para analisar alterações na expressão
gênica em uma determinada amostra relativa à
outra amostra de referência (tal como uma
amostra controle não tratada).
OBS: Normalizadores: São usados para ajustar ou normalizar a
quantidade alvo obtida.
Quantificação Absoluta 
A quantificação absoluta deve ser utilizada
quando se deseja saber, por exemplo, o
número de cópias ou µg de uma amostra por
célula ou por µg de RNA total.
Quantificação Relativa 
Tecido canceroso Tecido não-canceroso
Avaliar a expressão do gene p53
Utilizar quantidades 
iguais de amostra 
Utilizar um gene de 
referência (normalizador). 
Normalizador (massa) Relação = Nível de 
expressão p53 Tecido 
Canceroso / Gene R 
Quantidades 
equivalentes de 
amostra 
Método ΔCT
𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜
𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒
𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟
= 𝐸𝐶𝑇 𝐶𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟 −𝐶𝑇(𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒)
• Escolha do calibrador;
• Resultado será liberado em relação ao calibrador;
Amostra CT para a p53
Normal (calibrador) 15
Tumor (teste) 12
𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜
𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒
𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟
= 2𝐶𝑇 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟 −𝐶𝑇(𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒
𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜(
𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒
𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟
) = 215−12
𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜
𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒
𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟
= 8
Método 2-ΔΔCT
• Escolha do calibrador;
• Eficiência de amplificação semelhante e igual
a 100% entre o gene alvo e o gene de
referência;
• Necessidade de avaliar a eficiência da
amplificação.
Método 2-ΔΔCT
Amostra CT do alvo CT do gene de ref.
Normal (calibrador) 15 16,5
Tumor (teste) 12 15,9
1. Normalizar o CT do gene alvo em relação ao gene de referência em ambas as
amostras teste e calibrador.
∆CT(normal) = 15.0 – 16.5 = –1.5
∆CT(Tumor)= 12.0 – 15.9 = –3.9
2. O ∆CT da amostra teste é normalizada com o ∆CT do calibrador.
∆∆CT = ∆CT(tumor) – ∆CT(normal)
= –3.9 – (–1.5) = –2.4
Método 2-ΔΔCT
2-ΔΔCT = 2-(-2,4)= 5.3
3. O Ratio de expressão é calculado.
Dessa forma, podemos dizer que que as células tumorais expressam
5,3 vezes mais o gene p53 do que as células normais.
Variação Alélica e detecção SNPs
Aplicações
• Avaliação da expressão gênica.
– Exemplo: Leucemia Mieloide Crônica (LMC), que
apresenta de maneira constitutiva elevada a
expressão do transcrito BCR-ABL;
• Aferição da expressão do gene BCR-ABL constitui
excelente marcador para diagnóstico e avaliação
precoce da resposta da LMC ao tratamento.
PCR Multiplex
Características Gerais
• São necessários 2 ou mais conjuntos de
iniciadores projetados para a amplificação de
diferentes alvos no mesmo tubo;
• Os iniciadores devem ter temperaturas de
anelamento semelhantes e não devem ser
complementares (evitar dímeros);
• Desvantagem: é complicado e, por vezes,
menos sensível que outros tipos de PCR;
• Vantagem: permite detectar múltiplos alvos.
PCR Multiplex
• Planejamento:
– Escolha dos primers (conhecer o alvo);
– Conhecer equipamento;
– Escolha dos corantes fluorescentes;
– Aplicação: teste de paternidade.
Aplicações da técnica da PCR
• Genotipagem:
– Identificação de genótipos.
• Detecção/identificação de organismos:
– Amplificação de um genoma específico.
• Diagnóstico
– Testes laboratoriais para identificação de doenças.
• Forense
– Baixa quantidade de qualidade de amostras de
DNA.
Aplicações da técnica da PCR
• Parte do fluxo de outras técnicas de biologia
molecular:
– Sequenciamento Sanger;
– Sequenciamento de nova geração;
– Clonagem;
– PCR em tempo real.
Referências Bibliográficas
• Lehninger: princípios de bioquímica, 4 ed., 2011.
• Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de
Reações (BSc. Daniel Perez Vieira);
• LADEIRA, PRS; ISAC, C; FERREIRA, MC. Real-time
reverse transcription polymerase chain reaction.
Rev Med (São Paulo). 2011 jan.-mar.;90(1):47-51.
• Extração de RNA Total (Departamento de
Genética, Evolução e Bioagentes da Unicamp,
2011).
Obrigado!
Todos os Minions foram criados 
a partir do mesmo DNA!
Treinando os Conhecimentos
• (Fiocruz/2006): São elementos necessários na
técnica de amplificação de DNA através de reação
da polimerase em cadeia (PCR):
a) DNA molde, DNA polimerase, primers, dNTPs e
termociclador.
b) DNA molde, Taq polimerase, primers, dNTPs e
endonucleases;
c) DNA molde, Taq polimerase, primers, dNTPs,
endonucleases e termocilador;
d) DNA molde, DNA polimerase, primers, dNTPs,
endonucleases e termocilador;
e) DNA molde, Taq polimerase, primers, dNTPs,
etanol e termociclador.
• (Fiocruz/2006): Observe as alternativas a seguir, em
relação à reação de amplificação em cadeia (PCR):
I) É uma técnica amplamente utilizada na recuperação
de sequências de DNA de fósseis com mais de 50
milhões de anos;
II) Pode-se apresentar resultados falso-positivos devido
a sua habilidade em amplificar quantidadesde DNA
extremamente pequenas;
III) Permite a detecção de agentes infecciosos mesmo
quando estes estão presentes em níveis muito baixos.
a) I está correta;
b) II e III estão corretas;
c) I e II estão corretas;
d) I e III estão corretas;
e) Todas estão corretas.
(Fundação Saúde/RJ/2014) Para a determinação
de uma amplificação gênica a partir de RNA
extraído de amostras biológicas, é necessário o
tratamento das amostras com a seguinte
enzima, a fim de converter o RNA em DNAc:
(A) DNAse reversa;
(B) RNAse direta;
(C) Transcriptase direta;
(D) Transcriptase reversa;
(E) DNA polimerase.
(Fundação Saúde/RJ/2014) A reação de PCR
baseia-se na atividade da seguinte enzima:
(A) DNA sintetase;
(B) DNA transcriptase;
(C) DNA lisosterase;
(D) DNA sintase;
(E) DNA polimerase.
(Fundação Saúde/RJ/2014) Avaliando uma
reação de PCR quantitativo, o parâmetro
conhecido como CT significa:
(A) Limiar de detecção;
(B) Centro de temperatura;
(C) Ciclo de transição;
(D) Ciclo que atinge o limiar de detecção;
(E) Ciclo de temperatura.
(Fundação Saúde/RJ/2014) Dentre os sistemas
de detecção inespecíficos para PCR quantitativo
podemos citar o:
(A)TaqMan;
(B) TaqP;
(C) SYBR-Green;
(D)SYBR-Blue;
(E) TaqPolimerase.
(Fundação Saúde/RJ/2014) Para avaliação da
carga viral através de uma análise de PCR
quantitativo, deve-se utilizar a técnica de
quantificação:
(A) absoluta;
(B) relativa;
(C) semi-absoluta;
(D) real ;
(E) total.
(Fiocruz/2010) A produção de uma molécula de
RNA, a partir de um molde de DNA, é conhecida
como:
(A)transcrição.
(B) replicação.
(C) RNA splicing.
(D) tradução.
(E) recombinação.
(Fundação Saúde/RJ/2011) A estrutura
tridimencional do DNA é conhecida como a
dupla hélice. As duas cadeias ou fitas que
formam a dupla hélice têm direções opostas e
por isso as cadeias são chamadas de
antipararalelas. Esse direcionamento é
importante para os processos in vivo como o da
replicação e da transcrição do DNA e para a
realização de uma série de reações in vitro. As
duas extremidades da cadeia de DNA são
conhecidas como:
A) 1’ e 2’ B) 2’ e 4’ C) 1’ e 3’ D) 3’ e 5’
(Fundação Saúde/RJ/2011) A técnica de reação
em cadeia pela polimerase (PCR, polymerase
chain reaction) possibilita a amplificação rápida
in vitro de um pedaço de:
A) DNA e de peptídeo;
B) DNA e de proteína;
C) peptídeo e de RNA;
D) DNA e de DNA complementar (DNAc).
(Fundação Saúde/RJ/2011) Uma molécula de
DNA foi isolada de células hepáticas e foi
constatado que a porcentagem da base Adenina
nesta molécula era de 31%. Baseado nesse
dado, as % das bases Timina, Citosina e Guanina
são, respectivamente:
(A)31%, 38% e 38%.
(B) 31%, 38% e 19%.
(C) 38%, 31% e 31%.
(D)31%, 19% e 19%.
(E) 38%, 19% e 19%.
Casos Clínicos
Caso 1
• Suponhamos que você foi contratado por uma
empresa diagnóstica para implantar e trabalhar no
laboratório de biologia molecular. Descreva os
principais equipamentos e materiais necessários para
que sejam iniciadas as atividades no setor.
a) Descreva os principais equipamentos e suas
utilidades para que seja realizada a técnica de PCR
em tempo real.
Aparelho PCR em tempo real;
Termociclador;
Nanoespectrofotômetro;
Centrífugas;
Outros.
Caso 1
• Suponhamos que você foi contratado por uma
empresa diagnóstica para implantar e trabalhar no
laboratório de biologia molecular. Descreva os
principais equipamentos e materiais necessários para
que sejam iniciadas as atividades no setor.
b) Descreva, de forma sucinta, os reagentes necessários
à execução da PCR em tempo real, bem como as suas
funções.
Primers;
Sondas;
Taq DNA polimerase;
dNTPs;
Buffer (MgCl2).
Caso 1
• Suponhamos que você foi contratado por uma
empresa diagnóstica para implantar e trabalhar no
laboratório de biologia molecular. Descreva os
principais equipamentos e materiais necessários para
que sejam iniciadas as atividades no setor.
c) Cite outros tipos de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) que poderiam ser realizadas em seu laboratório.
PCR Convencional
PCR multiplex;
RT-PCR.
Caso 2
• Paciente, sexo masculino, 40 anos, residente no
interior do Ceará, trabalhador rural no setor de
agrotóxicos, procura atendimento na sua cidade
apresentando os seguintes sinais e sintomas:
palidez, fadiga, cansaço, mal estar, falta de
apetite, perda de peso e desconforto do lado
esquerdo do abdômen. O exame físico revelou
hepatoesplenomegalia e presença manchas
hemorrágicas. Após realização de hemograma e
da fosfatase alcalina leucocitária (FAL), o mesmo
foi encaminhado para o Centro de Hematologia e
Hemoterapia do Ceará (HEMOCE).
Caso 2
a) Com base no histórico e nos parâmetros do
Hemograma, sugira, hipótese(s) diagnóstica(s).
Leucemia Mieloide Crônica.
Caso 2
b) Quais exames são necessários para a
confirmação dessa doença?
Citogenética;
FISH;
PCR convencional;
PCR em tempo real.
Caso 2
c) Qual a alteração molecular é característica
dessa doença?
Translocação 9;22 
Gene de fusão BCR-ABL
(Cromossomo Filadélfia)
Obrigado!
Todos os Minions foram criados 
a partir do mesmo DNA!