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Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Profª. Msc. Carla Sant’ Anna
 Disciplina: Biologia Molecular
Visão geral
Técnica baseada na replicação (amplificação) enzimática de sequências específicas de DNA (alvo).
Dirigida por iniciadores (primers) → delimitam a região a ser amplificada.
Aumento exponencial no número de cópias de DNA.
DNA-alvo x 2n = produto de PCR (amplicom)
Fases da PCR
Desnaturação → quebra das pontes de hidrogênio, convertendo uma molécula de fita dupla em uma de fita simples – Elevação na temp.
Hibridação (anelamento) dos iniciadores → Pareamento entre bases dos iniciadores e as sequencias específicas do DNA-alvo.
Extensão da nova cadeia de DNA → realizada por uma DNA-polimerase termoestável (Taq), sempre no sentido 5´ → 3´.
Duplicação exponencial por ciclo repetidos → alta sensibilidade.
Iniciadores previamente construídos com o auxílio de programas de bioinformática.
Diversos campos de aplicação.
Cinética da PCR
Fase inicial
Momento em que os iniciadores estão interagindo com as sequencias de DNA-molde, em busca da região complementar.
Em condições favoráveis (temperatura, concentração de Mg2+) a eficiência de hibridização é maior.
Fase intermediária
Amplificação exponencial dos produtos de PCR.
A concentração dos produtos de PCR é relativamente maior que a de DNA-alvo.
Fase tardia ou fase de platô
Saturação do sistema de amplificação.
O acúmulo dos produtos de PCR causa diminuição na eficiência da amplificação. 
Preparo da reação
Componentes (reagentes) essenciais:
DNA-molde
Oligonucleotídeos (iniciadores)
DNA polimerase termoestável (Taq)
Desoxirribonucleotídeos (dNTPs)
Íons de magnésio
Tampão de reação
DNA-molde
Ácido nucleico a ser avaliado por meio da PCR.
Sangue, urina, amostra de tecidos, cultura de células, etc.
Quanto maior o número de moléculas de DNA-alvo, maior a probabilidade de uma amplificação bem sucedida → entre 50ng e 1,0μg.
Impurezas devem ser eliminadas para evitar resultados falso-negativos.
Oligonucleotídeos iniciadores (primers)
 Sequencias de nucleotídeos em fita simples (sense e antisense ou foward e reverse).
Apresentam complementariedade aos segmentos que flanqueiam a região a ser amplificada.
Sequencias de iniciadores construídas com o uso de programas de computador.
DNA polimerase
 Adicionam desoxirribonucleotídeos à extremidade 3´ de um filamento de DNA, promovendo a extensão desse filamento.
A eficiência da enzima depende da capacidade de processamento e da taxa de síntese.
Desoxirribonucleotídeos (dNTPs)
Nucleotídeos incorporados pela DNA-polimerase durante a PCR.
Concentração entre 20 e 200 μM → reduz os pareamentos errados.
dATP, dTTP, dGTP e dCTP.
Íons Magnésio
 Influencia a hibridação dos iniciadores à sequencia-alvo;
 a Tm (Temperatura média de anelamento)
 a atividade e a fidelidade de incorporação dos dNTPs;
Ativa a DNA-polimerase.
 Tampão de reação
 Mais recomendado → Tris-HCl
Ajusta o pH da solução
Facilita a hibridação dos iniciadores.
Estabiliza a DNA-polimerase
Condições do ensaio de PCR
Realizada em ciclos repetidos de temperaturas variáveis → Termociclador.
Temperatura adequada → garante a correta ligação dos iniciadores às sequencias-alvo e as condições ótimas para a desnaturação e extensão do DNA.
Desnaturação
Geralmente realizada durante 3 a 5 minutos antes do primeiro ciclo, com temperaturas entre 94◦C e 95◦C.
Nos demais ciclos a temperatura é mantida, porém com o tempo de 30 a 60 segundos.
Seleção da temperatura e tempo dependem da quantidade de G e C da sequencia alvo.
Temperaturas baixas → desnaturação incompleta.
Temperaturas altas → perda de atividade enzimática da DNA-polimerase.
Hibridação
Interação de iniciadores com as sequencias-alvo.
Utilização de temperaturas adequadas obtidas a partir das sequencias de iniciadores.
Extensão
O tempo de extensão depende do tamanho e número de cópias do DNA-alvo.
Temp. mais utilizada → 72◦C (atividade máxima da Taq polimerase).
 Número de ciclos
Afeta tanto a sensibilidade como a especificidade da PCR.
Para baixo número de cópias de DNA-alvo, é preciso utilizar maior número de ciclos.
Muitos ciclos favorecem a geração de produtos inespecíficos.
Número máximo geralmente inferior a 40.
Contaminação
Moléculas não desejadas junto à molécula-molde.
Mecanismos de controle da contaminação → áreas isoladas para preparo de amostras e reagentes e para análise de resultados, agentes físicos e químicos para esterilização.
Realização de controle negativo.
Bibliografia 
Rozangela Verlengia, et al. Análises de RNA, proteínas e metabólitos: metodologias e procedimentos técnicos. São Paulo, 2013.
https://www.youtube.com/watch?v=5YlfZwzRPa4
http://phoneutria.com.br/site2/calibrando-uma-pcr/
A PCR (reação em cadeia da polimerase) requer todos os componentes seguintes, EXCETO:
A-Iniciadores.
B-DNA ligase.
C-DNA polimerase.
D-Desoxirribonucleotídeos.
Em relação a técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase), a primeira etapa do procedimento é:
A-Amplificação.
B-Dissociação.
C-Desnaturação.
D-Anelamento.
Uma importante técnica de biologia molecular, por meio de etapas de variação de temperatura, possibilita a duplicação de cadeias de DNA in vitro, através do emprego dos quatro nucleotídeos (dNTP’s) do DNA, sequências iniciadoras (primers) e uma DNA polimerase termoestável. Esta técnica é denominada
A-Western Blotting.
B-PCR.
CELISA.
D-Southern Blotting.
E-Imuno-histoquímica.
Qual afirmação descreve com precisão o processo de PCR?
A - Os produtos de PCR são inibidores da reação em cadeia da polimerase.
B - A reação de PCR requer um tipo especial de enzima de restrição.
C -É necessário um par de primers para a amplificação de um fragmento de DNA.
D -O peso molecular do fragmento de DNA não é diagnóstico de especificidade de um PCR.
E  - A reação de PCR amplifica geometricamente um fragmento de DNA.
ENEM 2017
A reação em cadeia da polimerase (PCR, na sigla em inglês) é uma técnica de biologia molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma rápida. Essa técnica surgiu na decada de 1980 e permitiu avanços científicos em todas as áreas de investigação genômica. A dupla hélice é estabilizada por ligações hidrogênio, duas entre as bases adenina (A) e timina (T) e três entre as bases guanina (G) e citosina (C). Inicialmente, para que o DNA possa ser replicado, a dupla hélice precisa ser totalmente desnaturada (desenrolada) pelo aumento da temperatura, quando são desfeitas as ligações hidrogênio entre as diferentes bases nitrogenadas.
Qual dos segmentos de DNA será o primeiro a desnaturar totalmente durante o aumento da temperatura na reaçao de PCR?
 
https://www.youtube.com/watch?v=ek8oGXZ4RLQ
https://www.youtube.com/watch?v=q1QFpB33Bwg