técnicas laboratoriais

Prévia do material em texto

@KAUANYBIOMED_
Técnicas
laboratoriais
BIOTECNOLOGIA
utilizada em bioquímica e 
biologia molecular
Medicamentos,
vitaminas, proteínas
e muito mais!
Amplamente utilizada em bioquímica e biologia molecular para
detectar proteínas específicas em uma amostra.
 Vamos explicar de forma simples e prática como ele funciona,
passo a passo:
1. Preparação da amostra
O processo começa com a extração de proteínas de uma célula ou
tecido. Você pode obter uma solução com um conjunto de
proteínas presentes na amostra que está sendo estudada.
O Western blot é uma
técnica laboratorial 
@KAUANYBIOMED_
2. Separação das proteínas por eletroforese
As proteínas extraídas são separadas com base no tamanho e
carga através de uma técnica chamada eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE).
No gel, as proteínas são aplicadas em um compartimento e uma
corrente elétrica é aplicada. As proteínas carregadas se movem
para o lado oposto da carga elétrica. As proteínas menores se
movem mais rapidamente, enquanto as maiores se movem mais
devagar, resultando em uma separação.
3. Transferência das proteínas para uma membrana
Após a separação, as proteínas no gel são transferidas para uma
membrana de nitrocelulose ou PVDF. Essa transferência é feita
usando um processo chamado blotting (por isso o nome "Western
blot").
Essa membrana é como um "papel" que mantém a informação das
proteínas separadas no gel, mas agora de uma forma mais fácil de
trabalhar para a detecção.
FASES DO Western blot 
@KAUANYBIOMED_
6. Detecção
Após a incubação com os anticorpos, a membrana é
tratada com um substrato químico que reage com a
enzima ligada ao anticorpo secundário. Isso cria um sinal
visível, geralmente na forma de uma mancha ou banda
no local onde a proteína de interesse está presente.
O sinal gerado pode ser visualizado por
quimioluminescência (que emite luz) ou por corantes
coloridos, dependendo do tipo de substrato usado.
7. Análise
O resultado é analisado comparando o tamanho
da banda (que indica o tamanho da proteína) com
um controle de tamanho molecular 
(uma marca de peso molecular ou "marcador de
peso molecular").
Também é possível quantificar a intensidade das
bandas para determinar a quantidade relativa da
proteína de interesse na amostra.
4. Bloqueio da membrana
Antes de realizar a detecção das proteínas
de interesse, a membrana precisa ser
bloqueada com uma solução de bloqueio,
como leite em pó ou albumina sérica
bovina (BSA), para evitar que anticorpos
não específicos se liguem a locais que não
sejam a proteína de interesse.
5. Incubação com anticorpos
Agora, o que define a técnica é o uso de anticorpos
específicos para a proteína que se quer detectar. São
utilizados dois tipos de anticorpos:
Anticorpo primário: é o anticorpo que reconhece e
se liga diretamente à proteína-alvo.
Anticorpo secundário: é um anticorpo que se liga ao
anticorpo primário. Ele geralmente é conjugado a
uma enzima (como peroxidase ou fosfatase alcalina)
que, quando ativada, pode produzir um sinal
detectável.
@KAUANYBIOMED
Imagine que você quer saber se uma célula produz uma proteína
específica, como uma proteína cancerígena. Você:
Extrai as proteínas da célula.
Realiza o Western blot para separar as proteínas e transferi-las
para uma membrana.
Incuba com um anticorpo que reconhece essa proteína
cancerígena.
Depois, você detecta o sinal e, se encontrar uma banda
correspondente ao tamanho esperado, significa que essa
proteína está presente na célula.
O Western blot é uma forma poderosa de
identificar e quantificar proteínas específicas em
uma amostra complexa, utilizando a separação
por gel, transferência para uma membrana, e a
detecção por anticorpos. Ele é amplamente
utilizado em pesquisas biomédicas, diagnóstico
de doenças, e estudos sobre a função das
proteínas.
Exemplo prático:
Resumo:
@KAUANYBIOMED_
O Southern blot foi desenvolvido por Edwin
Southern e é usado para detectar sequências
específicas de DNA em uma amostra. Vamos
explicar como ele funciona:
1. Preparação da amostra de DNA
O DNA da amostra é extraído e cortado em
pedaços menores usando enzimas de restrição,
que agem como "tesouras" cortando o DNA em
locais específicos.
O tamanho dos fragmentos de DNA depende de
onde as enzimas de restrição cortam.
Southern Blot (Detecção de DNA)
 O Southern blot e o Northern blot são
técnicas de biologia molecular que,
assim como o Western blot, servem para
detectar e analisar ácidos nucleicos,
mas cada um é usado para detectar
tipos diferentes de material genético
(DNA ou RNA). Vamos ver essas duas
técnicas de forma prática e didática:@KAUANYBIOMED_
Os fragmentos de DNA são carregados em um gel de agarose e
separados por tamanho através de uma eletroforese (um processo que
usa corrente elétrica para fazer os fragmentos de DNA migrarem
através do gel).
Os fragmentos menores se movem mais rapidamente, enquanto os
fragmentos maiores se movem mais devagar, separando-se por
tamanho.
2. Separação dos fragmentos de DNA
(Eletroforese em gel)
A membrana é incubada com uma sonda (uma pequena
sequência de DNA ou RNA complementar à sequência que
você está procurando). Essa sonda é marcada com uma
substância que pode ser detectada, como radioatividade ou
fluorescência.
A sonda se liga apenas aos fragmentos de DNA que têm a
sequência que você está procurando.
4. Hibridização com uma sonda
(Procurando pela sequência
específica)
@KAUANYBIOMED_
Depois da separação no gel, os fragmentos de DNA são transferidos
para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF. Essa transferência é
feita por capilaridade, onde o gel é colocado em contato com a
membrana e a solução de DNA sobe, transferindo os fragmentos de
DNA para a membrana.
3. Transferência para uma membrana (Blotting)
Após a hibridização, a membrana é lavada para remover a sonda
que não se ligou, e o sinal gerado pela sonda é detectado. Isso
indica a presença da sequência de DNA específica na amostra.
O sinal gerado permite visualizar os fragmentos de DNA que
contêm a sequência de interesse.
5. Detecção
Northern Blot (Detecção de RNA)
O Northern blot é semelhante ao Southern
blot, mas é usado para detectar RNA, não
DNA. O objetivo é identificar e estudar a
expressão de genes (quantidade de RNA
de um gene em uma amostra). Vamos
entender o processo:
@KAUANYBIOMED_
Após a separação, o RNA é transferido do
gel para uma membrana de nitrocelulose
ou PVDF, como no Southern blot.
3. Transferência para uma
membrana (Blotting)
A membrana é incubada com uma sonda que
é complementar à sequência de RNA que
você deseja detectar. Essa sonda pode ser
marcada com radiação ou fluorescência.
Assim como no Southern blot, a sonda se
liga apenas à sequência específica de RNA
de interesse.
4. Hibridização com uma
sonda (Procurando pela
sequência de RNA)
O RNA extraído é carregado em um gel de
agarose com formaldeído, que é usado para
manter o RNA em sua forma intacta 
(não degradada).
O RNA é separado no gel de acordo com seu
tamanho, da mesma forma que no Southern
blot, com os fragmentos menores migrando
mais rapidamente.
2. Separação do RNA
(Eletroforese em gel)
@KAUANYBIOMED_
O RNA é extraído da célula ou tecido
que você está estudando. No caso
do Northern blot, o RNA precisa ser
tratado de forma cuidadosa para
evitar que ele se degrade.
1. Preparação da
amostra de RNA
Southern blot: Detecta DNA.
Northern blot: Detecta RNA.
Ambos: Utilizam a técnica de transferência para
membrana, hibridização com sonda e detecção de
sinal para localizar sequências específicas.
Diferenças principais:
Após a hibridização, a membrana é lavada para remover a
sonda não ligada, e o sinal da sonda é detectado, indicando a
presença do RNA de interesse na amostra.
O sinal pode ser usado para identificar o tamanho e a
quantidade do RNA, ajudando a entender, por exemplo, se um
gene está sendo expresso em uma célula.
5. Detecção
@KAUANYBIOMED_
Southern blot: Você quer verificar se um gene específico está presente em
diferentes cepas de bactérias. Paraisso, você corta o DNA com enzimas de
restrição, separa por eletroforese, transfere para uma membrana, usa uma
sonda para detectar o gene de interesse e vê se ele está presente em todas
as cepas.
Exemplo prático:
@KAUANYBIOMED_
Northern blot: Você quer saber se um gene está sendo expresso em
células humanas sob diferentes condições. Você extraí o RNA dessas
células, separa por eletroforese, transfere para uma membrana e usa
uma sonda para ver se o RNA do gene está presente e em que
quantidade.
Resumindo:
Southern blot: Para detectar DNA específico.
Northern blot: Para detectar RNA específico e estudar a
expressão de genes.
Essas técnicas são essenciais para estudos genéticos, de
expressão gênica e análise de sequências específicas de DNA
ou RNA.
@KAUANYBIOMED_
@KAUANYBIOMED_
síntese de DNA in vivo
@KAUANYBIOMED_