1 aula pratica Conceitos basicos em espectrofotometria

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA II
Maria Goretti Rodrigues de Queiroz
Thamires Maria Fontenele Morais
Conceitos básico em 
espectrofotometria
Thamires Maria Fontenele Morais
Fortaleza, Ce
2015
Espectrofotometria
Baseia-se na quantificação da luz
radiante absorvida ou transmitida
em condições controladasem condições controladas
Método de análise ótico mais
utilizado nas investigações
bioquímicas e físico-químicas
Espectrofotometria
Luz incidente = Io Luz trasmitida = I
Transmitância (T)
Io 100 %
I T %
T %= I x 100/Io
Espectrofotometria
Luz incidente = Io Luz trasmitida = I
Absorbância (A)
A = 2 – logT%
Lei de Beer-Lambert
Luz incidente = Io Luz trasmitida = I Luz incidente = Io Luz trasmitida = I
“A concentração de uma substância é 
diretamente proporcional a quantidade de luz 
absorvida (A) ou inversamente proporcional ao 
logaritmo da luz transmitida (T)”
Lei de Beer-Lambert
A = a x b x c 
ONDE:
A = absorbância
a = absortividade*
b = percurso da luz na solução
c = concentração do composto
A absortividade molar (e) é uma grandeza
característica da espécie absorvente, cuja
magnitude depende do comprimento de onda
da radiação incidente
LABORATÓRIO CLÍNICO
SUBSTÂNCIAS PESQUISADAS NO LABORATÓRIO CLÍNICO?
GLICOSE
AST
ALT
UREIA
GGT
LABORATÓRIO CLÍNICO
B C AB C A
B = REAGENTE
C = AMOSTRA DO PACIENTE
A = SUBSTÂNCIA A SER MEDIDA
LABORATÓRIO CLÍNICO
Espectrofotômetro
Espectrofotômetro
Tipo de Leitura
Utiliza apenas um 
comprimento de 
onda na 
Utiliza apenas um 
comprimento de 
onda na 
Monocromática
Utiliza dois 
comprimentos de 
onda na 
Utiliza dois 
comprimentos de 
onda na 
Bicromática
onda na 
determinação da 
absorbância
onda na 
determinação da 
absorbância
onda na 
determinação da 
absorbância
onda na 
determinação da 
absorbância
Minimizar a ação 
de interferentes 
Minimizar a ação 
de interferentes 
Espectrofotômetro
Lei de Beer-Lambert
CONDIÇÕES!!!
Radiação 
monocromática
Absorção 
insignificante pelo 
solvente
B A
CUBETA DE REAÇÃO 
FINAL
monocromática
solvente
A concentração do 
soluto está dentro 
dos limites
Interferência ótica 
não esteja 
presente
Não ocorrer 
interação soluto x 
outro soluto x 
solvente 
A
B A
LABORATÓRIO CLÍNICO
LABORATÓRIO CLÍNICO
Quem?
• Substância a ser pesquisada: glicose• Substância a ser pesquisada: glicose
Como?
• Através da medida fotométrica do produto NADPH 
em comprimento de onda específico
• Através da medida fotométrica do produto NADPH 
em comprimento de onda específico
Resultado
• Quando mais NADPH formado maior será a
absorbância e maior será a concentração da glicose
• Quando mais NADPH formado maior será a
absorbância e maior será a concentração da glicose
Que concentração é essa?
LABORATÓRIO CLÍNICO
SOLUÇÃO PADRÃO OU CALIBRADOR
CONCENTRAÇÃO CONHECIDA
LABORATÓRIO CLÍNICO
A calibrador Cc 
A amostra CaA amostra Ca
Ca = Conc. Calibrador x A amostra
A calibrador
ONDE:
A = absorbância
Cc = concentração calibrador
Ca = concentração amostra
mg/dL
Ca
Padrão x Calibrador
Matriz não 
proteica
Matriz não 
proteica
Padrão
Matriz proteicaMatriz proteica
Calibrador
proteicaproteica
Características 
físico-químicas 
diferentes do 
soro humano
Características 
físico-químicas 
diferentes do 
soro humano
Matriz proteicaMatriz proteica
Características 
físico-químicas 
mais próximas 
do soro humano
Características 
físico-químicas 
mais próximas 
do soro humano
LABORATÓRIO CLÍNICO
BRANCO DA REAÇÃO
Solvente 
Elimina 
interferência Solvente interferência 
da cubeta
Elimina 
interferência 
do solvente
Elimina 
interferência 
de impurezas
Absorbância 
será 
descontada
LABORATÓRIO CLÍNICO
Abs
branco
Abs
amostra
Abs
amostra
Recapitulando!!!
O que é necessário para determinação dos 
parâmetros bioquímicos?
SÓ MAIS UM CONCEITO!!!
Linearidade
mg/dL
Linearidade é a habilidade de um método analítico em
produzir resultados que sejam diretamente proporcionais
à concentração do analito em amostras, em uma dada
faixa de concentração.
Linearidade
Reações de ponto final
�Reações que formam produtos cuja concentração chega 
ao máximo permanecendo estável por um certo tempo
�A quantidade de produto formado reflete a reação de 
todo o analito contido na amostra 
Reação cinética contínua
�Reações que utilizam reações contínuas da formação do 
produto.
�Utiliza-se o cálculo da diferença de absorbância obtida 
por minuto. 
Reação cinética de tempo fixo
Após completar o intervalo cinético estabelecido, a reação 
é interrompida e o produto formado é medido
OBRIGADA!OBRIGADA!
Referências Bibliográficas
• Burtis, C.A., Ashwood, E. R., Bruns, D.E. Tietz
Fundamentos de Química Clínica. Editora
Elsevier, 6º edição, 2008.
• Motta, V. T. Bioquímica Clínica para o
Laboratório - Princípios e Interpretações.
Editora MedBook, 5° edição, 2009.