RESUMO BIOLOGIA MOLECULAR

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RESUMO P2 BIOLOGIA MOLECULAR 
A PCR E SUAS APLICAÇÕES
· PCR Reação de polimerização em cadeia do DNA
· Consiste em fazer cópias de DNA “in vitro” utilizando elementos básicos do processo de replicação natural do DNA 
· Como uma PCR é possível?
- In vivo – complexo enzimático promove abertura das fitas de DNA
- In vitro – abertura das fitas de DNA (temperatura)
· A PCR requer 6 componentes essenciais 
1- Molde de DNA a ser amplificado
2- Solução tampão = solução que permite o balanço do pH da solução para que este não se altere durante a reação, prejudicando-a
3- Taq DNA polimerase = responsável pela sintese de novas fitas de DNA complementares usando uma cadeia precursora como molde 
4- Primers = um par de oligonucleotídeos para iniciar a sintese de DNA (primers iniciadores senso e antisenso)
5- dNTPs = “matéria prima” para a sintese das novas cadeias. 
6- Mg+2 = cofator da Taq DNA polimerase 
· Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR
· A localização da sequencia alvo é feita pelos iniciadores (primers). 
· O pareamento dos “primers” com a sequencia alvo no molde se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, obedecendo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick (A-T e C-G)
· A PCR é uma reação realizada em 3 passos básicos 
1) Desnaturação do DNA molde por aquecimento
2) Pareamento dos iniciadores à sequencia de DNA alvo (fita simples)
3) Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável (Taq polimerase)
· A PCR representa atualmente um método de rotina para isolar rapidamente sequencias especificas de DNA a partir de uma mistura complexa de sequencias genômicas ou cDNAs 
· Primers degenerados a partir da sequência de aminoácidos da proteina 
· Aplicações do PCR detecção de patógenos, ciência forense, paleontologia, epidemiologia, banco de sangue, testes de paternidade
ELETROFORESE CONVENCIONAL
· Técnica que permite separar amostras de moléculas carregadas eletricamente, através de uma diferença de potencial
· Os fragmentos migram inversamente proporcional ao seu tamanho
· PCR/ELETROFORESE é preciso tomar certos cuidados: separar a área de manipulação do DNA da área de preparo do mix de PCR; manter bancadas sempre limpas; técnicas de desenho de iniciadores; verificar ciclagem; verificar as condições dos reagentes; verificar os componentes tampão; esterilização; controles + e -; 
PCR E DNA FINGERPRINT
· “DNA fingerprint” – perfil individualizado de DNA
· 2 regiões alvos (microssatélites)
a- Regiões STR – repetições compreendendo de 2 a 7 pares de bases
b- Regiões de VNTR – repetições compreendendo de 10 a 100 pares de bases
· O número de sequencias repetidas é altamente variável entre os indivíduos e distribuídas de maneira aleatória no genoma 
· Utilizado também para realizar testes de paternidade; ciência forense; banco de sangue para detectar certas doenças que podem estar presentes no sangue; detecção de patógenos; diagnostico pré-natal para verificar diferentes anomalias no feto; 
RT PCR
· Técnica utilizada para amplificar sequencias que codificam um gene expresso no RNA total
· Para isso realizamos a sintese do DNA complementar (cDNA), pois o DNA não pode ser usado diretamente na PCR
· cDNA é uma cópia de fita simples de uma sequencia de RNA sintetizada pela enzima transcriptase reversa (RT)
· Com o cDNA em mãos podemos fazer o PCR com primers específicos do gene de interesse
· Aplicações do RT PCR – analise da expressão de um gene especifico 
PCR EM TEMPO REAL (qPCR)
· A PCR em tempo real monitora a fluorescência emitida durante a reação de amplificação como um indicador da produção de amplificado em cada ciclo de PCR 
· Princípios do Real-time baseado na detecção e quantificação de uma molécula fluorescente repórter; o 1° aumento significativo na quantidade de amplificado de PCR correlaciona-se com a quantidade inicial de amostra alvo usada como molde
· PCR tradicional X PCR em tempo real
- Os produtos de PCR têm que ser visualizados em gel de agarose
- Esses correspondem aos produtos finais obtidos na fase final da reação de PCR (plateau – saturação)
- Em condições de saturação não é possível quantificar 
· Plot de amplificação do PCR em tempo real
- Detecção da fluorescência associada à amplificação do DNA a cada ciclo de PCR 
- Não há necessidade do uso de eletroforese para verificar os produtos amplificados
- Acompanhamento da cinética de amplificação (fluorescência) é feito via computador 
· Princípios do Real-time 3 métodos de ensaios quantitativos: Sondas hidrolisáveis, sondas hibridizáveis e agentes ligantes ao DNA
· Aplicações do Real-time quantificação de expressão gênica; controle de qualidade e validação de ensaio; biossegurança e estabilidade do material genômico; quantificação viral; detecção de patógenos; detecção de inativação de cromossomos X; estudos de DNA mitocondrial; ensaios de exposição a radiação; genotipagem (discriminação de alelos)
SEQUENCIAMENTO DO DNA 
· Método enzimático Sanger, 1970
· Método dos dideoxinucleotídeos a posição das bases é determinada pelo tamanho dos fragmentos obtidos através de reações de polimerização na presença de dideoxinucleotídeos 
· Marcação com fluorescência (automatização) – marcação do DNA usando PCR 
1- Dideoxinucleotídeos marcados + dideoxinucleotídeos normais (dNTPs)
2- DNA polimerase I ao invés da Taq
3- Utiliza primer único
4- Amplificação por PCR é linear
ANÁLISES MOLECULARES (SOUTHERN BLOT – DNA, NORTHERN BLOT – RNA, WESTERN BLOT – PROTEINAS)
· BLOT = processo de transferência de ácidos nucleicos (DNA ou RNA) para um suporte sólido (membrana de nylon) e hibridização com sonda marcada para detecção do homólogo em uma mistura complexa (EX. DNA genômico do organismo ou amostras de RNA total)
· Triagem de biblioteca de DNA hibridização com sonda é feita em membrana correspondente aos clones presentes na placa; não há separação do DNA por tamanho (eletroforese)
· BLOTS
a- SOUTHERN usa DNA como substrato e sonda de DNA (análise da presença de um gene)
b- NORTHERN usa RNA total ou mRNA como substrato e sonda de DNA ou RNA (análise da expressão gênica)
c- WESTERN usa proteinas como substrato e anticorpos como sonda (detecção da proteina expressa)
· Material transferido em cada técnica é o mesmo que é utilizado para faze-la
· Transferência para membrana se dá por capilaridade – gel de agarose com DNA/RNA
· SONDAS = ácido nucleico responsável pela detecção da sequencia alvo usada no processo de hibridização
· Southern blot (DNA)
1- Digerir DNA em pequenos fragmentos
2- Separar os fragmentos em gel de eletroforese
3- Mergulhar o gel em um meio alcalino para separar (desnaturar) o DNA
4- Colocar o gel em um filtro de nitrocelulose aonde o DNA vai se mover para filtrar por ação dos capilares
5- Adicionar sonda de ssDNA radioativa que vai hibridizar as sequencias de interesse 
6- Lavar após retirar a sonda
7- Fazer um auto radiograma e estudar os resultados
· Detecção de genes expressos
- Análise da expressão de um único gene de cada vez = Northern blot; RT-PCR (PCR precedido de transcrição reversa)
- Análise da expressão de milhares de genes simultaneamente = macroarranjos de DNA e microarranjos de DNA
· Microarranjos de DNA arranjo ordenado de fragmentos de DNA imobilizados em uma superfície sólida porosa ou não porosa; cada “ponto” neste arranjo corresponde a um gene especifico. É possível fabricar microarranjos com milhares de ”pontos” em alta densidade
ELETROFORESE DE PROTEINAS (SDS-PAGE)
· SDS desnatura a proteina e fornece carga negativa 
· Aparato de eletroforese de proteinas (fonte de tensão de cargas e uma unidade de eletroforese)
· Abaixo é descrito o mecanismo da eletroforese.
1- A amostra contendo as macromoléculas devidamente desnaturadas e reduzidas, é distribuída ao nos poços ou cavidades do gel de suporte;
2- Após a distribuição o equipamento é fechado e o campo elétrico é aplicado no gel, através de um dispositivo diferencial de energia elétrica e as macromoléculas vão sendo distribuídas pela extensão do gel esão separadas em função de sua massa e tamanho molecular que são os principais fatores que determinam a mobilidade eletroforética.
· Bloqueando a membrana tem a finalidade de bloquear sítios inespecíficos presentes na membrana, evitando a interação inespecífica com o anticorpo 
· Detecção do antígeno usando anticorpo policlonal ou monoclonal reação com anticorpo primário (IgG especifico) ou reação com anticorpo secundário (anti-IgG) – exemplo detecção de HIV
MARCADORES MOLECULARES E APLICAÇÕES
MARCADORES
· Pontos de referencia no genoma; corresponde a um segmento de DNA especifico (expresso ou não)
· A sequência e a função dos mesmos são, em geral, desconhecidos
· Para ser considerado marcador genético: comportamento de acordo com as leis básicas de herança mendeliana 
· Marcadores morfológicos
1- Número limitado
2- São em geral, dominantes ou recessivos
3- Apresentam baixo nível de polimorfismo
4- São identificáveis tardiamente
5- Sensíveis aos efeitos do fenótipo
6- Requer grande numero de cruzamentos 
· MARCADORES MOLECULARES: Biologia molecular viabilizou a diversificação dos métodos permitindo a detecção do polimorfismo diretamente no DNA – nova classe de marcadores moleculares (MM)
- MM podem per baseados ou não no uso do PCR 
- Consequência: um número maior de marcadores altamente polimórficos pode ser obtido em qualquer organismo 
· Marcadores moleculares 
1- Numero limitado
2- Cruzamentos controlados específicos
3- São co-dominantes
4- Informação/locus é alta
5- São identificáveis nas fases iniciais do desenvolvimento
6- Insensíveis aos efeitos do fenótipo – efeito epistático e pleiotrópico 
· Marcadores moleculares não baseados em PCR (isoenzimas, RFLP e minissatélites) e baseados em PCR (RAPD, microssatélites e AFLP)
ISOENZIMAS
· Compreende um grupo de múltiplas formas moleculares da mesma enzima em uma mesma espécie, como resultado da presença de mais de um gene codificador
· Diferem quanto a mobilidade eletroforética a qual refletem diferenças no DNA que as codificam
· Incluem todos os polipeptideos codificados em diferentes lóci ou por alelos diferentes presentes no mesmo lócus (aloenzimas)
· Diferenças nas sequencias de aminoácidos influenciam a estrutura e a carga da proteina 
· Diferenças de mobilidade das isoenzimas no campo elétrico (padrão de bandas) reflete diferenças no DNA codificador 
· Não requer informação genômica
· Co-dominantes (produto dos dois alelos são expressos e visualizados)
· Passos para a execução: 
- Extração das proteinas do tecido alvo
- Separação em gel de eletroforese 
- Visualização atração de reação histoquímica 
· Vantagens = barata e acessível; analise simultânea de vários locus; co-dominancia
· Limitações = diminuição do numero de sistemas isoenzimaticos polimórficos; especificidade de formas em tecidos ou estágios de desenvolvimento; influencia ambiental; dificuldades na interpretação
RFLP
· Variações na sequência de DNA são retratadas pela presença/ausência de sítio de clivagem de determinada enzima de restrição.
· O polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA é uma enzima de restrição, seguido de eletroforese para separação dos fragmentos. Requer hibridização com sonda marcada.
· Observação de fenômenos genéticos como deleções, inserções, ou outros rearranjos no DNA, é viável.
· Marcadores RFLP são em geral codominantes, isto é, permitem a identificação de alelos maternais e paternais em indivíduos heterozigotos
· Base genética = mutação destrói um sitio de restrição e provoca em RFLP
· Execução
- Extração de DNA genômico
- Digestão com enzimas de restrição
- Eletroforese: inúmeros fragmentos arraste contínuo
- Southern blot: Transferência para membrana; Hibridização com sondas radioativas; Autoradiografia bandas marcadores 
· Sondas para RPFL obtenção de sondas por bibliotecas de cDNAs, bibliotecas genômicas e PCR com oligoespecificos; cada sonda detecta um locus e tem que se evitar sequencias repetidas
· Bastante empregados no melhoramento de plantas 
· Mapeamento comparativo = bandas na mesma posição são sequencias homólogas, pois ambas são identificadas pela sonda 
· Vantagens = alta cobertura do genoma; co-dominancia; alta associação com genes de interesse; alto nível de polimorfismo
· Limitações = obtenção de sondas; pessoal técnico capacitado; requer uso de radioatividade
MINISATÉLITES
· Unidade de repetição tem de 15 a 100 pb; um lócus hipervariável é composto por um n° variável de unidades de repetição dispostas lado a lado
· Diferentes lóci possuem nueros de repetições diferentes
· Agrupadas no genoma formando sítios altamente variáveis – diferentes famílias
· Base genética mesmo principio do RPFL; restrição em sítios que flanqueiam o VNTR; sondas VNTR (homologas à sequencia da unidade repetida gera perfil complexo de bandas)
· Usado no melhoramento de plantas
· Sua distribuição peculiar dificulta o uso em mapeamento 
· Vantagens = mesmas do RPFL; amostragem simultânea de varias regiões do genoma; fingerprint (cada indivíduo possui um padrão diferente)
· Limitações = padrão complexo 
RAPD
· Baseia-se na utilização de primers aleatórios na reação de PCR, possibilitando amplificações ao acaso de segmentos de DNA no genoma 
· São tipicamente dominantes (presença ou ausência de banda), isto é, nao há distinção entre o padrão eletroforético de indivíduos heterozigóticos e homozigotos 
· Diferenças em relação a PCR comum:
- Primer único, curto, de sequência aleatória
- Cada primer dirige a sintese de vários segmentos de DNA simultaneamente sítios de iniciação
· Polimorfismo binário – banda presente/ausente
· Locus distribuídos ao longo do genoma 
· Permitiu a realização de estudos genéticos nos mais diversos organismos 
- Fingerprint genômicos
- Analise de estrutura e diversidade populacional
- Relações filogenéticas
- Mapas de alta cobertura/localização de genes 
· Vantagens = baseada na amplificação do DNA; polimorfismo detectado no gel; não precisa da biblioteca de sondas; quantidade menor de DNA; baixo custo;
· Limitações = menor conteúdo informação genético/loco (só um alelo detectado); dominância; dificuldade/ambiguidade na analise de bandas; dificuldade de padronização
MICROSATÉLITES – SSR
· Pequenas repetições em tandem, altamente polimórficas e distribuídas pelo genoma; observadas em vários organismos
· Base genética 
- PCR usando primers complementares à região que flanqueia o microssatélite
- Região repetitiva (polimorfismo): número de unidades repetidas
- Diferentes números de repetições: diferentes alelos daquele loco (multialelismo)
- Detecção: eletroforese (poliacrilamida) e sequenciador (primers fluorescentes)
· Primers de PCR reconhecem sequências de DNA de cópia única que flanqueiam o microsatelite; diferentes fragmentos são detectados.
· Vantagens = co-dominancia; multialelismo; maior polimorfismo; completa cobertura do genoma; espécies relacionadas (sítios conservados) e mapeamento, identificação de genótipos
· Limitações = desenvolvimento prévio de primers específicos; equipamentos sofisticados; elevado custo
AFLP
· Associação entre RFLP e RAPD. O DNA é digerido com 2 tipos de endonucleases; a seguir ligam-se adaptadores às sequencias do sitio de restrição e, efetua-se a PCR com primers complementares aos adaptadores
· Enzima de restrição: especificidade, resolução e poder de amostragem
· DNA clivado com duas enzimas de restrição (1 rara e 1 frequente)
· Adaptadores são ligados aos terminais dos fragmentos digeridos
· Somente parte dos fragmentos é amplificada; esses fragmentos são separados em gel de alta resolução
· Dominante como o RAPD, mas as bandas dos heterozigotos possuem metade da intensidade dos homozigotos
· Um dos grandes tributos dessa técnica é sua capacidade multiplex = grande numero de loci pode ser amostrado em um único gel AFLP
· Vantagens = grande número de fragmentos e marcadores analisados por gel; eficiente na amostragem ampla e simultânea de um genoma; maior detecção e variabilidade; primers mais longos (especificidade na amplificação)
· Limitações = menor informação genéticapor loco: só um alelo é detectado; marcador dominante anônimo; requer DNA muito puro; muitos reagentes e etapas; mais cara que o RAPD