Expressão gênica

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Expressão	
  gênica	
  -­‐	
  Parte	
  I:	
  
	
  
PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  
Renata	
  Sindeaux	
  
O	
  que	
  faz	
  com	
  que	
  as	
  
células	
  se	
  tornem	
  
diferentes	
  umas	
  das	
  
outras?	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
•  Células	
  de	
  um	
  mesmo	
  organismo	
  =	
  Mesmo	
  DNA	
  
genômico	
  
•  IdenCdades	
  celulares	
  disCntas	
  
•  Diferenças	
  na	
  expressão	
  gênica	
  
•  Transcrição	
  e	
  Tradução	
  
•  Transcrição	
  ou	
  não	
  de	
  um	
  gene	
  =	
  Determinada	
  pela	
  
presença	
  ouausência	
  de	
  outros	
  produtos	
  gênicos.	
  
Genes	
  interagem	
  em	
  redes	
  complexas:	
  
•  Gene	
  A	
  aCva	
  gene	
  B	
  
•  Gene	
  B	
  desliga	
  gene	
  C	
  
•  Gene	
  C	
  aumenta	
  expressão	
  do	
  gene	
  A	
  
•  Perturbações	
  em	
  um	
  único	
  gene	
  =	
  Mudança	
  
no	
  nível	
  de	
  expressão	
  de	
  diversos	
  genes.	
  
	
  
	
  Para	
  que	
  estudar	
  Expressão	
  Gênica	
  ?	
  
•  As	
  células	
  e	
  tecidos	
  têm	
  suas	
  funções	
  
normais	
  quando	
  os	
  genes	
  são	
  expressos	
  
de	
  forma	
  regulada;	
  
•  A	
  expressão	
  alterada	
  de	
  um	
  gene	
  altera	
  a	
  
homeostase	
  do	
  organismo,	
  podendo	
  gerar	
  
uma	
  doença.	
  
	
  Feita	
  de	
  modo	
  compara7vo	
  –	
  exemplos:	
  
	
  
•  Expressão	
  do	
  conjunto	
  de	
  genes	
  expressos	
  em	
  
um	
  tecido	
  tumoral	
  versus	
  os	
  genes	
  
encontrados	
  em	
  amostras	
  controle	
  de	
  tecido	
  
normal.	
  
•  Traçar	
  o	
  perfil	
  de	
  expressão	
  gênica	
  em	
  uma	
  
determinada	
  condição	
  
	
  
Análise	
  de	
  expressão	
  gênica	
  
O	
  que	
  é	
  PCR	
  em	
  tempo	
  real?	
  
•  É	
  a	
  reação	
  de	
  amplificação	
  em	
  tempo	
  real,	
  
uma	
  variante	
  da	
  reação	
  de	
  PCR	
  convencional,	
  
representando	
  grande	
  avanço	
  nos	
  métodos	
  
moleculares	
  de	
  auxílio	
  diagnósCco,	
  
parCcularmente	
  por	
  facilitar	
  sobremaneira	
  as	
  
tarefas	
  de	
  quanCficação	
  da	
  expressão	
  gênica	
  
em	
  determinado	
  tecido	
  ou	
  amostra	
  biológica.	
  
•  RNA	
  	
  
O	
  que	
  é	
  PCR	
  em	
  tempo	
  real?	
  
•  Termociclador	
  acoplado	
  a	
  um	
  sistema	
  de	
  
detecção	
  e	
  quanCficação	
  de	
  um	
  sinal	
  
fluorescente	
  
PCR	
  convencional	
  x	
  PCR	
  em	
  tempo	
  
real	
   Limitações:	
  -­‐	
  Discriminação	
  baseada	
  
no	
  tamanho	
  do	
  
fragmento	
  
-­‐	
  Resultados	
  não	
  são	
  
expressos	
  em	
  números	
  
Fases	
  da	
  reação	
  de	
  PCR	
  
Detecção	
  –	
  PCR	
  
convencional	
  
Detecção	
  –	
  	
  
RT-­‐	
  PCR	
  
Threshold	
  
Ct=	
  é	
  o	
  ciclo	
  aonde	
  um	
  aumento	
  significa7vo	
  na	
  
quan7dade	
  de	
  amplificado	
  é	
  primeiramente	
  detectado.	
  	
  
Sistema	
  PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  por	
  
sondas	
  Taqman	
  
	
  Sonda	
  complementar	
  a	
  seqüência	
  alvo	
  
conjugada	
  com:	
  
•  Fluorocromo	
  “reporter”	
  	
  emite	
  fluorescência	
  
•  Fluorocromo	
  “quencher”	
  	
  absorve	
  
fluorescência	
  da	
  sonda	
  intacta	
  
a sonda 
as sondas 
Análise	
  e	
  Aplicações	
  
•  Análise	
  de	
  expressão	
  gênica:	
  
	
  -­‐	
  QuanCficação	
  relaCva	
  
	
  -­‐	
  QuanCficação	
  absoluta	
  	
  
QuanCficação	
  relaCva	
  
•  Método	
  comparaCvo	
  do	
  nível	
  inicial	
  do	
  cDNA	
  
em	
  relação	
  a	
  um	
  padrão	
  
•  O	
  padrão	
  pode	
  ser	
  um	
  gene	
  consCtucional	
  do	
  
tecido	
  analisado	
  ou	
  um	
  “housekeeping”	
  gene	
  
•  GAPDH,	
  β	
  acCna,	
  e	
  etc.	
  
•  Ex:	
  Estudos	
  de	
  expressão	
  de	
  um	
  RNA	
  alvo.	
  
QuanCficação	
  absoluta	
  
•  Determina	
  a	
  quanCdade	
  absoluta	
  da	
  
seqüência	
  alvo	
  de	
  uma	
  amostra	
  
•  Necessita	
  de	
  uma	
  curva	
  padrão	
  
•  Ex:	
  QuanCficação	
  de	
  carga	
  viral	
  
Exemplo	
  de	
  aplicação	
  
	
  
DiagnósCco	
  e	
  acompanhamento	
  da	
  
Leucemia	
  Mielóide	
  Crônica	
  (LMC)	
  
	
  
Cromossomo	
  Ph	
  (9q34;22q11)	
  
	
  
	
  
	
  
•  A	
  LMC	
  apresenta	
  de	
  maneira	
  consCtuCvamente	
  
elevada	
  a	
  expressão	
  do	
  transcrito	
  BCR-­‐ABL.	
  
Esse	
  gene	
  quimérico,	
  produto	
  da	
  fusão	
  dos	
  
genes	
  BCR	
  e	
  ABL,	
  pode	
  não	
  apenas	
  ser	
  
detectado,	
  firmando	
  o	
  diagnósCco	
  da	
  doença	
  
mieloproliferaCva,	
  mas	
  ter	
  seu	
  nível	
  de	
  
expressão	
  aferido	
  ao	
  longo	
  de	
  determinada	
  
intervenção	
  terapêuCca.	
  
Curva-­‐padrão	
  de	
  amplificação	
  para	
  cálculo	
  do	
  número	
  absoluto	
  
de	
  moléculas	
  de	
  BCR-­‐ABL	
  presente	
  na	
  amostra	
  testada.	
  
Vantagens	
  da	
  PCR	
  em	
  tempo	
  real	
  
•  Permite avaliação da eficiência de 
amplificação 
•  Maior sensibilidade, precisão e 
reprodutibilidade 
•  Velocidade na análise 
•  Elimina contaminação